=Toxicologia Aulas Praticas FONTOURA PUCP 2011

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PONTIFÍCIA UNIVERSIDADE CATÓLICA DO PARANÁ 
CENTRO DE CIÊNCIAS BIOLÓGICAS E DA SAÚDE 
CURSO DE FARMÁCIA 
TOXICOLOGIA 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
TOXICOLOGIA 
AULAS PRÁTICAS 
 
 
2011 – 2º Semestre 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Curitiba 
2011 
 
Toxicologia Prática 
 Prof. Sérgio Fontoura 
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ÍNDICE 
 Pág. 
Normas de Segurança no Laboratório de Toxicologia 03 
Análises Toxicológicas 04 
Perícia Toxicológica 05 
Ensaios Preliminares 05 
Determinação da Creatinina Urinária 12 
Curva de Calibração 13 
Mineralização 14 
Controle da Exposição Ocupacional ao Monóxido de Carbono – IBE: Carboxiemoglobina 15 
Controle da Exposição Ocupacional a Agentes Metemoglobinizantes – IBE: 
Metemoglobina 
17 
Controle da Exposição Ocupacional ao Fenol e Benzeno. IBE: Fenol Urinário 19 
Controle da Exposição Ocupacional ao Tolueno – IBE: Ácido Hipúrico Urinário 22 
Controle da Exposição Ocupacional ao Chumbo – IBE: δ Aminolevulínico Urinário (ALA-U) 24 
Controle da Exposição Ocupacional a Inseticidas Organofosforados e Carbamatos – IBE: 
Atividade da Butirilcolinesterase (BChE) 
 
27 
Dosagem Alcoólica 30 
Pesquisa Toxicológica do Diazepam 32 
Pesquisa Toxicológica do Fenobarbital 34 
Monitoramento Terapêutico 35 
Pesquisa Toxicológica de Nitratos e Nitritos 38 
Pesquisa de Metanol em Bebidas Alcoólicas 40 
Tratamento Básico do Intoxicado 42 
Cromatografia Gasosa 44 
Modelo de Relatório 47 
REFERÊNCIAS 48 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
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NORMAS DE SEGURANÇA NO LABORATÓRIO DE TOXICOLOGIA 
1. Indumentária Apropriada 
• Avental de mangas compridas, longos até os joelhos, com fios de algodão na composição 
do tecido. Não usar avental de nylon ou 100% de poliéster. 
• Calça comprida de tecido não inteiramente sintético, preferencialmente de algodão, grossa 
como um jeans. O uso de saia ou vestido, bermuda ou short são proibidos 
• Sapato fechado, de couro ou assemelhado. Portanto, o uso de sandália, chinelo, sapato 
aberto não serão permitidos. 
• Óculos de segurança. 
• Por medidas de segurança o uso de lentes de contato, braceletes, correntes ou outros 
adereços também não serão permitidos. 
• Luvas 
2. Como se comportar no laboratório 
• Certifique-se da localização do chuveiro de emergência, lava-olhos, e suas 
operacionalizações. 
• Conheça a localização e os tipos de extintores de incêndio no laboratório. 
• No laboratório é terminantemente proibido fumar, beber, comer 
• Brincadeiras que podem comprometer a segurança do aluno ou de seus colegas não serão 
toleradas. 
• As pessoas que usarem cabelos compridos, devem trabalhar com os mesmos presos. 
• É proibido trabalhar ou permanecer sozinho no laboratório. Na ausência do professor, os 
alunos não devem permanecer no interior do laboratório. 
• Quando precisar descartar alguma solução verifique a existência de um local apropriado 
para tal, NUNCA DESPREZE QUALQUER MATERIAL NA PIA . 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
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ANÁLISES TOXICOLÓGICAS 
 
 
1. INTRODUÇÃO 
Estas análises são requeridas sempre que se torna necessário esclarecer, confirmar ou 
prevenir uma intoxicação. São realizadas também no controle da terapia do intoxicado, 
fornecendo ao clínico o perfil de depuração em andamento. 
 
2. CARACTERÍSTICA FUNDAMENTAL 
O agente tóxico se encontra ligado a uma matriz bio lógica na ordem de traços . 
 
3. FINALIDADE 
A finalidade orienta o planejamento analítico. 
Análise toxicológica de urgência; controle da exposição ocupacional, monitoramento 
terapêutico, controle do uso de drogas; esclarecimento de intoxicação letal; dosagem alcoólica, 
exame anti-dopagem. 
 
4. AGENTE TÓXICO OU TOXICANTE 
É preciso saber, antes de se iniciar a análise, se esta deve ser direcionada apenas ao agente 
tóxico e/ou algum de seus produtos de biotransformação, ou ainda avaliar algum indicador 
bioquímico ou hematológico que aponte o efeito do toxicante no organismo. Assim, três 
classes configuram-se para a análise ou avaliação: 
� substância química in natura: paration 
� produtos da biotransformação: p-nitrofenol 
� parâmetros bioquímicos ou hematológicos: atividade da BChE ou AChE 
 Também se devem conhecer as características físico-químicas do agente tóxico: gases, 
compostos voláteis e fixos, substâncias orgânicas e inorgânicas. 
 
5. AMOSTRA 
Uma vez definida a finalidade da análise e a natureza da substância ou indicador que se 
pretende reconhecer ou quantificar, é necessário selecionar a amostra que melhor represente 
a biodisponibilidade, a excreção ou o efeito do toxicante no organismo. 
 
� esclarecimento de intoxicação letal � vísceras, sangue, urina, etc 
� análise toxicológica de urgência � sangue, urina, líquido de diálise, líquido de lavado 
gástrico, vômito, restos alimentares e de medicamentos 
� controle da exposição ocupacional � sangue, urina, cabelo* 
� controle do uso de drogas � urina, cabelo* 
� monitoramento terapêutico � sangue, urina, saliva** 
� controle de dopagem � urina, cabelo* 
* futuro; **algumas drogas são bem excretadas pela saliva 
Amostras alternativas 
� ar expirado 
� unha, cabelo 
� tecido adiposo 
� leite materno (animal não seria amostra alternativa) 
 
6. MÉTODO 
O método deverá ser exato, preciso e sensível. 
A análise toxicológica, qualquer que seja a finalidade, apresenta as fases: 
� separação 
� extração 
� identificação/quantificação 
Os métodos de extração/separação dependem da natureza da substância química a ser 
analisada: volátil, orgânica ou inorgânica. 
 
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PERÍCIA TOXICOLÓGICA 
 
1. INTRODUÇÃO 
Análises toxicológicas realizadas para fins legais: esclarecimento de intoxicações letais, 
controle de dopagem e dosagem alcoólica. Portanto, as análises podem ser realizadas em 
indivíduos vivos e/ou mortos. 
 
2. ESCLARECIMENTO DE INTOXICAÇÃO LETAL 
a) Necrópsia 
Coleta de material: o legista colhe o material de necrópsia: vísceras, sangue e urina. Em 
caso de exumação: ossos, unhas, cabelo 
 
ENSAIOS PRELIMINARES 
 
 Quando a substância tóxica envolvida com uma intoxicação for desconhecida, há a 
necessidade de realizar alguns ensaios para orientar a marcha analítica. 
 
1. PESQUISA DE METAIS 
a) Lâminas metálicas 
Fundamento: baseia-se no intercâmbio de cargas iônicas entre o material suspeito e a 
lâmina usada, de acordo com a série de potenciais elétricos dos diversos metais. 
ESCALA DE ELETRONEGATIVIDADE (DECRESCENTE): 
F(4,0) O(3,5) Cl N(3) Br(2,8) I S C(2,5) Au Pt Hg Cu P H(2,1) B As(2) Sb(1,9) 
Si Sn Pb Fe(1,8) Cr Zn (1,6) Mn Al Be(1,5) Mg(1,2) Ca Sr Li(1) Ba Na(0,9) K Rb(0,8) 
Cs(0,7) 
 
Técnica: serão usadas lâminas de Zn, Fe, Cu e Al bem polidas que são colocadas no 
material suspeito acidificado com HCl a 10%. Depois de um aquecimento moderado por 
até 60 minutos , retirar a lâmina e verificar a reação sofrida: 
 
Lâmina Alteração Sofrida Interpretação 
Zn Escurecimento Ag, Cu, Hg, Sb, Sn ou outro 
metal menos eletropositivo que 
o Zn 
Fe Avermelhamento Cu 
Cu Cobre-se por uma camada branco-acinzentada Ag ou Hg 
Cu Escurecimento As, Bi ou Sb 
Al Eflorescências brancas Hg 
 
Se a lamina de Cu apresentar um escurecimento, deve-se fazer o ensaio de Gutzeit para o 
reconhecimento do As: 
Transferir 2 a 5 ml do material suspeito para um tubo de ensaio e acidificar com gotas (2 
gotas/ml de amostra) de HCl concentrado. Cobrir o tubo com um pedaço de papel de filtro. 
Umedecer a cápsula de papel, bem no centro, com uma gota de solução de AgNO3 a 10%. 
Levantar a cápsula o suficiente para introduzir rapidamente 2 a 3 pastilhas de Zn. Observar 
o escurecimento do papel de filtro. 
Pergunta: Quais reações devem ter ocorrido para que haja o escurecimento do papel ? 
 
 
2. PESQUISA DE GASES OU VAPORES 
a) Papéis Reativos 
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A pesquisa de diversos compostos gasosos ou voláteis pode ser realizada atravésde 
papéis reativos. Os quais são preparados no próprio laboratório, tratando os papéis com 
soluções previamente preparadas. 
 
Exemplos de papéis reativos: 
Papel Reativo Cor após exposição Indicação 
Picrossódico* Vermelha HCN 
Cobre-guaiaco Azul (instantânea) HCN 
Acetato de chumbo Preta H2S 
Nitrato de prata Preta H2S, H3As 
Sulfato de cádmio Preta H2S 
Fluoresceína Vermelha Br2 
Hematoxilina violeta NH4OH 
*ácido pícrico a 1% (secar ao abrigo da luz) + carbonato de sódio a 10% 
 
Confirmação da presença de cianeto: ensaios colorimétricos para a demonstração da 
presença de cianeto numa amostra biológica: quando da suspeita de uma intoxicação por 
este tipo de composto. 
 
Observações: 
A) O CN- é biotransformado no organismo pela rodonase gerando SCN-. 
B) Após o óbito o CN- pode ser transformado em SCN- devido a putrefação. 
Assim, deve-se pensar que na amostra proveniente de uma intoxicação letal por cianeto o 
íon já não exista. 
 
3. PESQUISA DE COMPOSTOS VOLÁTEIS 
 
a) Amostra: sangue, vísceras, leite, lavado e conteúdo gástricos. Se a análise não for 
realizada de imediato, conservar a amostra em frasco hermeticamente fechado, sob 
refrigeração, sem o uso de conservantes químicos. 
b) Separação 
Destilação: 
1. Meio ácido � verificar o pH da amostra, se ácido alcalinizar com solução de 
NaOH a 10% e depois acidificar com ácido tartárico a 10%, se alcalina ou neutra, 
acidificar com ácido tartárico. Destilar aproximadamente 2/3 do volume inicial da 
amostra � D1. 
2. Meio alcalino � alcalinizar o material remanescente no balão com MgO até pH 
8,0. Destilado D2. 
c) Extração 
Extrair os destilados D1 e D2 com éter etílico, 2 ou 3 vezes. Evaporar o solvente. 
Retomar o resíduo com pequena quantidade de água e proceder aos ensaios de 
identificação. 
d) Identificação 
1. Destilado D1: verificar a presença de substâncias oxidáveis, hidrocarbonetos 
halogenados, benzeno, fenol e sulfeto de carbono. 
2. Destilado D2: pesquisar substâncias como a anilina e o paration. 
 
e) Técnica 
� Substâncias oxidáveis (álcoois, aldeídos, hidrocarbonetos não saturados e 
outras facilmente oxidáveis) 
Juntar em tubo de ensaio a 1 ml de D1 1 ml de H2SO4 conc., gotas de solução de 
K2Cr2O7 0,05 N; aquecer em banho de água. Aparecimento de cor verde indica 
reação positiva. 
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Qual o fundamento desta prova ? Apresente uma reaçã o química que poderia 
explicar este fundamento (por exemplo, supondo que a substância oxidável 
em questão seja o metanol). 
 
