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Capítulo (1).pdf Capítulo (2).pdf Capítulo (3).pdf Capítulo (4).pdf Capítulo (5).pdf Capítulo (6).pdf Capítulo (7).pdf Capítulo (8).pdf Capítulo (9).pdf Capítulo (10).pdf FIGURAS e TABELAS.pdf Capítulo 1 Introdução Espécies ameaçadas geralmente declinam devido à perda de habitat, sobre-exploração, introdução de espécies e poluição. Além disso, em populações de tamanhos pequenos fatores estocásticos (demográfi cos, ambientais, genéticos e catastrófi cos) aumentam o seu risco de extinção. A genética da conservação é o uso da teoria e técnicas genéticas para reduzir os riscos de extinção em espécies ameaçadas. Termos Biodiversidade, biorecursos, catástrofes, estocasticidade demográfi ca, ecoserviços, em perigo, estocasticidade ambiental, potencial evolutivo, vórtex de extinção, forense, diversidade genética, deriva genética, estocasticidade genética, endogamia, depressão endogâmica, expurgo, especiação, estocástico, ameaçado, vulnerável Seleção de espécies ameaçadas: Sentido horário: panda (China), uma orquídea Australiana, cacatua de palmeira (Austrália), tuatara (Nova Zelândia), sapo fl echa venenoso (América do Sul), peixe pulmonado (Austrália), pinheiro Wollemi (Austrália) e borboleta- de-cauda-de-andorinha da Córsega. INTRODUÇÃO2 A sexta “extinção” Biodiversidade é a variedade de ecossistemas, espécies, populações dentro de espécies, e diversidade genética entre e dentro dessas popu- lações. A diversidade biológica do planeta está sendo rapidamente re- duzida como conseqüência direta e indireta das atividades humanas. Embora não conhecido, um grande número de espécies já foi extinto, enquanto muitas outras têm tamanhos populacionais reduzidos que as colocam em risco. Muitas espécies atualmente necessitam da inter- venção humana para assegurar sua sobrevivência. A escala do problema é enorme e tem sido chamada de a “sexta extinção”, uma vez que sua magnitude se compara as outras cinco ex- tinções em massa reveladas por registros geológicos. Extinção é uma parte natural do processo evolutivo, no qual as espécies tipicamente persistem por aproximadamente 5-10 milhões de anos. Quando as ex- tinções são balanceadas pela origem de novas espécies (especiação), a biodiversidade é mantida. Extinções em massa, tais como os cata- clismos cósmicos que eliminaram muito da fl ora e fauna no fi nal do Cretáceo, a 65 milhões de anos atrás, são diferentes. Foram necessários muitos milhões de anos para a proliferação de mamíferos e plantas an- giospermas para substituir os dinossauros e as plantas gimnospermas existentes anteriormente. A sexta extinção é igualmente dramática. As espécies estão sendo perdidas em taxas que ultrapassam a origem de novas espécies e, diferente das extinções em massa anteriores, esta é principalmente devido às atividades humanas. A genética da conservação, assim como todas as disciplinas que compõem a biologia da conservação, é motivada pela necessidade de reduzir as taxas atuais de extinção e preservar a biodiversidade. Por que preservar a biodiversidade? Os humanos obtêm muitos benefícios diretos e indiretos do mundo vivo. Assim, temos interesse em conservar a biodiversidade pelos re- cursos que usamos, pelos ecoserviços que ela nos proporciona, pelo prazer que nos dá os organismos vivos, e por questões éticas. Os biorecursos incluem todos os nossos alimentos, muitas drogas farmacêuticas, fi bras naturais, borracha, madeira, etc. Seu valor é de muitos bilhões de dólares anuais. Por exemplo, cerca de 25% de todas as prescrições farmacêuticas nos Estados Unidos contêm ingredientes ativos derivados de plantas. Além disso, o mundo natural contém mui- tos recursos novos potencialmente úteis. Formigas sintetizam novos antibióticos que estão sendo investigados para a medicina humana, a seda das aranhas é mais forte, proporcionalmente ao peso, do que o aço, e pode proporcionar a base para o desenvolvimento de fi bras leves de