Relatório de Microbiologia

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UNIVERSIDADE FEDERAL DO PARANÁ 
ENGENHARIA AMBIENTAL E SANITÁRIA 
MICROBIOLOGIA AMBIENTAL 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
ALAN D’OLIVEIRA CORREA 
 
 
 
 
 
 
Relatório das aulas práticas - Microbiologia Ambiental 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Pontal do Paraná, 28 de Setembro de 2018. 
 
 
 
 
 
 
 
 
Relatório das aulas práticas - Microbiologia Ambiental 
 
 
 
 
 
Relatório das aulas práticas da disciplina de 
microbiologia ambiental na Universidade 
Federal do Paraná como parte das exigências 
de avaliação na disciplina de Microbiologia 
ambiental do curso de engenharia ambiental e 
sanitária . Orientadora: Hedda Elisabeth Kolm. 
 
 
 
 
 
 
 
Pontal do Paraná, 28 de Setembro de 2018 
Preparação dos meios de cultura 4 
1.1 Introdução 4 
1.2 Materiais e métodos 4 
2. Inoculação das amostras de água 5 
2.1 Introdução 5 
2.2 Materiais e métodos 6 
3. Contagem das colônias de bactérias e fungos 6 
3.1 Introdução 6 
4. Coloração de Gram 7 
4.1 Introdução 7 
5. Contagem e identificação dos coliformes 10 
5.1. Introdução 10 
5.2. Materiais e métodos 10 
5.3. Identificação dos Coliformes Totais e Escherichia coli 11 
6. Referências 12 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
1. Preparação dos meios de cultura 
1.1 Introdução 
Para iniciarmos às aulas práticas preparamos dois meios de cultivo, os das bactérias e 
dos fungos. Na intenção de estudarmos os meios de culturas, foram utilizados métodos 
distintos de cultivação, para as bactérias foi usado o método Marine Agar ZoBell 2216E, e o 
método Agar Sabouraud para os fungos. Portanto, o objetivo desta aula foi preparar os meios 
de cultura, para que nas próximas aulas fosse possível dar continuidade nos estudos. 
1.2 Materiais e métodos 
Foram utilizados os seguintes materiais no processo de cultivo do Marine Agar Zobell 2216E: 
● 0,25 Extrato de levedura; 
● 1,25 g de Peptona de carne; 
● 0,0025 g de Fosfato de ferro III; 
● 3,75 g de Agar; 
● 250 ml de Água; 
● Autoclave; 
● Micropipeta; 
● Balança digital de precisão. 
 
Já os materiais utilizados no método do Agar Sabouraud, foram: 
● 2,5 g de Peptona de carne; 
● 10 g de Dextrose; 
● 3,75 g de Agar; 
● 250 ml de água destilada; 
● Frasco Erlenmeyer; 
● Autoclave; 
● Micropipeta; 
● Balança digital de precisão. 
Pode-se perceber a utilização de Dextrose no meio de cultivo Agar Sabouraud, pois, 
sua presença favorece o crescimentos dos fungos, não apresentando o mesmo resultado no 
meio Zobell. 
Antes dos procedimentos, todas as vidrarias e equipamentos utilizados foram 
autoclavados à uma temperatura constante de 120ºC, na pressão de 1 atm, por cerca de 20 
minutos, para que não houvesse contaminação e alteração dos resultados obtidos. 
Na adição do fosfato de ferro no meio de cultivo da Marine, foi necessário realizar um 
cálculo para retirar a quantidade de amostra suficiente, pesando 1 g para 100 ml de água, 
desta forma, com a utilização da micropipeta foi retirado 0,25 ml da diluição da amostra, 
sendo possível ajustar a quantidade desejada da concentração de início para esta substância. 
Desta forma, após a separação dos ingredientes em suas respectivas quantidades e 
concentrações, utilizando a balança de precisão devidamente tarada após cada pesagem, foram 
então, incluídos no tubo Erlenmeyer, para que houvesse à homogeneização das substâncias, 
posteriormente, verificou-se o pH das diluições. 
No meio de cultivo das bactérias o ideal é que o pH esteja em torno de 75/7,6 e no 
cultivo de fungos, em torno de 5,6, caso o pH ultrapasse ou esteja abaixo do ideal é necessário 
que haja o ajuste, desta forma, caso o pH estivesse mais ácido utiliza-se o hidróxido de sódio 
para diminuir suas acidez, e caso encontra-se mais básico, coloca-se o ácido cítrico à fim de 
aumentar sua acidez. 
Contudo, após os procedimentos de preparação do meio de cultivo tanto para os 
fungos tanto quanto para as bactérias, ambos foram levados para a máquina de autoclavagem 
para que houvesse a esterilização. 
2. Inoculação das amostras de água 
2.1 Introdução 
Com o objetivo de observar o crescimento e quantificar experimentalmente fungos e 
bactérias da região de estudo, inseriu-se em cada meio de cultura amostras de água e de 
sedimentos, os quais foram coletados pelos alunos da disciplina. 
A amostra d’água foram coletadas dos seguintes pontos: Gamboa (nos fundos do 
Centro de Estudos do Mar), porto de Paranaguá, porto de cima em Guaraqueçaba e ponta da 
bica de Antonina, essas amostras foram utilizadas por diferentes alunos em seus meios de 
cultura. Para definir o tipo de amostra que seria utilizada, analisou-se à probabilidade de 
conter fungos e bactérias dentre as possibilidades das amostras coletadas para análise. 
2.2 Materiais e métodos 
● Materiais utilizados para a aula prática: 
● Amostras de águas; 
● Ponteira de plástico; 
● Placa de petri; 
● Lamparina; 
● Micropipeta; 
● Alça drigalski; 
 