� Álcoois (metanol e álcool etílico) 
a) Metanol � A 1 ml de D1 juntar, em tubo de ensaio, 1 gota de KmnO4 a 5% e 1 
gota de solução de H3PO4 a 10%, aguardar 1 minuto e adicionar solução 
saturada de NaHSO3 gota a gota, até descorar o excesso de permanganato. 
Juntar, em seguida, 4 ml de solução de H2SO4 a 75%, uma pequena porção de 
ácido cromotrópico, aquecer em banho de água fervente por até 10 minutos. 
Observar o aparecimento de cor violeta. Este ensaio também dá positivo 
para o aldeído fórmico, 
Como você faria para diferenciar o metanol do aldeí do fórmico usando 
esta reação ? 
 
b) Etanol (reação de Lieben) 
A 1 ml de D1 juntar gotas de KOH a 10% e de solução iodo-iodetada, até cor 
amarela persistente. Aquecer e verificar o aparecimento de ppdo amarelo e/ou 
odor característico de iodofórmio. Este ensaio dá positivo também para a 
acetona. Para diferenciar, repetir a operação com solução de NH4OH em 
substituição ao KOH, neste caso a reação é positiva somente para a acetona. 
Qual a estrutura do iodofórmio ? 
 
4. SPOT TESTS PARA PESQUISA DE DROGAS E FÁRMACOS 
Fritz Feigl (1891 – 1971) foi o criador da Análise de Toque – Tüpfelreaktionen, em alemão; Spot 
Tests , em inglês – procedimento analítico para fins qualitativos, executado com técnica muito 
simples com o emprego de uma ou poucas gotas de amostra e reagentes, em geral sobre papel de 
filtro, em que se desenvolve uma coloração característica para a identificação da substância ou 
grupo químico . O resultado, para que possa indicar a sensibilidade da prova, ou seja, o valor 
mínimo detectável na menor concentração é expresso mediante o limite de identificação, em 
microgramas, acoplado ao limite de diluição. O teste é tanto mais sensível quanto menor o limite de 
identificação e maior o de diluição. 
Determinar a sensibilidade do método para barbitúri cos (fenobarbital), benzodiazepínicos 
(diazepam) e salicilatos (ácido salicílico) 
Fundamento: 
Salicilato + Fe+++ � complexo 
Fenobarbital + NaOH � p-hidróxi fenobarbital + KMnO4 � coloração verde 
Diazepam � formação de benzofenona por hidrólise ácida dando coloração amarela ao meio 
Técnica: 
b) Transferir para um funil de separação 5 ml de plasma (ou 20 ml de urina) 
c) Ajustar o pH entre 4,0 e 5,0 com solução de H2SO4 0,1 N 
d) Extrair duas vezes com o dobro do volume de clorofórmio-isopropanol (95:5), 
agitando por 2 minutos, esperar separar as fases 
e) Transferir a camada orgânica para um béquer, filtrando-a sobre Na2SO4 anidro 
f) Evaporar em banho de água (60ºC) até a secura e reservar � R1 
g) Transferir para um funil de separação 5 ml de plasma (ou 20 ml de urina) 
h) Ajustar o pH entre 9,0 e 10,0 com a solução de NaOH 1 N e extrair duas vezes com 
a mistura clorofórmio-éter (3:1) agitando por 2 minutos, esperar separar as fases 
i) Transferir a fase orgânica para um copo de béquer, filtrando-a sobre Na2SO4 anidro 
j) Adicionar 1 a 2 gotas de H2SO4 0,1 N e evaporar o solvente em banho de água 
(60ºC) até a secura e reservar � R2 
k) Ressuspender os resíduos com éter-clorofórmio (1:3) e executar as provas a seguir 
 
 Numa placa de toque contra um fundo branco, depositar 0,2 ml da amostra com 0,2 ml do reativo 
e observar aparecimento de cor característica. 
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1) Pesquisa de Fenobarbital 
Em um tubo de ensaio misturar 1 ml de NaOH 0,5 N com 1 ml da solução 0,5 N de 
KMnO4. Sobre a amostra depositar 0,2 ml deste reativo. Observar o aparecimento 
de coloração verde � amarelo-marrom 
 
2) Pesquisa de Benzodiazepínicos (Diazepam) 
Sobre a amostra depositar 0,2 ml do reativo de Marquis* e observar coloração 
amarela, esta reação não é específica, dando resultado positivo para qualquer 
benzodiazepínico 
 
3) Pesquisa de salicilatos (ácido salicílico) 
Depositar 0,2 ml da amostra e sobre esta 0,2 ml de cloreto férrico a 5% e observar 
o aparecimento de coloração violeta, compostos fenólicos dão a mesma reação. 
Faça um teste com o reativo de Marquis*. 
 
* Reativo de Marquis: 
Formaldeído a 40% ........................ 1 ml 
H2SO4 concentrado ........................20 ml 
Validade 30 dias 
 
Determinar a sensibilidade do método: 
Soluções padrão: 10 mg/ml 
Preparar diluições de 10 a 0,1 mg/ml 
Testar as diluições e determinar a sensibilidade do método 
Compare os seus resultados com os de MAREK e cols. (2004): 
Substância Concentração mg/ml 
 2 1 0,5 0,3 0,2 0,1 0,05 
Diazepam +++ +++ ++ ++ + + - 
Fenobarbital +++ +++ ++ ++ + + - 
Ácido salicílico ++ + + + - - - 
 
 
Outros resultados com o Reativo de Marquis 
Salicilatos � coloração avermelhada que desaparece com a adição de água 
Heroína, monoacetilmorfina, codeína e dionina � vermelho-cereja � violeta � azul 
Clorpromazina e prometazina � púrpura 
Levomepromazina � azul-avermelhado 
Anfetamina � laranja � marrom-esverdeado 
Desoxiefedrina � vermelho-alaranjado � marrom 
 
QUESTÕES: 
1) Levando em consideração a concentração tóxica de cada um dos fármacos e 
considerando uma amostra como sangue, o método tem uma boa sensibilidade ? 
Justifique a sua resposta. 
2) Levando em consideração a concentração letal de cada um dos fármacos e considerando 
uma amostra como sangue, o método tem uma boa sensibilidade ? Justifique a sua 
resposta. 
3) Levando em consideração a concentração terapêutica de cada um dos fármacos e 
considerando uma amostra como sangue, o método tem uma boa sensibilidade ? 
Justifique a sua resposta. 
4) Levando em consideraçãoagora uma amostra como urina, o método tem uma boa 
sensibilidade ? Justifique a sua resposta. 
 
 
 
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5. RECONHECIMENTO DE FÁRMACOS POR CCD - TRIAGEM 
 
 Também seria um ensaio preliminar, para a identificação de substâncias tóxicas 
desconhecidas. O resultado da CCD orientará a configuração do cromatógrafo a gás. A triagem 
também pode ser feita por ensaios imunológicos (imunofluorescência e ELISA) 
 
1. AMOSTRAS 
a) Sangue � soro, plasma, total 
b) Urina 
c) Outras 
 
2. ESQUEMA DA ANÁLISE 
SANGUE 
URINA 
 
 ½ ½ 
EXTRAÇÃO 
 
 
 EXTRATO EXTRATO 
 ÁCIDO ALCALINO 
 
 1/3 2/3 2/3 1/3 
 
 IDENTIFICAÇÃO 
 
 
 CROMATOGRAFIA CROMATOGRAFIA CROMATOGRAFIA 
 GASOSA EM CAMADA GASOSA 
 DELGADA 
 
3. TÉCNICA 
 
3.1 Extração 
Sangue � ± 10 ml urina � ± 40 ml 
 
Meio ácido � ½ do volume 
pH entre 4 e 5 com H2SO4 0,1 N 
solvente: clorofórmio – isopropanol (95:5) 
resíduo � R1 
 
Meio alcalino � ½ do volume 
pH entre 9 e 10 com NaOH 1 M 
solvente: clorofórmio – éter (3:1) 
resíduo � R2 
 
 
4. RECONHECIMENTO POR CCD 
 
a) Retomar R1 com gotas de éter – clorofórmio (1:3) e transferir para duas placas � C1 e C2 
b) Retomar R2 com gotas de éter – clorofórmio (1:3) e transferir para outras duas placas � 
C3 e C4 
c) Aplicar em cada placa 5 padrões ( 10 µg/ml) 
 
d) Fases móveis 
 
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Placas Fases Móveis 
C1 Clorofórmio – propanona (4:1) 
C2 Clorofórmio – propanona (9:1) 
C3 Metanol – NH4OH 25% (100:1,5) 
C4 Clorofórmio – metanol (9:1) 
 
e) Corrida: 10 cm 
f) Reveladores 
Placas Reveladores 
C1 FeCl3 a 5%
(A) � Dragendorff(B) 
C2 HgSO4 
(C) � Difenilcarbazona a 0,1% (D) 
C3 Bromocresol verde (E) � p-nitroanilina diazotada(F) 
C4 Dragendorff(B) � NaNO2 
(G) � Dragendorff(B) 
 
 
Preparo dos Reveladores 
a) Cloreto férrico a 5% em solução aquosa (FeCl3) 
b) Reativo de Dragendorff (DI) 
1) iodeto de potássio .................................. 12,0 g 
água destilada ........................................ 30,0 ml 
2) nitrato de bismuto ................................... 0,51 g 
ácido acético glacial ............................... 30 ml 
Misturar as soluções 1) e 2); completar o volume até 300 ml com ácido 
sulfúrico a 10%. Juntar à mistura 6g de iodo e agitar durante 30 minutos. 
 
c) Solução de sulfato de mercúrio (HgSO4) 
1) HgO solução a 5% ................................... 100 ml 
2) H2SO4 conc. ............................................. 20 ml 
Juntar cuidadosamente 2) em 1); resfriar e completar o volume para 250 ml 
com água destilada. 
d) Solução de difenilcarbazona a 0,1% em clorofórmio (DFC) 
Solução recente 
 
e) Solução de bromocresol verde (BCV) 
1) solução etanólica de BCV a 0,1% 
2) solução tampão-fosfato de potássio (pH 5,5) 
3) água destilada 
Misturar 1,2 e 3 na proporção 2:1:1 
 
f) p-nitroanilina diazotada (DC) 
1) p-nitroanilina a 1% em HCl 1N 
2) etanol 
3) solução de NaNO2 a 5% (conservar em geladeira) 
Misturar 1 e 2 (1:1); a solução é estável a 4ºC durante alguns meses; diazotar 
com 3 na proporção de 5:1. Depois de aproximadamente 3 min, nebulizar a 
cromatoplaca com o reativo, esperar cerca de 3 minutos e aplicar a solução de 
NaOH a 50%, que deve ser diluída (1:10) com etanol no momento do uso 
 
g) solução de NaNO2 a 1% em água (conservar em geladeira) (NaNO2) 
 
 
 
 
 