alta elasticidade, etc. Ecoserviços são funções biológicas essenciais que benefi ciam as pes- soas, cedidas sem nenhum custo pelos organismos vivos. Os exemplos incluem a produção do oxigênio pelas plantas, o controle do clima pelas fl orestas, o ciclo dos nutrientes, a purifi cação da água, o controle natural das pestes, e a polinização de plantas cultivadas. Em 1997, A diversidade biológica do planeta está sendo rapidamente exaurida como conseqüência das ações humanas Quatro justifi cativas para a manutenção da biodiversidade são: valor econômico dos biorecursos; ecoserviços; valor estético; e direitos de vida dos organismos ESPÉCIES EM PERIGO E EXTINTAS 3 Tabela 1.1 | Extinções registradas, de 1600 até o presente, para espécies distribuídas em continentes e ilhas de todo o mundo Taxa Total Porcentagem de taxa extintas Porcentagem de extinções em ilhas Mamíferos 85 2,1 60 Aves 113 1,3 81 Répteis 21 0,3 91 Anfíbios 2 0,05 0 Peixes 23 0,1 4 Invertebrados 98 0,01 49 Plantas com fl ores 384 0,2 36 Fonte: Primack (2002). estes serviços foram avaliados em U$ 33 trilhões (1012) por ano, quase o dobro dos U$ 18 trilhões anuais do produto nacional global. Muitos humanos desfrutam do prazer oferecido (valor estético) pelos organismos vivos, expresso no cultivo de plantas ornamentais, na manutenção de animais de estimação, nas visitas aos zoológicos, no ecoturismo e no acompanhamento de documentários sobre a vida selvagem. Isso se traduz em valor econômico direto. Por exemplo, es- tima-se que os coalas contribuam com US$ 750 milhões anuais para a indústria de turismo Australiana. As justifi cativas éticas para a conservação da biodiversidade são simplesmente que nossa espécie não tem o direito de levar outras espécies à extinção, o que se compara ao horror do genocídio entre populações humanas. Espécies em perigo e extintas Extinções registradas As extinções registradas desde 1600 para diferentes grupos de ani- mais e plantas, em ilhas e continentes, são dados na Tabela 1.1. Em- bora mais de 700 extinções tenham sido registradas até o presente, a proporção de espécies que se extinguiram é pequena, represen- tando apenas 1-2% nos mamíferos e aves. Entretanto o padrão das extinções é preocupante, uma vez que as taxas de extinção têm, no geral, aumentado com o tempo (Fig. 1.1) e muitas espécies estão ago- ra ameaçadas. Além disso, muitas extinções devem ter ocorrido sem terem sido registradas. A perda de habitat pode ter resultado na extinção de muitas espécies não descritas, especialmente de inver- tebrados, plantas e microorganismos. Provavelmente pouquíssimas espécies novas devem ter evoluído para substituir aquelas perdidas nesse intervalo de tempo. A maioria das extinções registradas, e uma proporção signifi cativa das espécies atualmente ameaçadas, estão em ilhas (Tabela 1.1). Por exemplo, 81% de todas as aves extintas viveram em ilhas, número qua- tro vezes maior que a proporção de espécies de aves que vivem em ilhas. Mais de 800 extinções foram documentadas desde o início dos registros em 1600, a maioria sendo de espécies de ilhas INTRODUÇÃO4 São classifi cadas como ameaçadas 18 % das espécies animais vertebrados, 29 % de invertebrados e 49 % das espécies de plantas As projeções indicam elevadas taxas de extinção no futuro próximo Espécies ameaçadas são aquelas com alto risco de extinção imediata 1600 0,0 0,1 0,2 0,3 0,4 1700 1800 1900 2000 P e rc e n ta ge o f ta x o n b e co m in g e x ti n ct Year Birds Mammals Extensãoda ameaça A IUCN, a União para a Conservação Mundial, defi ne como ameaçadas as espécies com um alto risco de extinção dentro de um curto perí- odo de tempo. Estas espécies ameaçadas são classifi cadas dentro das categorias criticamente em perigo, em perigo e vulneráveis. Em peixes, anfíbios, répteis, aves e mamíferos, a IUCN classifi cou 30%, 21%, 25%, 12% e 24% das espécies avaliadas, respectivamente, como ameaçadas. Das 4763 espécies de mamíferos, 3,8% estão criticamente