Mediu-se também à salinidade da água utilizada, com um equipamento específico 
chamado (Refratômetro), é preciso zera-lo utilizando água destilada, após a calibragem 
deve-se secar o equipamento com cuidado evitando riscar, utilizando um papel bem macio, 
após esse procedimento, derrame a amostra no visor e visualise à salinidade da amostra 
d’água examinada na base do equipamento. 
Com a micropipeta esterilizada, mediu-se 200 ​μl​, conteúdo que foi colocado sobre o 
meio de cultura Agar Sabouraud, realizando o nivelamento da amostra na placa de petri foi 
realizado com a alça de drigalski esterilizada. Repetiu-se o processo com a água da amostra 
utilizada de Guaraqueçaba, utilizando dessa vez, o meio de cultura Marine Agar Zobell. 
3. Contagem das colônias de bactérias e fungos 
3.1 Introdução 
Após a inoculação das amostras, foi possível observar os meios de cultura 
identificando os fungos na sua placa de petri e as bactérias no seu meio de cultivo, era 
perceptível a diferenciação do tamanho e de suas estruturas. Podia-se observar às estruturas à 
olho nú, porém em uma análise mais minuciosa utilizando uma lupa, é possível verificar a 
presença de diversas estruturas que são imperceptíveis a olho nú. 
Contudo, o objetivo foi de quantificar quantas bactérias e fungos haviam nas placas de 
petri, e após a contagem dos meios foi obtidos os seguintes resultados: 467 bactérias e, dentre 
os fungos, 51 leveduras e 11 fungos filamentosos, como representados na Fig.1. 
 
Figura 1 - Gráfico da quantificação dos microrganismos. 
 
Fonte: O autor. 
4. Coloração de Gram 
4.1 Introdução 
A coloração de Gram é um método de coloração de bactérias, desenvolvido pelo 
médico dinamarquês Hans Christian Joachim Gram, este procedimento se baseia no 
tratamento sucessivo de um esfregaço bacteriano, fixado pelo calor. 
Esta técnica permite a separação de amostras bacterianas em Gram-positivas (roxas) e 
Gram-negativas (rosas), morfologia e do tamanho das amostras analisadas, sendo um dos 
métodos mais utilizados em laboratórios microbiológicos.4.2 Materiais e Métodos 
Foram utilizados os seguintes materiais para o procedimento de fixação do método de 
Gram: 
● Lâminas; 
● Lâminas riscadas (auxiliar); 
● Cultura de bactérias em meio de cultura Marine Agar ZoBell 2216E; 
● Lamparinas; 
● Alça de platina; 
● Álcool 92%; 
● Grampo; 
● Água corrente; 
● Corante violeta de genciana; 
● Lugol; 
● Fucsina; 
● Microscópio ótico. 
 
A equipe do laboratório, deixou pronta três amostras de fungos, para que fossem 
observados, sendo elas, a levedura do pão (​Saccharomyces cerevisiae) ​(Fig. 2.1), conhecido 
como fermento Fleischmann, fungos septados (Fig. 2.2) e fungos não septados (Fig. 2.3), 
representados na Figura 2. Nestas observações foi possível diferenciar os diferentes tipos de 
fungos, pelo seu tamanho e diferenças estruturais. 
 
Figura 2 - Fungos observados no laboratório de microbiologia. 
 
Fonte: O autor. 
 