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1. Comportamento de algumas drogas de caráter ácido e neutro frente a duas sequências 
de reveladores: 
Droga Reveladores 
 FeCl3 DI HgSO4 DFC 
Ácido salicílico ++(vi) - - - 
Cafeína - ++(cs) - - 
Diazepam - +++(cs) - - 
Fenobarbital - - +++(br) +++(vi) 
 
2. Comportamento de algumas drogas de caráter básic o e neutro frente a duas sequências 
de reveladores: 
Droga Reveladores 
 BCV DC DI NaNO2 DI 
Cafeína - - ++++(cs) ++++(pr) ++++(cs) 
Diazepam - - ++++(cs) ++++(cn) ++++(al) 
Haloperidol ++(vi) ++(am) ++(cs) ++(cn) ++(al) 
Imipramina ++(vi) +++(cs) ++(al) +(cn) +(cs) 
 
3. Valores de hRf de algumas drogas de caráter ácido e neutro em duas fases móveis: 
 
Droga CLOROFÓRMIO - ACETONA 
 4 : 1 9 : 1 
Ácido salicílico 07 02 
Cafeína 34 24 
Diazepam 80 68 
Fenobarbital 56 41 
 
4. Valores de hRf de algumas drogas de caráter básico e neutro em duas fases móveis: 
 
Droga Reveladores 
 MetOH – NH4OH (100:1,5) HCCl3 – MetOH (9:1) 
Cafeína 75 88 
Diazepam 80 99 
Haloperidol 80 67 
Imipramina 50 35 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
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CREATININA URINÁRIA PARA AS PRÁTICAS DO FENOL URINÁ RIO, ÁCIDO DELTA 
AMINOLEVOLÍNICO URINÁRIO E DO ÁCIDO HIPÚRICO 
 
1) Princípio 
A creatinina reage com o ácido pícrico em meio alcalino, formando o picrato de creatinina 
que tem uma coloração amarelo avermelhada.. 
2) Reagentes 
 a) Ácido pícrico : 28 mmol/l 
 b) Hidróxido de sódio: 6 M 
 c) Solução padrão: 50 mg/dl 
 
3) Técnica 
 a) Procedimento 
 
Reagentes Tubos (ml) 
 Branco Padrão Teste 
H2O 2 ml 2 ml 2 ml 
Urina - - 20 µL 
Solução padrão - 20 µL - 
Ácido pícrico 0,5 ml 0,5 ml 0,5 ml 
Hidróxido de sódio 2 gts 2 gts 2 gts 
Misturar e deixar em repouso a temperatura ambiente por 10 minutos, ler as absorbâncias em 520 
nm 
 
 
 
 
4. Cálculos 
 Aa Onde: Cp = concentração do padrão 
Creatinina (mg/dl) = x Cp AP = absorbância do padrão 
 Ap Aa = absorbância da amostra 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
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CURVA DE CALIBRAÇÃO 
A maioria dos métodos analíticos está baseado em uma curva de calibração na qual uma 
quantidade medida y é representada em um gráfico como uma função de uma concentração x 
conhecida, de uma série de padrões. Quando se constrói a curva de calibração, nem sempre todos 
os pontos caem sobre a reta devido aos erros aleatórios no processo de medida. Então se deve 
ajustar “a melhor” reta que passa por esses pontos. Uma maneira comum de encontrar esta reta é 
através do método dos mínimos quadrados. 
 Assume-se que uma reta é um bom modelo para representar a relação entre a 
absorbância de uma amostra � y e sua concentração � x. A reta que procuramos é dada pela 
equação: 
 y = mx + b 
onde m é a inclinação da reta e b é o intercepto. A inclinação e o intercepto são chamados de 
parâmetros do modelo que nesse caso é uma reta. Assume-se também que qualquer desvio dos 
pontos individuais da reta resulta de erros na medida (da área do pico ou de leitura da 
absorbância) e que não há erros nos valores de x, isto é, as concentrações das soluções-padrão 
são conhecidas exatamente. 
 A linha gerada pelo método dos mínimos quadrados é aquela que minimiza a soma dos 
quadrados dos resíduos para todos os pontos. 
 xi e yi são as coordenadas dos dados individuais, N é o número de pares de dados usados 
na preparação da curva de calibração e x e y são os valores médios para as variáveis. 
 Inclinação da Reta m: 
 Σxi. yi - Σxi. Σyi 
 N 
 m = 
 Σ(xi - x)
2 
 
 O intercepto b: 
 b = y - mx 
 Para o cálculo de qualquer concentração a partir de absorbâncias determinadas 
experimentalmente: 
 C = A – b/m 
 C = concentração A = absorbância b = intercepto 
 m = inclinação da reta 
 
 Para facilitar os cálculos preencher a tabela abaixo com os dados necessários 
i Xi 
(concentração) 
Yi 
(absorbância) 
x i - x (x i - x)
2 x iyi 
01 
02 
03 
04 
05 
06 
Σ 
 
Obs.: Esta tabela será útil nas práticas onde a cur va de calibração for necessária 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
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MINERALIZAÇÃO 
 
1. INTRODUÇÃO 
Processo de separação de metais pesados do material biológico através da destruição da 
matéria orgânica. Após a absorção os metais se depositam nos tecidos ligados a proteínas (em 
geral em radicais sulfidrilas livres encontrados nos resíduos de cisteína), e deste modo não 
podem ser identificados. 
2. MÉTODOS 
a) Mineralização por via seca 
Calcinação: destruição da matéria orgânica através do calor (400 a 450º C) 
1. Calcinação Simples 
� colocar a amostra (15 g de vísceras, 100 ml de urina ou 20 ml de sangue) numa cápsula de 
porcelana e secar a 110º C em estufa. 
� transferir a amostra seca para mufla e aquecer gradualmente até 550º C, até a obtenção de 
cinzas brancas, plúmbeas ou avermelhadas. 
� resfriar e suspender as cinzas com solução de HNO3 a 10%, filtrar 
2. Calcinação Alcalina 
Indicada para uma maior concentração de amostra (vísceras). É adicionado um composto 
alcalino oxidante que agirá como catalisador (KNO3, por exemplo). 
Pelos processos de calcinação, simples ou alcalina, há perda total de As e Hg e parcial de Cd, 
Pb, Sn, Zn, Be, Sb e Tl Por quê ? 
b) Mineralização por via úmida 
As técnicas de mineralização por via úmida estão baseadas nas ações oxidante do HNO3 e 
desingraxante do H2SO4, podendo ser empregados catalisadores. 
� colocar a amostra (5 ml de sangue, 10 ml de urina ou 2 g de vísceras) em um erlenmeyer e 
juntar 10 ml de HNO3 e 2 ml de H2SO4. 
� aquecer em chapa elétrica adicionando novas porções de HNO3 sempre que haja 
escurecimento ou que apareçam vapores brancos (SO3). 
� continuar o aquecimento até a obtenção de um líquido amarelado, que não escureça após 
resfriamento (observar por 15 a 20 min.). 
� juntar 20 ml de água e aquecer à ebulição até reduzir o volume a aproximadamente 4 ml. 
Por este método há perda de Pb, Ca, Sr, Ba, Mg, Bi e Sb. Por quê ? 
 
c) Mineralização por cloro nascente 
Baseia-se na ação oxidante do Cl2: 
� direta: Hg2Cl2 + Cl2 � 2HgCl2 
� indireta: Cl2 + H2O � 2HCl + [O] 
Método de Brouardel-Ogier 
� colocar em um balão 5g de vísceras previamente homogeneizadas e adicionar 20% desta 
massa de KclO3 
� fazer passar uma corrente de Cl2 nascente até a obtenção de um líquido amarelo que não 
mais escureça após resfriamento. 
Por este método há perda de Ag, por quê ?. 
d) Extração 
Após a separação, qualquer que seja o método usado, os metais poderão ser extraídos com 
agentes quelantes ou solventes orgânicos. O Tl pode ser extraído com éter dietílico e o Pb e 
Hg, após a complexação, são bem extraídos com ditizona. 
 
 
 
 
 
 
 
 
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15
CONTROLE DA EXPOSIÇÃO AO MONÓXIDO DE CARBONO – INDI CADOR 
BIOLÓGICO DE EXPOSIÇÃO: CARBOXIEMOGLOBINA 
 
1. INTRODUÇÃO 
O monóxido de carbono é um gás incolor, inodoro e insípido gerado a partir da combustão 
incompleta do carbono, como ocorre em diversas indústrias, como as siderúrgicas. Há 
também exposição ocupacional em garagens e indústrias químicas. Nós também estamos 
expostos ao gás através da poluição atmosférica nas grandes cidades. 
O gás está presente na fumaça dos incêndios, a maior causa de morte nestes sinistros é a 
anóxia tecidual causada pelo excesso de carboxihemoglobina. 
O IBE do gás é a carboxihemoglobina (HbCO), uma vez que o CO é muito mais afim pela 
hemoglobina (Hb) do que o próprio oxigênio. (VER DEFINIÇÕES NAS NR-7 E NR-15)* 
 
2. TÉCNICA DE BEUTLER e WEST 
2.1 Fundamento 
Este método se baseia na capacidade do diotinito de sódio em reduzir a 
oxiemoglobina e a metemoglobina e a carboxiemoglobina ser resistente a esta 
redução, de modo que no sistema existirá uma mistura de dois pigmentos:a 
hemoglobina reduzida e a carboxiemoglobina, as absorbâncias serão 
determinadas a 420 e 432 nm 
 
2.2 Reagentes 
a) Tampão: KH2PO4/K2HPO4, 0,1 M, pH 6,85. Este tampão é estável 
indefenidamente se estocado sob refrigeração. 
b) Solução hemolizante (SH): tampão diluído 1:10 com água destilada ou 
deionizada, estável por 1 semana 
c) Solução de ditionito de sódio (SD): Ditionito de sódio 1,25 mg/ml em tampão, 
preparar imediatamente antes do uso. 
 
2.3 Procedimento 
a) Coleta da amostra: colete sangue venoso usando EDTA (1,5 mg/ml de sangue 
– vide página 14) ou heparina (15 unidades USP/ml de sangue). O sangue 
pode ser coletado em seringa ou através de vacuumtainner 
b) Hemólise: Em um tubo contendo 3ml da SH adicione 25 µL de sangue, cubra o 
tubo com parafilm e misture 2 ou 3 vezes por inversão 
c) Determinação da HbCO: após 5 minutos, pipete 0,2 ml do hemolisado 
passando para um tubo contendo 2,3 ml da solução SD, cubra o tubo com 
parafilm e misture gentilmente várias vezes por inversão. Deixe em repouso a 
temperatura ambiente por 10 minutos. Leia as absorbâncias a 420 e 432 nm 
contra um tubo contendo apenas a solução SD. 
 
2.4 Cálculos 
1 – (AR x F1) 
%HbCO = 
 AR(F2 – F1) – F3 + 1 
Onde: AR = razão A420/A432 
 F1, F2 e F3 são as absortividades molares da Hb e da HbCO. A absortividade 
molar de uma substância a um dado comprimento de onda é igual a absorbância (A) 
dividida pela concentração (C) em mol/L, i.e εW = A/C. Na realidade estas constantes 
são as taxas de duas absortividades molares (da hemoglobina reduzida e da HbCO), a 
concentração destas hemoglobinas não precisam ser levadas em consideração 
quando a Hb é completamente convertida na Hb reduzida ou na HbCO, estes fatores 
são então definidos pela razão entre dois valores de absorbância: F1 = A
Hb
432/A
Hb
420; F2 
= AHbCO432/A
Hb
420 e F3 = A
HbCO
420/A
Hb
420, estes valores podem ser determinados 
experimentalmente ou compilados da literatura: F1 = 1,3330; F2 = 0,4787 e F3 = 
1,9939. 
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16
Determinação experimental das absortividades molares: hemolise 50µL de sangue 
uma pessoa não fumante com 6 ml de SH. Com uma pipeta volumétrica adicione 2 mL 
deste hemolisado em 2 frascos volumétricos de 25 mL. Sature o conteúdo do frasco 1 
com CO por 30 minutos, e borbulhe ar comprimido no segundo por 2 horas expondo 
este frasco a luz de uma lâmpada de 60W (ajuda a dissociar a HbCO). Complete o 
volume dos frascos e leia as absorbâncias em 420 nm e em 432 nm. Calcule as 
absortividades como explicado acima. 
 