em perigo, 7,1% em perigo e 13,0% vulneráveis, enquanto que os 76% restantes são considerados em baixo risco. A situação é similar em invertebrados com 29% das espécies avaliadas classifi cadas como ameaçadas. A situação em plantas é ainda mais alarmante. A IUCN classifi - cou 49% das plantas como ameaçadas, com 53% dos musgos, 23% das gimnospermas, 54% das dicotiledôneas e 26% das monocotiledôneas ameaçadas. Há considerável incerteza sobre esses dados, com exceção dos dados de mamíferos, aves e gimnospermas, uma vez que muitas espécies não foram avaliadas nos demais grupos. Estimativas para mi- croorganismos não estão disponíveis, já que o número de espécies para este grupo não é conhecido. Projeção das taxas de extinção Com o aumento contínuo das populações humanas e o impacto pre- visto sobre a vida selvagem, existe um consenso de que as taxas de extinção deverão acelerar marcadamente, por até mil vezes ou mais que a taxa ‘normal’ deduzida dos registros fósseis. O que é uma espécie ameaçada? A classifi cação da IUCN em criticamente em perigo, em perigo, vulne- rável e baixo risco refl ete graus de risco de extinção. Elas são defi nidas em termos de taxas de declínio no tamanho populacional, restrições na área do habitat, o tamanho populacional atual e/ou a probabilidade de extinção prevista quantitativamente. Espécies criticamente em pe- rigo são aquelas que exibem qualquer uma das características descritas sob os itens A-E na Tabela 1.2, por exemplo, redução de ≥80% do tama- nho populacional nos últimos 10 anos ou três gerações, ou uma área TRADUZIR Fig. 1.1 Mudanças mundiais nas taxas de extinção ao longo do tempo em mamíferos e pássaros (depois de Smith et al.1995). As taxas de extinção geralmente têm aumentado em períodos de 50 anos sucessivos. O QUE É UMA ESPÉCIE AMEAÇADA? 5 Listar uma espécie ou subespécie como em perigo fornece uma base científi ca para a proteção legal nacional e internacional e pode levar a ações corretivas para sua recuperação Tabela 1.2 | Designações de espécies dentro das categorias criticamente em perigo, em perigo ou vulnerável (IUCN, 2002). Uma espécie em conformidade com qualquer um dos critérios de A – E na coluna de ‘Criticamente em perigo’ é defi nida como dentro dessa categoria. Regras similares são aplicadas para as categorias ‘Em perigo’ e ‘Vulnerável’. Critérios (qualquer um de A – E) Criticamente em perigo Em Perigo Vulnerável A. Redução do tamanho populacional atual ou projetado 80% de declínio nos últimos 10 anos ou três gerações 50% 20% B. Extensão de ocorrência ou área de ocupação < 100 km2 < 5.000 km2 < 20.000 km2 < 10 km2 e dois dos itens seguintes: < 500 km2 < 2.000 km2 (1) severamente fragmentada ou ocorrência conhecida em um único local (2) declínio continuo e (3) fl utuações extremas ≤ 5 locais ≤ 10 locais C. Tamanho populacional e declínio contínuo estimado, ou população severamente fragmentada < 250 indivíduos maduros < 2500 < 10.000 D. Tamanho populacional estimado < 50 indivíduos maduros < 250 < 1.000 E. Análise quantitativa mostrando a probabilidade de extinção na natureza Pelo menos 50% nos próximos 10 anos ou três gerações, ou o que for maior 20% em 20 anos, ou cinco gerações 10% em 100 anos de ocupação ≤100 quilômetros quadrados, ou uma população estável de ≤250 adultos maduros, ou uma probabilidade de extinção de ≥50% nos próximos 10 anos ou três gerações, ou alguma combinação destes. Por exemplo, o rinoceronte de Java, classifi cado como criticamente em perigo, sobrevive com somente 65 indivíduos no Sudeste da Ásia e esse número continua em declínio. Da mesma forma, critérios que representam menor grau de amea- ça são utilizadas para classifi car as espécies nas categorias “em perigo” ou “vulneráveis”. Espécies que não se encaixam em nenhum dos crité- rios da Tabela 1.2 são designadas como em baixo risco de extinção. Embora existam muitos outros sistemas para categorizar o grau de ameaça que são utilizados por alguns