 
Na elaboração da lâmina de bactérias, utilizou-se uma lâmina para depositar a colônia 
de bactérias, sendo retiradas da placa de petri. Para sua remoção foi utilizado uma alça de 
platina à qual precisou passar por um processo de esterilização simples, passando sua 
extremidade na chama por alguns segundos, após esse procedimento espera-se esfriar um 
pouco para remover a colônia de bactérias, após a captação da colônia é necessário esfregar às 
bactérias na lâmina, o qual deve ser feito sempre em apenas uma direção para que não haja a 
retirada do material da lâmina já depositado, para haver a fixação das bactérias na lâmina é 
necessário esquenta-la. 
Após os procedimentos de fixação, inicia-se a técnica de Gram, sendo que às 
substâncias utilizadas nesta técnica devem ser espalhadas por toda a área da lâmina para que 
haja à fixação em toda sua extensão. 
Primeiramente se aplica o corante violeta genciana, o qual deve permanecer por um 
minuto reagindo com à colônia, após seu tempo de reação lava-se com água corrente da 
torneira. Em seguida utilize o Lugol para fixar o corante nas bactérias, após um minuto jogue 
água para retirar o excesso, após a lavagem aplique o álcool 92% e deixe-o agir por trinta 
segundos dessa forma ele irá remover o violeta das bactérias Gram-negativas, deixando só às 
Gram-positivas com a coloração violeta, lave-o e, aplique à Fucsina por 60 s, para que haja a 
fixação de sua coloração nas bactérias Gram-negativas, e lave-a com água corrente,podendo 
então examiná-las no microscópio ótico. 
Portanto, após o processo da coloração de Gram, foi possível visualizar as bactérias 
nas lâminas, utilizado um microscópio ótico com aumento de 400x. Observando às lâminas 
foi possível verificar a grande variação no tamanho entre as bactérias e os fungos, ilustrado na 
Fig. 3. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Figura 3 - Ilustração da diferença entre bactérias (Fig. 3.1) e fungos (Fig. 3.2), observada no laboratório de 
microbiologia. 
 
Fonte: O autor. 
5. Contagem e identificação dos coliformes 
5.1. Introdução 
O método de Colilert possibilita identificar coliformes totais na água e ​Escherichia 
coli, através da utilização de uma câmara escura equipada com luz ultravioleta (UV), processo 
no qual é utilizado uma cartela especial que contém 49 espaços maiores e 48 pequenos, o qual 
será utilizado para comportar a amostra d’água a ser examinada. Contudo, o objetivo desta 
aula é observar e quantificar a presença de microrganismos na amostra escolhida. 
5.2. Materiais e métodos 
Materiais utilizados: 
● 70 mL de água destilada; 
● 30 mL de água da Gamboa; 
● Proveta; 
● Frasco Erlenmeyer; 
● Cartelas de 97 cavidades Quanti-Tray (IDEXX); 
● IDEXX Quanti-Tray/2000 MPN Table; 
● Seladora pelo sistema Quanti-Tray; 
● Câmara escura com luz UV; 
● Substrato Cromogênico Colilert. 
 
A amostra utilizada neste procedimento foi a água da Gamboa, esta amostra foi diluída 
em água destilada por que às chances de encontrar os coliformes já são altas, então o 
percentual de diluição utilizado foi de 30% água da Gamboa e 70% água destilada, após a 
diluição elas foram misturadas no frasco de Erlenmeyer, onde foi introduzido o substrato 
Cromogênico, havendo assim a homogeneização das substâncias. Após este processo, a 
diluição foi colocada na cartela, sendo selada logo em seguida, no equipamento de seladora. 
5.3. Identificação dos Coliformes Totais e ​Escherichia coli 
O procedimento de quantificação dos coliformes funciona da seguinte maneira, 
deve-se contar quantos espaços maiores estão amarelos e soma-los, depois faça o mesmo com 
os espaços pequenos, desta forma, os resultados obtidos foram 49 (grandes) x 22 (pequenos) 
obtidos examinando a cartela sem a utilização da câmara de luz UV. 
Porém, quando examinados com a luz UV os resultados podem mudar, pois a luz 
mostrou à presença de mais 9 espaços que continham Coliformes Totais. Sendo observados 
14 espaços pequenos que possuíam a ​Escherichia coli​, pode-se concluir se houver a presença 
de ​E. coli​, existirá Coliformes Totais. 
Portanto, o resultado obtido para a presença de Coliformes Totais foram de 49 x 31, 
que após examinado na tabela e sido elaborado a regra de três, apresentou o seguinte resultado 
de 2163 nmp. Enquanto que para a ​E. coli verificou-se à seguinte proporção 49 x 14, 
representando o seguinte resultado de 827 nmp. 
Referente a resolução do CONAMA 274/2000, os índices obtidos para os Coliformes 
Totais e da ​Escherichia coli​, ultrapassaram os limites adequados de balneabilidade. Portanto, 
considerando que a saúde e o bem-estar humano podem ser afetados pelas condições de 
balneabilidade, deve-se evitar o contato com o local estudado. 
 6. Referências 
CONSELHO NACIONAL DE MEIO AMBIENTE – CONAMA. ​Resolução n° 274/2000​​. Brasília, 
2000. Disponível em: . Acesso em: 06 dez. 2018.