3. GERAÇÁO DE CO EM LABORATÓRIO 
Gotejar 340 ml de H2SO4 sobre 100g de formiato de sódio ou de cálcio ou ácido fórmico 
conc. com aquecimento. Purificar o gás pela passagem através de duas soluções: 
1= KOH + Na2S2O4 (1:2) 
2= CaCl2 (solução saturada) 
Preparo da solução de hidrossulfito de sódio 
Hidrossulfito de sódio anidro � 8,28 g 
Sol. aquosa de NaOH a 5% � 60 ml 
Relação entre o CO (ppm) ambiental e a taxa de HbCO (%) 
CO (ppm) HbCO 
(%) 
CO (ppm) HbCO 
(%) 
CO (ppm) HbCO 
(%) 
CO (ppm) HbCO 
(%) 
0 1 40 8 80 15 160 28 
5 1 45 9 90 17 170 29 
10 2 50 9 100 18 180 31 
15 3 55 10 110 20 190 33 
20 4 60 11 120 21 200 34 
25 5 65 12 130 23 210 36 
30 6 70 13 140 25 220 37 
35 7 75 13 150 26 250 41 
 
 
4. PERGUNTAS 
1. Que reações químicas ocorrem na geração do monóxido de carbono em laboratório ? 
2. Para que servem as soluções (1) e (2) descritas acima ? (não vale dizer para purificar 
o gás, o que elas retiram ? ) 
3. Em um ambiente a concentração de CO é de 0,01% e a do oxigênio é de 21%, 
sabendo-se que o CO é cerca de 210 vezes mais afim pela hemoglobina que o O2, 
após 1 hora de exposição qual a quantidade de HbCO esperada (em %) ? 
4. Considere o resultado da questão anterior como sendo a HbCO medida em um 
trabalhador exposto ao CO. Pergunta-se: trata-se de uma exposição muito grave ? 
5. Que volume de uma solução 0,33 M de EDTA tetrassódico você deve colocar em um 
frasco para a coleta de 5 ml de sangue ? Dados: H = 1 g/mol; C = 12 g/mol; N = 14 
g/mol; O = 16 g/mol e Na = 23 g/mol 
 
*As normas regulamentadoras NR’s 7 e 15 podem ser encontradas na integra em 
http://www3.dataprev.gov.br/SISLEX/paginas/05/mtb/7.htme 
http://www.normaslegais.com.br/legislacao/trabalhista/nr/nr15.htm respectivamente 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
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17
CONTROLE DA EXPOSIÇÃO OCUPACIONAL A AGENTES METEMOG LOBINIZANTES – 
INDICADOR BIOLÓGICO DE EXPOSIÇÃO: METEMOGLOBINA 
1. INTRODUÇÃO 
É um indicador biológico inespecífico de exposição a uma variedade de agentes químicos que 
a induzem e para as quais há variações de natureza toxicocinética e toxicodinâmica 
Substâncias metemoglobinizantes e alguns usos indus triais: 
Substâncias Produção de 
Anilina* Corantes, fármaco s, praguicidas, borracha 
Dimetilanilina Fibras de vidro, quimioterápicos antimicrobianos , vanilina, 
corantes 
Dinitrobenzenos Corantes, celulóides, explosivos 
Dinitrotolueno Munição, explosivos 
n-Metilamina Aceptor de ácidos em síntese 
Nitroanilinas Corantes, antioxidantes, medicamentos veterinários 
Nitrobenzeno Derivados da celulose, acetoaminofenol , essência 
Nitroclorobenzenos Corantes, borracha, praguicidas 
Nitrotolueno Borracha, corantes têxteis, praguicidas 
Óxido nítrico Ácido nítrico, presente em gases de solda 
Propilenoglicol-dinitrato Propelente de torpedos 
Toluidinas Borracha, praguicidas, fármacos , corantes 
Xilidinas Fármacos e corantes 
Anisidina Azocorantes e guaiacol 
Cicloexilamina Anticorrosivo em caldeiras, borracha, praguicidas 
2-nitropropano Tintas vinílicas, nitrocelulósicas, borracha clorada, adesivos 
Perclorilfluoreto Agente fluoretador em síntese 
Tetranitrometano Explosivo, aditivo do diesel 
Trinitrotolueno Explosivos 
*Cite ao menos dois fármacos que podem ser obtidos a partir da anilina 
 
2. METEMOGLOBINEMIAS 
a) Metemoglobinemia hereditária: relacionada a deficiências enzimáticas como por exemplo a 
NADH-cit b5-redutase; ou a defeitos na estrutura proteica da hemoglobina com substituições de 
aminoácidos resultando em hemoglobinas anormais, como por exemplo a Hb M 
b) Metemoglobinemia adquirida: é a forma mais frequente de metemoglobinemia na espécie 
humana, surgindo após a exposição a compostos químicos, frequentemente usados na 
indústria ou como agentes terapêuticos. Muitos destes compostos são capazes também de 
reduzir substâncias como o glutation e o ácido ascórbico, que normalmente protegem a 
hemoglobina contra a oxidação. 
Fármacos relacionados com metemoglobinemia 
Principal Indicação Fármaco 
Antimaláricos 
Anestésicos locais 
Primaquina 
Bupivacaína, Lidocaína, Prilocaína (crianças) 
 
A utilização de vegetais ricos em nitratos (espinafre, beterraba, rabanete e outras) no preparo 
de alimentos infantis, pode ser, também, responsável pela ocorrência de metemoglobinemia 
em crianças nos primeiros meses de vida. 
 
3. TÉCNICA 
3.1 Método de Hegesh et al (1970) 
a) Amostra 
A amostra é sangue heparinizado (ver prática HbCO). Quando a análise não for realizada dentro 
de 30 minutos, resfriar rapidamente (2º C) e conservar sob refrigeração no máximo até 24 horas. 
 
b) Preparo da amostra 
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18
Hemolisar o sangue (4,4 ml de água destilada para 1,6 ml de sangue); após 2 minutos, adicionar 
2,0 ml de tampão fosfato pH 7,2. 
c) Técnica 
� transferir a amostra de sangue já hemolisado e tamponado para um tubo de centrífuga; 
centrifugar a 2.000 rpm por 15 minutos 
� transferir o sobrenadante, com auxílio de pipeta de Pasteur, para um tubo de ensaio . Deste 
tubo, transferir de novo 2,4 ml para uma cubeta (I) e 0,2 ml para outra (II) contendo 2,2 ml do 
reativo ferricianeto-fosfato. 
� após um minuto efetuar a leitura das absorbâncias (AI e AII) em 632 nm, contra ar. 
� adicionar 80 µL de solução de cianeto neutralizada às duas cubetas; misturar e, após 1 minuto, 
efetuar novamente a leitura das absorbâncias (AIII e AIV) 
� calcular a metemoglobina, expressando-a em porcentagem de hemoglobina total, a partir da 
fórmula seguinte: 
 AI – AIII x 100 
 
 %MeteHb = 
 (AII – AIV) x 12 
 
 12 � fator de diluição 
Solução tampão fosfato 0,5 M - pH=7,2 misturar 7,0 mL de fosfato de sódio bi básico (Na2HPO4) 
0,5 M e 3,0 mL de fosfato monobásico de potássio (KH2PO4) 0,5 M, 
Solução de cianeto neutralizada : misturar 1 ml da solução de NaCN a 10% recentemente 
preparada com 0,9 ml da solução de ácido acético a 12% , esta solução é estável por até 6 horas. 
Solução de ferricianeto-fosfato : Misturar 0,2 ml de ferricianeto de potássio a 5% e 2,5 ml da 
solução tampão fosfato e completar com água destilada até 10 ml, esta solução é estável por até 
24 horas. Obs. A solução de ferricianeto de potássio deve ser guardada em frasco âmbar 
 
3.2 Método de Naoum et al (2004) 
a) Amostra 
A amostra é sangue coletado com EDTA (0,33 M). Colocar 1 gota da solução de EDTA em um 
tubo de ensaio com tampa de rosca e colocar 5 ml de sangue, homogeneizar bem por inversão 
(pelo menos 10 vezes) DELICADAMENTE. 
b) Reagentes 
Solução estoque de Tampão Fosfato M/15 
Na2HPO4.12H2O .............................. 9 g 
KH2PO4 ............................................ 5,7 g 
 
Solução trabalho de Tampão Fosfato , diluir o tampão estoque de modo a obter o tampão fosfato 
M/60 
 
Saponina 1% 
 
c) Técnica 
� Identificar dois tubos A e B. No tubo A colocar 50 µL de sangue total e adicionar 50 µL de 
saponina a 1%, agitar para ocorrer hemólise 
� Adicionar 3 mL do tampão fosfato M/60 e homogeneizar 
� No tubo B colocar 150 µL da mistura do tubo A e completar o volume para 1,5 mL com a 
solução tampão de trabalho 
� Calibrando o espectrofotômetro com a solução tampão de trabalho, determinar a absorbância 
do tubo A em 630 nm e do tubo B em 540 nm 
� Calcular a metemoglobina usando a fórmula abaixo: 
 
 A630 x 100 
% Hb = 
 A630 +(A540 x 10) 
4. INTERPRETAÇÃO 
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Procure na legislação o limite de tolerância e o IBMP do IBE usado para avaliação desta exposição 
Método de Hegesh et al (1970) : valor de referência até 2 % 
Método de Naoum et al (2004) : valor de referência 1,9 a 3,8% 
 
5. PERGUNTAS 
1. Numa indústria química, onde os trabalhadores expostos a compostos metemoglobinizantes, a 
taxa de metemoglobinemia média foi de 6%. Esta empresa sofrerá alguma sanção por parte da 
Delegacia Regional do Trabalho ? 
2. Por que as crianças de até 2 anos estão mais sujeitas a ação destes compostos ? 
3. Como é feito o tratamento de uma hipermetemoglobinemia, que substâncias são empregadas 
e como elas agem ? 
4. No caso de uma taxa letal de metemoglobinemia, qual a causa da morte ? Por quê ? 
 
 
CONTROLE DA EXPOSIÇÃO OCUPACIONAL AO FENOL E BENZEN O – INDICADOR 
BIOLÓGICO DE EXPOSIÇÃO: FENOL URINÁRIO 
1. INTRODUÇÃO 
FONTES DE EXPOSIÇÃO 
Indústria química � álcool anidro, estireno, poliestireno, nitrobenzeno, etc. 
Indústria petroquímica 
Siderúrgicas que utilizam carvão mineral 
A exposição crônica ao benzeno está relacionada com anemia aplástica 
 
BIOTRANSFORMAÇÃO DO BENZENO 
 1 2 3 
BENZENO BENZENO EPÓXIDO FENOL CATECOL 
 
 6 4 
 7 
 5 1,2,4 TRI OH BENZENO 
 
 QUINOL 
 9 
 
 8 
 CONJUGAÇÃO COM ÁC. 
 BENZENO GLICURÔNICO OU 
 DIIDRODIOL SULFATO 
 
 10 
p- BENZOQUINONA 
 
TRANS,TRANS MUCONICALDEÍDO ÁC. TRANS,TRANS MUCÔNICO (AttM) (para 
maiores detalhes sobre este bioindicador consultar a PORTARIA N.º34, DE 20 DE 
DEZEMBRO DE 2001 
 
Para se fazer as correlações dos resultados das análises de AttM-U com a concentração 
de benzeno no ar, deverãoser utilizados os valores de correlação abaixo, estabelecidos pelo DFG 
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20
(1996), com alteração dos resultados em mg/l para mg/g de creatinina, que foram feitas admitindo-
se uma concentração média de 1,2 grama de creatinina por litro de urina. 
 