paises e estados em particular, a IUCN proporciona o único sistema internacional e é a base para a ela- boração da lista de espécies apresentada no Livro Vermelho das espécies ameaçadas da IUCN. No geral, usamos os critérios da IUCN em todo este livro. Importância da listagem O reconhecimento da ameaça é a base para a proteção legal das espécies. Muitos países possuem, por exemplo, Leis de Espécies Ame- açadas que proporcionam uma proteção legal a elas e estabelecem a formulação de planos de recuperação. Adicionalmente, espécies amea- çadas são protegidas do comércio por países que assinaram a Conven- ção sobre o Comércio Internacional de Espécies Ameaçadas (CITES). INTRODUÇÃO6 Os fatores primários que contribuem para as atuais extinções são perda de habitat, introdução de espécies, sobre-exploração e poluição. Esses fatores são gerados pelo homem e estão relacionados ao crescimento das populações humanas Fatores ambientais acidentais (estocásticos), catastrófi cos, demográfi cos e genéticos aumentam o risco de extinção em populações pequenas Quais as causas das extinções? Fatores associados à ação humana Os fatores primários que contribuem para a extinção estão direta ou indiretamente relacionados aos impactos humanos. A população hu- mana está crescendo exponencialmente e chegou a 6 bilhões em 12 de outubro de 1999. Até 2050, projeta-se que a população atingirá 8,9 bilhões de indivíduos, chegando a 10-11 bilhões ao redor de 2070, e então declinando. Isto representa um aumento de cerca de 75% sobre a população atual. Conseqüentemente, os impactos humanos sobre os animais selvagens e plantas irão piorar no futuro próximo. Fatores estocásticos Fatores relacionados à ação humana freqüentemente reduzem as populações a tamanhos nos quais as espécies fi cam susceptíveis a efeitos acidentais ou estocásticos. Estes são fl utuações naturais sen- tidas por pequenas populações. Eles podem ter origens ambientais, catastrófi cas, demográfi cas, ou genéticas. Os fatores estocásticos são amplamente discutidos em todo o livro. Mesmo que a causa original do declínio da população seja removida, os problemas surgidos em pequenas populações persistirão, a menos que os números sejam restabelecidos. Estocasticidade ambiental é a variação randômica imprevisível dos fatores ambientais, tais como variação nos níveis de precipitação e variação no suprimento de alimento. Estocasticidade demográfi ca é a variação nas taxas de nascimento, morte e razão sexual devida somente ao acaso. Catástrofes são eventos ambientais extremos de- vidos a tornados, inundações, inverno severo, etc. A estocasticidade genética abrange os impactos deletérios da en- dogamia, a perda da diversidade genética e o acúmulos de mutações sobre as espécies. A endogamia (produção de descendentes de pais relacionados), na média, reduz a taxa de nascimentos e aumenta a taxa de mortalidade (depressão endogâmica) nos descendentes endo- gâmicos. A perda da diversidade genética reduz a habilidade da po- pulação de adaptar-se a mudanças ambientais via seleção natural. A estocasticidade ambiental e demográfi ca, e oimpacto das ca- tástrofes, interagem com a diversidade genética e o endocruzamen- to em seus efeitos adversos sobre as populações. Se as populações tornam-se pequenas por alguma razão, elas tornam-se mais endo- gâmicas, promovendo mais redução no tamanho populacional e aumentando a endogamia. Ao mesmo tempo, populações menores perdem variação genética (diversidade) e conseqüentemente apre- sentam uma redução em sua habilidade de se adaptar e evoluir às mudanças ambientais. Esta interação entre tamanho populacional reduzido, perda da diversidade genética e endogamia é referida como vórtex de extinção. As intrincadas interações entre os fatores genéticos, demográfi cos, e ambientais pode tornar bastante difícil a identifi cação da(s) causa(s) imediata(s) de qualquer evento particular de extinção. O QUE É GENÉTICA DA CONSERVAÇÃO? 