 Correlação das concentrações de AttM-U com benzeno no ar, obtidas a partir dos valores 
estabelecidos pelo DFG (1996), corrigidos para grama/grama de creatinina (admitida concentração 
média de 1,2 grama de creatinina por litro de urina) 
Benzeno 
no Ar 
(ppm) 
Benzeno 
no Ar 
(mg/m3) 
Ac. t,t 
mucônico 
(urina) 
(mg/l) 
Ac. t,t 
mucônico 
(urina) 
(mg/grama 
creatinina) 
0,3 1,0 - - 
0,6 2,0 1,6 1,3 
0,9 3,0 - - 
1,0 3,3 2 1,6 
2 6,5 3 2,5 
4 13 5 4,2 
6 19,5 7 5,8 
 
DETERMINAÇÃO DO FENOL URINÁRIO 
Separação extração � destilação ácida por arraste de vapor 
 Solventes orgânicos 
Amostra � urina 
Excreção do fenol � forma de glicuronídeo 
T1/2 do fenol � 12 horas 
 
QUANTIFICAÇÃO 
a) Cromatografia Gasosa 
Extração separação � solventes orgânicos (éter dietílico) em meio ácido a quente 
 
b) Espectrofotometria 
 
2. AMOSTRA 
A amostra deve ser coletada ao término da jornada de trabalho, a densidade deve ser medida e a 
conservação é em geladeira (2 a 10ºC). 
 
3. TÉCNICA 
a) Transferir 10 ml da amostra de urina para o balão de destilação. Adicionar 4 ml da solução de 
H2SO4 a 50% (v/v) e lavar as paredes do balão com aproximadamente 5 ml de água destilada. 
Destilar até recolher um volume de 100 ml em proveta graduada (aparelho para destilação por 
arraste de vapor). 
b) No momento de continuar a análise, homogeneizar o destilado. Identificar 3 tubos e proceder 
de acordo com a tabela abaixo 
Reagente B (ml) P (ml) T (ml) 
H2O 2,0 - - 
Solução padrão de trabalho - 2,0 - 
Destilado - - 2,0 
Acetato de sódio a 50% 0,2 0,2 0,2 
p-nitroanilina diazotada 0,2 0,2 0,2 
APÓS EXATAMENTE 1 MINUTO 
Solução de carbonato de sódio a 20% 0,4 0,4 0,4 
H2O 1,2 1,2 1,2 
c) Após 3 minutos efetuar a leitura em 525 nm, usando como referência um branco de reativos. 
 
OBSERVAÇÕES: Leituras no espectrofotômetro: 
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21
1) Usar sempre 2 cubetas apenas, uma para leitura do branco e amostra e outra para as soluções-
padrão (partindo-se da solução de menor para a de maior concentração). 
2) Em casos especiais, quando for necessário, utilizar uma terceira cubeta para a leitura do branco 
3) Utilizar um pedaço de papel absorvente para limpar o lado externo da cubeta antes das leituras 
e outro para retirar o excesso de líquido de dentro da cubeta, entre uma leitura e outra. 
4) A curva de calibração será feita por uma das bancadas a partir de uma solução padrão estoque 
na concentração de 1 g/L (ver Curva de Calibração página 13) 
5) Expressar o resultado em mg de fenol por g de creatinina (ver na página 12 o procedimento para 
a determinação da creatinina urinária). 
 
4. PERGUNTAS 
1. Qual a concentração normal de fenol urinário que pode ser encontrada nas pessoas não 
expostas ocupacionalmente ? 
2. Explique como as pessoas não ocupacionalmente expostas podem apresentar fenol na urina. 
3. Qual o IBMP considerando a exposição ao fenol ? 
4. Por que o fenol deve ser expresso em mg/g creatinina ao invés de mg/L de urina ? 
5. Antes do ensaio a densidade de urina deve ser medida, que fatores podem alterar a densidade 
urinária ? Qual a faixa normal da densidade urinária ? 
6. Qual a função do ácido sulfúrico neste ensaio ? 
7. Observe a biotransformação do benzeno e identifique as reações 1 a 10,determinando em que 
frações hepáticas elas ocorrem e quais as enzimas as envolvidas. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
CONTROLE DA EXPOSIÇÃO OCUPACIONAL AO TOLUENO – INDI CADOR BIOLÓGICO DE 
EXPOSIÇÃO: ÁCIDO HIPÚRICO URINÁRIO 
1. INTRODUÇÃO 
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22
O tolueno é um líquido incolor, volátil (pressão de vapor a 25ºC = 28 mmHg e ponto de ebulição 
igual a 110,6ºC) muito pouco solúvel na água, solúvel em acetona e miscível com etanol, éter 
etílico, benzeno, etc. As principais fontes de exposição ocupacional ao tolueno decorrem do seu 
uso como solvente para óleos, borracha natural e sintética, resinas, carvão, piche, betume e 
acetilcelulose. É usado também como diluente para tintas e vernizes. Na indústria química é 
matéria prima para a síntese orgânica do cloreto de benzeno, sacarina, TNT, etc e largamente 
empregado na indústria gráfica. 
O tolueno puro apresenta traços de benzeno como impureza (< 0,01%) e o comercial, pode conter 
até 25% de benzeno. 
BIOTRANSFORMAÇÃO DO TOLUENO 
 1 2 3 4 
Tolueno Álcool benzílico benzaldeído ácido benzóico ácido hipúrico 
 
 6 7 8 5 
o-cresol m-cresol 
 
 p-cresol 
 benzoilglicuronídeo 
2. AMOSTRA 
A amostra é urina, coletada após o final do segundo dia de exposição, em frasco de polietileno de 
125 ml, o volume da amostra deve ser de 50 a 100 ml, pode ser empregado como conservante o 
timol (alguns cristais por frasco). Para fins de controle de qualidade, amostras de pré-exposição e 
de indivíduos não expostos podem ser analisadas. 
Se a amostra não for imediatamente analisada esta deve ser refrigerada durante algumas horas e 
em seguida congelada (- 20ºC). 
Os trabalhadores deverão ser instruídos a não consumir no dia da realização do exame alimentos 
que possam conter benzoato de sódio como conservante ou de medicamentos como a aspirina, 
pois podem produzir um falso positivo. 
 
 
3. TÉCNICA 
b) Preparar as cromatoplacas (sílica gel G ativadas a 110ºC por 60 min) de acordo 
com a padronização: 
 
 Bancada 
 A P1 P2 
 
 
 
 
 
 
c) Transferir para a cromatoplaca 10 µL de urina e alíquotas de 10 µL da solução 
padrão de ácido hipúrico em diferentes diluições (0,5 a 10 µg ). A solução padrão 
estoque de ácido hipúrico é preparada com metanol na concentração de 1 g/L . 
(qual a massa de ácido hipúrico em 10 µL da solução estoque ?) 
d) Desenvolver 10 cm com o sistema solvente (clorofórmio-acetona-ácido acético: 
40:10:5, que será preparado por uma das bancadas antes do in ício da aula ), 
retirar a placa da cuba e secá-la por 10 minutos a 120ºC. 
e) Revelar com a solução de p-dimetilaminobenzaldeído a 5% em anidrido acético e 
aquecer novamente a placa a 120ºC por 10 minutos. 
f) Esfriar a placa, raspar as zonas reveladas e transferir, com cuidado, uma a uma 
para tubos de centrífuga. 
g) Adicionar a cada um dos tubos, 3ml de acetato de etila, agitar e centrifugar. 
h) Retirar o sobrenadante passando para tubos de ensaio devidamente identificados, 
efetuar as absorbâncias no espectrofotômetro em 468 nm. 
10 
cm 
2 cm 
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23
i) Determinar a concentração do ácido hipúrico (Ch) através da curva de calibração 
(absorbância x concentração g/L), ver página 13: Curva de Calibração. 
j) Uma das bancadas deverá determinar a creatinina urinária (Cr) de acordo com a 
técnica descrita na página 12. 
k) CÁLCULOS: 
 Ch 
 Ácido hipúrico (g/g de creatinina) = ________Cr 
 
4. QUESTÕES 
1) Na biotransformação do ácido hipúrico vista acima, quanto a 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 e 8 quais as 
reações, as enzimas envolvidas e as frações hepáticas onde elas ocorrem. 
2) Na urina de pessoas não expostas ao tolueno é possível encontrarmos o ácido hipúrico ? 
3) Na urina de um trabalhador exposto ao hidrocarboneto foi encontrado o ácido hipúrico numa 
concentração de 3 g/g de creatinina. O indivíduo em questão estava muito exposto a substância ? 
Justifique a sua resposta. 
4) Por que a aspirina pode interferir com esta determinação ? 
5) Qual a função do acetato de etila nesta prática ? 
6) Existe outro método que não sofre interferência da aspirina, qual é este método ? 
7) Explique como o ácido hipúrico foi separado da matriz biológica nesta prática. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
CONTROLE DA EXPOSIÇÃO OCUPACIONAL AO CHUMBO - 
INDICADOR BIOLÓGICO DE EXPOSIÇÃO: ÁCIDO δδδδ- AMINOLEVULÍNICO URINÁRIO (ALA-U) 
1. INTRODUÇÃO 
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24
Mecanismo de Ação Tóxica do Chumbo sobre a Síntese de Hemoglobina 
 
 
2. AMOSTRA 
O ALA é estável em urina ácida (pH 1,0 a 5,0). Assim, se a análise não for realizada dentro de 
poucas horas, adicionar a amostra HCl ou ácido acético glacial, a fim de manter o pH adequado. 
Para urina de 24 horas, adicionar ácido em quantidade suficiente para se obter uma concentração 
final de 0,001 a 0,1 N. O ALA permanece estável por muitos meses quando a amostra é acidificada 
e conservada sob refrigeração ao abrigo da luz. Recomenda-se que logo após a coleta, o frasco 
seja envolto em papel alumínio. 
 
3. TÉCNICA (TOMOKUNI & OGATA) 
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25
3.1 Fundamento 
O ALA é condensado pelo acetoacetato de etila e o produto desta condensação é extraído com 
o acetato de etila. Este produto é colorimetricamente determinado tratando o extrato orgânico 
com o reativo de Ehrlich modificado. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
a) Colocar em cada um de 2 tubos (identificados como B e A) 1,0 ml de urina e 1,0 ml de tampão 
acetato (pH 4,6). Adicionar 0,2 ml de acetoacetato de etila somente ao tubo A e agitar por 5 
segundos. 
b) Manter os tubos em banho de água fervente durante 10 minutos. 
c) Esfriar e adicionar 3,0 ml de acetato de etila aos dois tubos; agitar manualmente, 50 vezes. 
d) Se necessário centrifugar a 2.000 rpm e transferir a camada orgânica (superior) para outros 
dois tubos de ensaio. 
e) Adicionar 2,0 ml do reativo de Ehrlich* modificado a cada tubo, e misturar. 
f) Após 10 minutos, determinar a absorbância (553 nm) do produto colorido formado, usando 
como referência o tubo sem acetoacetato de etila 
g) Calcular a concentração de ALA com auxílio de uma curva de calibração constituída a partir de 
diluições de 1 a 30 mg/l da solução estoque, tratados da mesma forma que a amostra de urina 
(ver Curva de Calibração na página 13). 
 
*Reativo de Ehrlich: dissolver 1 g de p-dimetilaminobenzaldeído em 30 ml de ácido acético glacial, 
adicionar 5 ml de ácido perclórico a 60%, 5 ml de água destilada e completar o volume até 50 ml 
com o ácido acético. Preparar o reativo no dia da utilização. 
 
 
 
4. CÁLCULOS 
A solução estoque de ALA é preparada dissolvendo-se 6,4 mg de cloridrato de ALA em água (50 
mg ALA/l) e completar o volume até 100 ml. Esta solução é estável por mais de 2 meses, quando 
COOH
CH2
CH2
C O
CH2 
NH2
 ALA
+ CH3 CH2 CH2 CH3O
C
O O
C
acetoacetato de etila
N
(CH 
2 COOH
R3
CH2 )(2
HOOC
R2
+N
CH3
CH3
CO
H
Ehrlich composto cíclico
H
CH3
CH 
CH 
NCN
R R
3HC
composto colorido
)
H
3
3
2 
 2
3
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26
guardada sob refrigeração. Faça uma curva de calibração fazendo diluições da solução padrão 
(concentrações entre 5 e 30 mg/L). 
CREATININA URINÁRIA – TRANSFORMAR CONCENTRAÇÃO DO A LA-U DE mg/L para mg/g 
CREATININA (vide técnica para determinação da creat inina urinária na página 12) 
 
 
 
5. PERGUNTAS 
1. Medindo-se a concentração de ALA-U você está avaliando uma exposição recente ou mais 
antiga ? 
2. Que parâmetro você poderia usar para avaliar uma exposição mais recente (avaliar a 
exposição de hoje por exemplo) ? Por quê ? 
3. Este parâmetro que você escolheu na questão anterior seria pesquisado na urina ou no 
sangue ? Por quê ? 
4. Que método (não descreva a técnica) ou equipamento você usaria para pesquisar este 
parâmetro (o mesmo da questão 2) ? 
5. Se você usar como amostra o cabelo para fazer o controle da exposição ocupacional ao Pb, 
como você poderia fazer para avaliar exposições em diferentes momentos (mais recentes e 
mais antigas) ? Justifique a sua resposta. 
6. Que volume de uma solução a 10% de HCl você deverá colocar no frasco para coleta de urina 
de 24 horas para que a concentração final do ácido esteja naquela faixa ótima (vide amostra) 
Dados: H= 1 g/mol e Cl= 35,5 g/mol 
7. A mesma questão anterior, se for usada uma solução de ácido acético a 5% ? Dados: H= 1 
g/mol; C = 12 g/mol; O = 16 g/mol 
8. Cite algumas indústrias existentes em Curitiba ou no Paraná onde os trabalhadores estejam 
expostos ao metal. 
9. Considerando uma intoxicação letal e que a amostra provenha de material de exumação, os 
ossos seriam uma boa amostra ? Justifique a sua resposta. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
CONTROLE DA EXPOSIÇÃO OCUPACIONAL A INSETICIDAS ORG ANOFOSFORADOS E 
CARBAMATOS – INDICADOR BIOLÓGICO DE EXPOSIÇÃO: 
 ATIVIDADE DA BUTIRILCOLINESTERASE (BChE) 
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27
1. INTRODUÇÃO 
A BChE (anteriormente conhecida como colinesterase do soro [ChE] ou pseudocolinesterase) 
é uma enzima produzida no fígado, cuja função fisiológica não foi ainda totalmente esclarecida. 
Ela é capaz de hidrolisar diversos ésteres, tais como: acetilcolina (ACh), butirilcolina (BCh), 
propionilcolina, ácido acetilsalicílico, succinilcolina, cocaína e outros compostos. 
A enzima é inibida por compostos organofosforados (OrgPO4) e carbamatos, assim a sua 
atividade pode servir de IBE para estes compostos 
Causas de atividade diminuída da BChE: 
Tipo Condição 
Deficiências 
hereditárias 
Variantes da BChE: alelos A (atípico), F (resistente ao fluoreto), S 
(silencioso) e outros 
Variação fisiológica Após a 10ª semana de gestação 
Recém natos e crianças 
Causas adquiridas Hepatopatias 
Infarto do miocárdio 
Doenças do colágeno (distrofia muscular, miotonia congênita e 
dermatomiosite) 
Hiperpirexia 
Tuberculose (Tb) 
Doenças infecciosas agudas 
Hipocalcemia 
Uremia 
Doenças renais crônicas 
Causas 
iatrogênicas 
INSETICIDAS ORGANOFOSFORADOS E CARBAMATOS 
Inibidores da MAO 
Terapia com estrogênios 
Propranolol 
Neostigmina 
Cloridrato de clorpromazina 
Circulação extracorpórea 
Por outro lado, a atividade aumentada é observada em situações associadas com o 
metabolismo anormal de lipídeos, tais como: hiperlipoproteinemias, obesidade, diabetes, 
síndrome nefrótica. Foi demonstrada correlação positiva entre a atividade enzimática e as 
concentrações de colesterol total e frações (LDL e VLDL) e de triglicerídeos. 
 
2. DETERMINAÇÃO DA ATIVIDADE ENZIMÁTICA 
2.1 Método 1 – Método de Dietz e cols. (1973) 
 
2.1.1 Princípio do método 
A BChE hidrolisa o substrato (propioniltiocolina), com a liberação de grupo sulfidrila livre ao nível 
da tiocolina: 
 O grupo SH livre reage com o reativo de cor (DTNB = ácido 5,5’-ditiobis [2-
nitrobenzóico]), levando a formação de um derivado de cor amarela, de absorção máxima 
em torno de 410 nm. Veja figura abaixo. 
 
2.1.2 Reagentes 
a) Substrato: propioniltiocolina (na forma de iodeto) � 45 µmol (liofilizado) 
b) Reagente de cor: DTNB � 0,423 M em tampão fosfato pH 7,6 
c) Solução inibidora: sulfato de quinidina a 0,5% 
d) Solução padrão: 20 µL que corresponde a 7 UI/ml 
 
 
2.1.3 Técnica 
Preparo da solução de substrato: Adicionar4,5 ml de água destilada ao frasco que contém o 
liofilizado. 
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28
Preparo da solução padrão: reconstituir a solução padrão com 3 ml de água destilada. 
 
Determinação da atividade da BChE 
 
REATIVO TUBO BRANCO (ml) TUBO TESTE (ml) 
Substrato 0,5 0,5 
 Reativo de Cor 1,5 1,5 
 Colocar em BM. por 3 minutos a 37º C 
 
Amostra - 0,01 
 Incubar a 37º C por exatamente 2 minutos e 30 se gundos 
 
Solução inibidora 1,5 1,5 
Amostra 0,01 - 
 
Homogeneizar e ler as absorbâncias do teste contra o branco a 410 nm. 
*A cor é estável por 15 minutos à temperatura entre 20 a 30º C. 
 
Determinação do Fator 
 
Reagente Branco Padrão 1 Padrão 2 Padrão 3 
Água destilada 2,0 ml 2,0 ml 2,0 ml 2,0 ml 
Solução padrão - 10 µL 10 µL 10 µL 
Reagente de cor 1,5 ml 1,5 ml 1,5 ml 1,5 ml 
Homogeneizar e ler as absorbâncias dos Pn em espectrofotômetro em 410 nm contra o B. 
 
Cálculos 7 
 Fator = 
 Absorbância média 
 
 Atividade U.I./ml = Abs da amostra x fator 
 
2.1.4 Interpretação 
 
Valores de referência: 
♂ 6,0 a 12,0 U.I./ml 
♀ 5,0 a 10,5 U.I./ml 
 
2.2 Método 2 – Método Wiener Lab (2000) 
2.2.1 Princípio 
Butiriltiocolina + H2O � tiocolina + butirato 
Tiocolina + DTNB � 2-nitro-5-mercaptobenzoato 
 
2.2.2 Reagentes 
Solução tampão � fosfato pH 7,7 (K2HPO4 + KH2PO4) 50 mM 
Substrato: iodeto de butiriltiocolina � 7 mM 
DTNB � 0,25 mM 
O substrato e o DTNB estão no mesmo frasco 
Amostra: soro ou plasma. Anticoagulantes que contém citrato, fluoreto ou oxalato 
produzem inibição leve. A amostra deve ser preferencialmente fresca, pode ser 
conservada até uma semana sob refrigeração (2 a 10ºC) sem conservantes. 
 
 
2.2.3 Técnica 
 1) Reconstituir o substrato com 3 ml do tampão fosfato, incubar por alguns minutos a 37ºC 
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29
 2) Adicionar 20µL da amostra, e imediatamente ler a absorbância (tempo 0), disparando 
simultaneamente o cronômetro 
 3) Ler as absorbâncias a cada 30 s até 90s 
 4) Determinar a diferença média da absorbância a cada 30 s (∆A), subtraindo cada leitura 
da anterior e fazendo a média dos valores, utilizar a média para os cálculos. 
 5) Cálculos: 
 UI/L = ∆A x 22.710 
 OBS: Se a temperatura empregada for de 37ºC, a amostra deverá ser diluída (1:5) 
2.2.4 Interpretação 
Valores de referência 
Crianças, homens e mulheres com mais de 40 anos de idade: 
5,5 a 13,4 UI/ml 
Mulheres entre 16 e 39 anos de idade, que não estejam grávidas nem 
tomando contraceptivos orais: 
4,4 a 11,7 UI/ml 
Mulheres entre 18 a 41 anos de idade, grávidas ou tomando contraceptivos 
orais: 
3,8 a 9,5 UI/ml 
3. PERGUNTAS 
 
1. Para preparar 4,5 ml do substrato (método 1) ou 3 ml do substrato (método 2), qual a 
massa necessária do mesmo ? 
2. Partindo-se do princípio que você deverá usar, para cumprir o que pede a questão 1, um 
sal do referido substrato, qual a massa do mesmo para que seja possível preparar a 
referida solução ? 
3. Para preparar 100 ml de DTNB na concentração prescrita no método 1, qual a massa 
necessária ?. E para o método 2 ? 
4. Qual o IBMP para este IBE, quando do controle a exposição ocupacional por 
anticolinesterásicos ? 
5. Você determinou a atividade de pré-exposição de um agricultor de 50 anos, cuja atividade 
foi inferior ao normal, você descobriu que o mesmo era hipertenso. Qual causa iatrogênica 
poderia estar envolvida com esta atividade mais baixa ? Justifique. 
6. Considere a mesma pergunta da questão anterior, mas desta vez considere que a pessoa 
envolvida seria uma mulher, 25 anos, casada. Quais as possíveis causas de atividade 
diminuída ? 
 Dados: C= 12 g/mol; N= 14 g/mol; O= 16 g/mol; S= 32 g/mol; H= 1 g/mol, Iodo = 127 
g/mol 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
DOSAGEM ALCOÓLICA 
 
1. INTRODUÇÃO 
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30
Exame realizado, para fins legais, pelo IML. Pode ser realizado: 
a) em vivos � acidentes automobilísticos em geral com vítimas ou quando o Detran é acionado, 
ou a pedido da Justiça. 
b) em mortos � esclarecimento da causa mortis ou dependendo das circunstâncias da morte, 
para esclarecer a influência do álcool nestes casos. 
Pode ser realizado por laboratórios de análises clínicas para fins de diagnóstico de intoxicações 
agudas, principalmente aquelas onde haja risco de morte. 
2. AMOSTRA 
a) Vivos � sangue, urina, saliva e ar expirado. A urina é empregada quando do exame anti-
doping, onde o álcool pode também ser pesquisado. A saliva é uma das vias de excreção e 
pode ser empregada para estudos toxicocinéticos. 
b) Mortos � estômago e conteúdo, cérebro, fígado, sangue e urina. 
 