7 Pantera da Flórida O que é genética da conservação? Genética da conservação é o uso da teoria e técnicas genéticas para reduzir o risco de extinção das espécies ameaçadas. Seu objetivo em longo prazo é preservar espécies como entidades dinâmicas capazes de lidar com mudanças ambientais. A genética da conservação é derivada da genética evolutiva e da teoria da genética quantitativa que forma a base da seleção de plantas e animais domésticos. Entretanto, estas teorias geralmente concentram-se sobre grandes populações onde a constituição genética das populações é governada por fatores deter- minísticos (coefi cientes de seleção, etc.). A genética da conservação é agora uma disciplina a parte que focaliza as conseqüências que sur- gem da redução de uma população, uma vez grande e exogâmica, para pequenas unidades onde fatores estocásticos e efeitos da endogamia são extremamente importantes. O campo da genética da conservação também inclui o uso das aná- lises genéticas moleculares para elucidar aspectos da biologia da espé- cie relevantes para o seu manejo e conservação. Os principais temas incluem: Os efeitos deletérios da endogamia sobre a reprodução e sobrevivên-• cia (depressão endogâmica) Perda da diversidade genética e a habilidade de evoluir em resposta • a mudanças ambientais (perda do potencial evolutivo) Fragmentação das populações e redução do fl uxo gênico• Maior importância dos processos estocásticos (deriva genética), em • relação à seleção natural, como o principal processo evolutivo Acumulação e perda (expurgo) de mutações deletérias• Manejo genético de pequenas populações em cativeiro e os efeitos • adversos da adaptação ao ambiente do cativeiro sobre o sucesso da reintrodução Resolução de incertezas taxonômicas• Defi nição de unidades de manejo dentro dos limites das espécies• Uso de análises genéticas moleculares em questões forenses e elu-• cidação de aspectos da biologia das espécies importantes para a conservação Alguns exemplos são dados abaixo. Redução do risco de extinção pela minimização da endogamia e da perda da diversidade genética Muitas populações pequenas e ameaçadas são endogâmicas e têm re- duzido níveis de diversidade genética. Por exemplo, a ameaçada pan- tera da Flórida sofre de problemas genéticos como evidenciado pela baixa diversidade genética e defeitos relacionados à endogamia (pouco esperma e anormalidades físicas). Para aliviar esses efeitos, indivíduos de sua subespécie mais relacionada do Texas têm sido introduzidos nesta população. Populações de cativeiro de muitas espécies ameaça- das (por exemplo, mico-leão-dourado) são manejadas para minimizar a perda da diversidade genética e endogamia. INTRODUÇÃO8 Pinheiro Wollemi Pica-pau Picoides borealis Verme-de-veludo Identifi cação de espécies ou populações em risco devido a redução da diversidade genética Os leões asiáticos existem na natureza somente em uma pequena popu- lação na Floresta Gir na Índia e apresentam baixos níveis de diversida- de genética. Conseqüentemente, eles têm uma habilidade para evoluir severamente comprometida, bem como são susceptíveis a riscos demo- gráfi cos e ambientais. O pinheiro Wollemi, uma espécie Australiana recentemente descoberta e conhecida anteriormente somente por re- gistros fósseis, não contém diversidade genética em centenas de locos entre os indivíduos. Seu risco de extinção é extremo. É susceptível a um fungo comum (die-back), e todos os indivíduos que foram testados foram similarmente susceptíveis. Em conseqüência, instituiu-se um programa que envolve manter o local de sua ocorrência em segredo, o estabelecimento de quarentena, e a propagação de plantas em outras localidades. Resolução da estrutura de populações fragmentadas A informação sobre a extensão do fl uxo gênico entre as populações é critica para determinar se a espécie requer ajuda humana para trans- locação de indivíduos de forma a prevenir a endogamia e a perda da diversidade genética. Populações naturais do pica-pau Picoides borealis (red-cockaded) são fragmentadas, causando diferenciação genética entre elas e reduzindo a diversidade genética nas populações pequenas. Con- seqüentemente parte do manejo dessa espécie envolve a introdução (translocação) de indivíduos nas pequenas populações para minimizar os riscos de endogamia e de perda da diversidade genética. Resolução de incertezas taxonômicas O status taxonômico de muitos invertebrados e plantas inferiores é freqüentemente desconhecido. Assim, uma espécie aparentemente de baixo risco e amplamente distribuída pode, na realidade, compor um complexo de espécies distintas, algumas raras ou ameaçadas. Na Aus- trália, espécies de tarântulas são aparentemente amplamente distri- buídas na fl oresta tropical do norte e são coletadas por comerciantes. Entretanto, especialistas podem identifi car, mesmo entre os espécimes comercializados em lojas especializadas, espécies ainda não descritas, algumas das quais podem ser nativas de regiões restritas. Estudos si- milares têm mostrado que a Austrália é a casa de mais de 100 espécies de vermes-de-veludo (Peripatus) distribuídas localmente, ao contrário das sete espécies morfológicas de ampla distribuição previamente reconhecidas. Até mesmo a tuatara, réptil único da Nova Zelândia, é composto de duas espécies ao invés de apenas uma. Da mesma forma, os marcadores genéticos podem revelar que po- pulações que pensamos estarem ameaçadas pertencem, de fato, a es- pécies comuns, atraindo recursos e proteção não merecidos. Análises com marcadores moleculares têm demonstrado que o roedor colonial ameaçado do grupo Geomys (pocket gopher) da Geórgia, USA é indistin- guível de uma espécie relacionada mais comum naquela região. O QUE É GENÉTICA DA CONSERVAÇÃO? 9 Salmão Oncorhynchus kisutch Marsupial Lasiorhinus krefftii Wallaby-de-pata-preta Defi nição de unidades de manejo dentro dos limites das espécies Populações de uma espécie podem ser adaptadas a ambientes levemen- te diferentes e serem sufi cientemente diferenciadas para merecerem um manejo como unidades separadas. Seus híbridos podem estar em desvantagem, algumas vezes apresentando isolamento reprodutivo parcial. Por exemplo, o salmão Oncorhynchus kisutch (e muitas outras es- pécies de peixes) apresenta diferenciação genética entre as populações de diferentes localidades geográfi cas. Isso evidencia a adaptação a dife- rentes condições (morfologia, habilidade de natação e idade de matu- ração). Assim, elas devem ser manejadas como populações separadas. Detecção de hibridação Muitas espécies raras de plantas, peixes salmonídeos e canídeos são ameaçados por “hibridação incomum” ao cruzarem com espécies que são abundantes no ambiente em que vivem. Análises genéticas mole- culares têm mostrado que a espécie criticamente em perigo de lobo da Etiópia (simianjackal) está sujeito à hibridação com os cães domésticos locais. Amostragem não-invasiva para análises genéticas Muitas espécies são difíceis de capturar, ou fi cam extremamente estres- sadas no processo de captura. O DNA dessas espécies pode ser obtido de pêlos, penas, descamações de pele, fezes, etc. através de amostra- gem não-invasiva, e posteriormente amplifi cado, de maneira que es- tudos genéticos podem ser completados sem perturbar o animal. Por exemplo, o marsupial Lasiorhinus krefftii (hairy-nosed wombat) do norte da Austrália, criticamente em perigo, é um animal noturno que vive em buracos e que somente pode ser capturado com difi culdade. Sua captura deixa-os estressados e eles aprendem a evitar as armadilhas. A amostragem tem sido realizada colocando-se fi tas adesivas na entra- da de suas tocas, o que permite a coleta de pêlos quando os animais saem destas. O DNA obtido de forma não-invasiva pode ser usado para identifi car indivíduos, determinar padrões de cruzamentos e estrutu- ra populacional, e medir níveis de diversidade genética. Defi nição de locais para reintrodução As análises