3. SEPARAÇÃO 
Depositar em balão 5 ml da amostra (sangue com EDTA ou heparina – vide página 11). Para cada 
parte de sangue adicionar 2 partes de solução saturada de ácido pícrico (13:1.000) e 4 partes de 
água destilada. Destilar um volume igual a 4 vezes o volume inicial de sangue. 
 
4. DOSEAMENTO 
Técnica: óxido-redução 
Tomar 5 ml do destilado e juntar em erlenmeyer 5 ml de H2SO4 concentrado (com muito cuidado!!) 
Titular com uma solução de K2Cr2O7 a 19:1.000. 
Reação Negativa: com uma gota de bicromato de potássio a solução ficará amarela, adicionar 2 a 
3 gotas e observar cuidadosamente. 
Reação Positiva: com uma gota de bicromato de potássio a solução ficará azulada (azul bem claro, 
dá a impressão, quando a concentração de álcool é bem pequena, que a solução está incolor), 
deve-se titular, gota a gota, até a solução adquirir uma tonalidade verde. Anotar o volume gasto, 
deixar cair mais uma gota, se a solução tornar-se amarelada ( ou verde amarelada) há um excesso 
de bicromato. Se a coloração não mudar há ainda álcool para ser oxidado. 
 
5. CÁLCULOS 
1 ml de K2Cr2O7 19:1.000 oxida � 0,005 ml de álcool 
 20 ml de destilado correspondem a � 5 ml de sangue 
 5 ml de destilado correspondem a � x ml de sangue 
 3C2H5OH + 2K2Cr2O7 + 8H2SO4 3CH3COOH + 2Cr2(S04)3 + 2K2SO4 + 11 H20 
Então, se for gasto 1 ml de bicromato: 
x ml deve conter � 0,005 ml de etanol 
1.0 ml de sangue � y ml de etanol 
Então y= ml/l de sangue 
6. INTERPRETAÇÃO 
Até 2008 o CNT (Código Nacional de Trânsito) definia 6 dg/L como alcoolemia máxima permitida 
de ser encontrada em um condutor de veiculo automotor. 
 
7. CONCENTRAÇÃO DE ÁLCOOL ETÍLICO EM ALGUMAS BEBIDA S 
Bebida % 
Aguardente 46 a 60 
Cerveja 5 a 7 
Conhaque 40 a 60 
Uísque 45 a 58 
Vinho 12 a 16 
Vinho do Porto 18 a 22 
Vodca 45 a 65 
 
Toxicologia Prática 
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31
 
 
8. PERGUNTAS 
1. Qual a quantidade máxima de álcool pode ser encontrada no sangue de um motorista, de 
acordo com a legislação em vigor ? 
2. Qual a quantidade máxima de cada uma das bebidas acima poderia ser ingerida por um 
indivíduo antes de dirigir ? (ao menos para não sofrer as sanções da lei) [Dica: a alcoolemia 
corresponde a ± ¼ da quantidade de álcool presente no organismo, os ¾ restantes devem 
estar no fígado, no cérebro e em outros tecidos, para facilitar imagine um homem de 70kg que 
tem ± 5 L de sangue, e a concentração de álcool nas bebidas é % (v/v)] 
3. Hoje se faz a dosagem alcoólica fazendo cromatografia gasosa e a separação é feita através 
de um processo chamado “head space”. O que vem a ser este processo ? 
4. Se você beber a mesma quantidade de álcool na forma de cerveja, em duas situações 
diferentes: uma com o estômago vazio e a outra com estômago cheio, em qual situação a 
alcoolemia deverá ser maior ? Por quê? 
5. Considere agora outras duas situações onde você ingere a mesma quantidade de álcool com 
estômago cheio. Na primeira você ingere vodca e na segunda cerveja, em qual situação a 
alcoolemia deverá ser maior ? Por quê ?PESQUISA TOXICOLÓGICA DO DIAZEPAM 
 
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32
1. INTRODUÇÃO 
O diazepam é uma droga que age sobre o SNC, dependendo da dose ela pode agir como 
ansiolítico, sedativo ou hipnótico. Ao contrário dos barbitúricos, os benzodiazepínicos são 
drogas seguras, são raros os casos de morte devido a intoxicação aguda por estes compostos. 
Os acidentes envolvem principalmente crianças. 
A dose letal para um adulto é de aproximadamente 1.000x a sua dose hipnótica, a do 
fenobarbital (barbitúrico) a dose letal é algo em torno de 100x a sua dose hipnótica. Quando do 
emprego de álcool a dose letal pode ser menor. 
 
2. AMOSTRA 
Sangue � seringa heparinizada (ver prática HbCO – página 10 ) 
Leite � bomba de vidro manual 
 
3. SEPARAÇÃO/EXTRAÇÃO 
a) Transferir 2 ml da amostra para funil de separação contendo 10 ml da solução tampão (1 M 
de H3BO3 – KCl – Na2CO3 – pH 9,0) e extrair com duas porções de éter etílico (agitar 
vigorosamente por 2 minutos) 
b) Reunir os extratos em erlenmeyer com tampa esmerilhada e adicionar 5 ml de HCl 2 N, 
passar para funil de separação e agitar por 2 minutos e desprezar a camada etérea. 
c) Adicionar 5 ml da solução de NaOH 2 N à fase aquosa e extrair duas vezes (agitar por 2 
minutos) com 2,5 ml de éter etílico. Filtrar o extrato etéreo através de sulfato de sódio 
anidro para copo de béquer e evaporar o solvente até a secura, em B.M. a 50º C. 
d) Retomar o resíduo com 0,4 ml de n-hexano-acetona (8:2) e aplicar na cromatoplaca já 
devidamente preparada e identificada. 
e) Fazer a mesma coisa para o padrão (20 mg/ml ) 
f) Correr 10 cm usando a fase móvel existente na bancada, a cuba já deve ter sido saturada 
por pelo menos 30 minutos. 
g) Revelar com o reativo de Draggendorff: aparecimento de manchas castanhas 
 
OBS.: 
1) Monitoramento terapêutico � técnica de separação/extração é a mesma, porém a técnica de 
identificação e quantificação é a da cromatografia gasosa, neste caso é usado um padrão 
interno, o qual deverá ser um benzodiazepínico. 
2) O diazepan liga-se a proteínas plasmáticas, 98% se encontra na fração ligada. 
 
4. PERGUNTAS 
 
Biotransformação do diazepam 
 1 2 
DIAZEPAM TEMAZEPAM OXAZEPAM 
 
 3 4 5 
 
 
NORDIAZEPAM GLICURONÍDEO 
 
 REABSORÇÃO 
 
 BILE 
 
 HIDRÓLISE INTESTINO 
 
 
 
1. O diazepam seria um composto de caráter ácido, básico ou neutro ? 
2. O diazepam seria bem excretado pela via mamária ? Justifique a sua resposta. 
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33
3. Quais as funções do tampão pH 9,0, do HCl e do NaOH nesta prática ? 
4. Na biotransformação do diazepam acima, quais são as reações 1, 2, 3, 4 e 5 ? Que 
enzimas estão envolvidas e em que frações hepáticas elas ocorrem ? 
5. Qual o mecanismo de ação de um fármaco como o diazepam ? E do fenobarbital ? E do 
álcool ? 
 
 
5. CONCENTRAÇÕES PLASMÁTICAS E SIGNIFICADO 
 
Concentração Plasmática (mg/L) Significado 
0,5 a 2,25 Concentração terapêutica 
5,0 a 20,0 Concentração tóxica 
> 50 Concentração letal 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
PESQUISA TOXICOLÓGICA DO FENOBARBITAL 
1. INTRODUÇÃO 
Toxicologia Prática 
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34
Os barbitúricos são substâncias muito tóxicas em altas doses e podem causar 
vasodilatação periférica, hipotensão, hipotermia, coma, convulsões e insuficiência renal 
aguda. A morte normalmente ocorre após complicações cardiorrespiratórias ou 
respiratórias. 
Concentrações plasmáticas de barbitúricos maiores que 10 mg/l (50 mg/l para o 
fenobarbital) pode estar associada com intoxicações graves. Doses repetidas de carvão 
ativado e/ou diurese alcalina pode ser útil na terapia de intoxicações por estes compostos. 
Hemoperfusão com carvão ativado também pode ser usada na terapia de intoxicações por 
barbitúricos de ação curta e intermediária. As tentativas de suicido em geral há o 
envolvimento também do etanol. 
 
2. AMOSTRAS 
Para o monitoramento terapêutico a amostra empregada é soro ou plasma. Para análise 
toxicológica de urgência a mesma amostra pode ser empregada, além do uso de lavado 
gástrico. No caso de intoxicações letais as amostras usadas são: vísceras, sangue, urina e 
conteúdo gástrico. 
 
3. TÉCNICA 
a) Transferir 5 ml da amostra para um funil de separação e ajustar o pH entre 6 a 7,5 
com solução de HCl 0,5N ou de NaOH 0,45N. 
b) Adicionar 25 ml de clorofórmio, agitar vigorosamente por 3 minutos e deixar o 
sistema em repouso até decantar bem a fase clorofórmica. 
c) Separar a camada clorofórmica, filtrar através de papel-filtro e receber numa 
proveta graduada, anotar o volume para posterior correção. 
d) Transferir o extrato clorofórmico para o funil (limpo) e adicionar 5 ml da solução de 
NaOH 0,45N. Agitar por 3 minutos e decantar . Tomar cuidado para recuperar o 
máximo possível da camada aquosa. 
e) Transferir 2 ml da fase alcalina para duas cubetas (A e B). Adicionar em seguida 1 
ml da solução de NaOH 0,45N a uma das cubetas (A) e 1 ml da solução de NH4Cl 
a 16% à outra (B). 
f) Efetuar a leitura da absorbância, em 260 nm, usando a cubeta A contra a B, para 
obter a densidade ótica da amostra (Aa). 
g) Tratar da mesma maneira que a amostra, volume igual da solução padrão de 
fenobarbital (50 µg/ml) e efetuar a leitura da absorbância do padrão (Ap). 
 
 
4. QUESTÕES 
1. Que cálculos você deverá fazer para calcular a concentração da droga na amostra ? 
2. Se a leitura da Aa fosse 0,75 e da Ap fosse 0,25, qual seria a concentração da droga 
na amostra analisada ? Seria um caso de intoxicação ? Por quê ? 
3. O leite materno poderia ser empregado como amostra para a pesquisa do 
fenobarbital ? 
4. Qual o mecanismo de ação tóxica do fenobarbital ? 
5. Que tipo de interação medicamentosa ocorre entre o fenobarbital e o álcool etílico ? 
Justifique a sua resposta em termos farmacodinâmicos. 
 
. CONCENTRAÇÕES PLASMÁTICAS E SIGNIFICADO 
 
Concentração Plasmática (mg/L) Significado 
15 a 30 Concentração terapêutica 
65 a 135 Concentração tóxica 
> 100 Concentração letal 
 
MONITORAMENTO TERAPÊUTICO 
Associação clínico x laboratório 
Concentração plasmática � dedução da ½ vida biológica 
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35
Estudo farmacocinético � curva de excreção 
Análise dos fatores que alteram a relação dose/resposta: 
Como o exame é feito � separação/extração � concentração � cromatografia gasosa � 
concentração plasmática 
1. Regimes posológicos inadequados: dose/frequência 
Ajuste individual da dose em função da ½ vida biológica da droga 
Ex.: fenitoína 
½ vida Frequência Consequência 
24 horas 1/24 horas - 
6 horas 1/24 horas Efeito subterapêutico 
48 horas 1/24 horas Intoxicação 
 
2. Alterações Farmacocinéticas 
a) Absorção 
� biodisponibilidade farmacocinética � ≠ na formulação (forma farmacêutica 
� interações medicamentosas � anti-ácidos, metoclopramida 
� fatores genéticos � falta de um transportador ativo 
 
b) Distribuição 
1. Proteínas plasmáticas 
Básicas � α 1 glicoproteína ácida 
Ácidas � albumina 
 
1.1 Concentração da Droga 
 
Ex. A.A.S 
Uso [ ] Plasmática (mg%) % Ligada 
Analgésico 5 a 20 80 a 95 
Anti -inflamatório 15 a 30 50 
 
 
1.2 Concentração de Proteína Plasmática 
 
Albumina (g/ dl) Digitoxina Ligada (%) Fenitoína Ligada (%) 
4,0 97 90 
3,0 75 85 
2,0 50 80 
1,0 25 82 
0,5 15 50 
0,1 10 15 
 
 
1.3 Condições Fisiopatológicas 
 
Hiperurecemia � drogas ácidas terão um competidor endógeno 
Síndrome nefrótica � albuminúria 
Drogas ácidas � concentração livre é _____________________ 
 concentração total é _____________________ 
 
1.4 Interações Medicamentosas 
Competição pelos mesmos sítios na proteína plasmática 
 
 
FENITOÍNA + AAS DESLOCA AUMENTO DA 
 A FRAÇÃOLIVRE 
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 FENITOÍNA 
 OU 
 
 
 
 
 AUMENTO DA EFEITO 
 BIOTRANSFORMAÇÃO TÓXICO 
 E EXCREÇÃO 
 
 
 
 
 EFEITO 
 SUBTERAPÊUTICO 
 
 
 
1.5 Efeito do pH Sanguíneo 
Ex. Teofilina 
Ligação a proteína plasmática � independente da [ ] � relação direta com o pH: 
⇑ pH � ⇓ ligação 
 
1.6 Idade 
RN � [ ] plasmática livre é 1,2 a 2,4 vezes > adulto 
 
⇓ ALBUMINA ⇑ BILIRRUBINA ⇓ ÁC. GLICURÔNICO 
 
 
 
 
 ⇓ EXCREÇÃO NA FORMA 
 ⇑ DA [ ] LIVRE CONJUGA 
c) Biotransformação 
1. Fatores genéticos 
Ex. Acetilases 
 
 
2. Cinética dose dependente 
 
 
 
3. Interações medicamentosas 
Indutoras � fenobarbital 
Inibidoras � imipramina, codeína, etc 
Cinética Dose Dependente
0
0,2
0,4
0,6
0,8
1
1,2
1,4
1,6
1,8
1 3 5 7 9 11 13 15 17 19 21 23 25
Dose
m
m
ol
/s
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4. Produtos da biotransformação farmacologicamente ativos 
Primidona � fenobarbital 
Carbamazepina � carbamazepina epóxido 
Codeína � morfina 
Diazepan � oxazepan 
5. Idade 
 
IDADE VELOCIDADE DE BIOTRANSFORMAÇÃO 
RECÉM NATO ⇓⇓⇓⇓⇓⇓⇓⇓ 
CRIANÇA ⇑⇑⇑⇑⇑⇑⇑⇑⇑⇑⇑⇑ 
ADULTO ⇑⇑⇑⇑ 
IDOSO ⇓⇓⇓⇓⇓⇓⇓⇓ 
 
6. Condições Fisiopatológicas 
Hepatopatias, cardiopatias 
 
 
d) Excreção 
Nefropatias 
Hepatopatias 
Cardiopatias 
 
 
DROGAS MONITORADAS 
 
Drogas com baixo índice terapêutico ou que possam, durante a terapia, modificar o 
regime posológico: Lítio, digitálicos; barbitúricos, benzodiazepínicos, anticonvulsivantes 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
PESQUISA TOXICOLÓGICA DE NITRATOS E NITRITOS 
 
1. INTRODUÇÃO 
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38
A adição de nitratos e nitritos em alguns produtos alimentícios é uma prática comum em 
muitos países. Sua utilização em embutidos, além de produzir a cor e o aroma característicos 
evita o crescimento do Clostridium botulinum. 
No Brasil é amplo o uso de nitrito como conservante antibacteriano em linguiças a despeito da 
possibilidade de o nitrito reagir com aminas e formar compostos N-nitrosos carcinogênicos. 
Os nitratos, no alimento podem ser convertidos a nitritos, além disso, crianças menores de 2 
anos são mais susceptíveis a ação metemoglobinizante destes compostos. 
A legislação brasileira permite o uso de nitratos e nitritos, aceitando como limite máximo para 
NO3
-, associado ou não ao nitrito, 500 ppm. Quando o nitrito é usado isoladamente o limite 
máximo é de 200 ppm. A OMS recomenda o máximo de 150 ppm. 
Os nitratos tal como o de sódio, além de serem usados como conservantes alimentares, são 
encontrados em fertilizantes inorgânicos, são empregados como antissépticos, além de serem 
empregados na indústria de explosivos. A morte de um adulto pode ser possível com a 
ingestão de aproximadamente 15 g do sal sódico ou potássico. Os nitratos no trato 
gastrointestinal são convertidos em nitritos. 
Os nitritos, como o de sódio, já foram empregados na terapia da HAS e angina, atualmente, 
são usados para a prevenção da ferrugem, na indústria de explosivos e é claro, como 
conservantes alimentares. A dose letal do sal sódico é de aproximadamente 10 g (já foram 
relatados casos fatais com a ingestão de 2 g ou menos). 
A pesquisa toxicológica destes compostos pode ser realizada em alimentos (controle de 
qualidade ou fiscalização) ou em material biológico (conteúdo gástrico, resíduos alimentares, 
urina, etc.). 
. 
2. TESTE QUALITATIVO 
Este teste pode ser utilizado para a identificação tanto de nitratos, nitritos, bromatos, cloratos, 
hipocloritos e iodatos. É aplicável para o conteúdo gástrico e resíduos alimentares, mas não 
serve para o controle de qualidade ou fiscalização. 
a) Filtrar, se necessário, 5 ml do conteúdo gástrico em um tubo de ensaio 
b) Tomar 0,5 ml deste filtrado e passar para outro tubo 
c) Adicionar com cuidado, pelas laterais do tubo, 0,5 ml da solução de difenilamina (10 g/L) 
em ácido sulfúrico concentrado. 
d) Há a formação de uma camada sobre a amostra, se esta adquirir uma tonalidade azul, a 
prova é positiva. 
 
3. TESTE CONFIRMATÓRIO 
3.1 Reativos 
a) Ácido sulfâmico � 1 ml de sulfamato de amônio (150g/L) e 1 ml de uma solução 
de HCl 2 N recém preparada 
b) Imipramina � 20 g/L 
3.2 Nitratos 
a) Misture 0,5 ml da amostra com 0,5 ml de ácido sulfâmico 
b) Adicione 0,5 ml da solução de imipramina , e cuidadosamente adicione 1 ml de ácido 
sulfúrico concentrado 
c) O aparecimento de uma cor azul intensa, confirma a presença do nitrato. 
 
3.3 Nitritos 
a) a 0,5 ml da solução de imipramina (20 g/L), adicione 0,5 ml da amostra e 1 ml de HCl 
concentrado 
b) o aparecimento de uma cor azul indica prova positiva 
 
 
 
 
4. ENSAIO QUANTITATIVO – NITRITOS 
Este ensaio pode ser aplicado a uma amostra como a urina. 
4.1 Reagentes 
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39
l) Acetato de sódio em solução aquosa � 164 g/L 
m) Ácido sulfanílico � 6 g/L em 1 parte de HCl concentrado e 4 partes de água 
n) 1-aminonaftaleno � 4,8 g/L em 1 parte de HCl concentrado e 4 partes de metanol 
 
4.2 Técnica 
a) Em um frasco volumétrico de 50 ml misture 1 ml da amostra (ou do padrão) com igual 
volume de ácido sulfanílico . Deixe em repouso por 10 minutos. 
b) Em seguida, adicionar 1 ml da solução de 1-aminonaftaleno e 1 ml da solução de acetato 
de sódio e complete o volume até 50 ml com água destilada 
c) Deixe em repouso por 10 minutos e meça a absorbância a 510 nm contra um branco de 
reativos (substitua a amostra por água destilada) 
d) A concentração do padrão é de 10 mg/l de nitrito preparada com nitrito de sódio 
 
5. PERGUNTAS 
 
1. Chegando ao laboratório uma amostra para a pesquisa de nitrato, por que o ensaio deve ser 
prontamente realizado ? 
2. Que massa de nitrito de sódio você deverá medir para preparar 50 ml de uma solução padrão 
na concentração de 10 mg/l de nitrito (íon) ? 
3. Que cálculos você deve fazer para determinar a concentração do íon na amostra testada pela 
sua bancada ? 
4. Se um adulto ingerir a dose tóxica de NaNO2, qual a causa do óbito ? Justifique a sua 
resposta. 
5. Considere uma intoxicação simultânea com NaNO2 e NaCN, neste caso haverá 
potencialização, sinergismo, efeito aditivo ou algum tipo de antagonismo ? Justifique a sua 
resposta. 
6. Haverá alguma diferença na terapia se a intoxicação for por nitrato ou nitrito ? Justifique a 
sua resposta. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
PESQUISA DE METANOL EM BEBIDAS ALCOÓLICAS 
 
 
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1. Introdução 
O metanol é um álcool tóxico para mamíferos e é extensivamente usado como solvente, na 
síntese de ácido e do aldeído fórmico, como combustível, como aditivo de combustível 
para aviação e outros empregos. A ingestão acidental resulta em grave intoxicação devido 
ao acúmulo dos seus produtos tóxicos de biotransformação: o formaldeído e o ácido 
fórmico. A intoxicação aguda usualmente causa cefaléia, vertigem, fadiga, náusea, vômito, 
visão borrada, cegueira e mesmo morte. A dose letal de metanol para o homem este entre 
340 µg a 1 mg/kg de peso corporal. 
Como este álcool é muito barato e acessível ele tem sido usado na produção de bebidas 
falsificadas (destiladas e vinhos), e ocorreram mortes e/ou cegueira em muitas pessoas na 
China, Brasil, San Salvador, Índia e Taiwan. 
O metanol é formado também pelo metabolismo da pectina (polissacarídeo ramificado 
constituído principalmente de ácido galacturônico, é um dos principais constituintes da 
parede celular vegetal, como a cana-de-açúcar). 
 
 
A produção de alguns medicamentos fitoterápicos usa o metanol como solvente e podem 
existir resíduos deste álcool nestes produtos 
2. Método 
Método do colorimétrico do ácido cromotrópico 
2.1 Fundamento 
O metanol é oxidado a metanal no destilado da amostra diluída a 5% 
(v/v) em etanol, através do KMnO4 em meio fosfórico. O metanal é 
dosado espectrofotometricamente (570 nm) devido a coloração