moleculares podem fornecer informações adicionais a respeito da distribuição histórica das espécies, expandindo as possi- bilidades para as ações conservacionistas. Por razões ecológicas, as reintroduções devem ocorrer preferivelmente dentro da distribuição histórica da espécie. O marsupial australiano Lasiorhinus krefftii exis- te em uma única população de aproximadamente 100 animais em Clermont, Queensland, Austrália. Amostras de DNA obtidas de pele de museu identifi caram uma população extinta de um marsupial em Deniliquin, New South Wales, como pertencendo a esta espécie. Assim, Deniliquin é um local potencial para reintroduções. Similarmente, informações resultantes da genotipagem de DNA de ossos sub-fósseis revelaram que o pato de Laysan, atualmente classifi cado como em pe- rigo, anteriormente existia em outras ilhas além de sua atual distribui- ção nas Ilhas Havainas. INTRODUÇÃO10 Baleia-jubarte Escolha das melhores populações para reintrodução Populações de ilhas são consideradas uma fonte genética valiosa para restabelecimento de populações do continente, particularmente na Austrália e Nova Zelândia. Entretanto, análises genéticas moleculares revelaram que a população do wallaby-de-pata-preta de rochedos da Ilha Barrow, Austrália (uma fonte potencial de indivíduos para rein- trodução no continente) apresenta variação genética extremamente baixa e reduzida taxa reprodutiva (devido a endogamia). Algumas populações do continente, numericamente menores e mais ameaça- das, são geneticamente mais saudáveis e são, dessa forma, fontes mais apropriadas de animais para reintroduções em outras localidades do continente. Alternativamente, o agrupamento de várias populações de diferentes ilhas poderia proporcionar uma população geneticamente saudável e adequada para propósitos de reintrodução. Análise forense Os métodos de genética molecular são amplamente aplicados para pro- ver evidências forenses em casos de litígios. Estas incluem a detecção de caça e coletas ilegais. A venda de carne de baleias ameaçadas para consumo tem sido detectada através da análise de amostras no Japão e Coréia do Sul. Seqüências de DNA mitocondrial mostraram que cerca de 9 % da carne de baleia vendida provêm de espécies protegidas, ao invés de serem de baleias-minke caçadas legalmente. Métodos têm sido desenvolvidos para identifi car a espécie de origem usando pequenas quantidades de DNA isolado de nadadeiras de tubarões, e trabalhos estão em andamento para identifi car a presença de ossos de tigres nos remédios asiáticos. Entendimento da biologia das espécies Muitos aspectos da biologia das espécies podem ser determinados usando análises genéticas moleculares. Por exemplo, padrões de cruza- mento e sistemas de reprodução são freqüentemente difíceis de serem determinados em espécies ameaçadas. Estudos usando marcadores ge- néticos provaram que fêmeas da tartaruga marinha cabeçuda cruzam com vários machos. O sistema de reprodução em muitas plantas tem sido estabelecido usando-se análises genéticas. A sexagem de aves é freqüentemente difícil, resultando em vários casos onde duas aves do mesmo sexo foram colocadas juntas para acasalar. Métodos de genética molecular estão agora disponíveis para a sexagem de aves sem recorrer a cirurgias. A paternidade pode ser determinada em muitas espécies, incluindo chipanzés. Os ursos marrons ameaçados dos Pirineus são noturnos, reservados e perigosos. Métodos baseados na análise do DNA de pêlos e fezes têm sido desenvolvidos para realizar o censo desses ani- mais. Indivíduos podem ser sexados e individualmente identifi cados. Conhecer os padrões de migração e dispersão é freqüentemente crítico para assegurar a sobrevivência das espécies. Estes são difíceis de serem diretamente determinados, mas podem ser inferidos usando-se análises genéticas. Cada um desses aspectos será explicado nos capítulos que se seguem. LEITURAS SUGERIDAS 11 LEITURAS SUGERIDAS Frankham, R., J. D. Ballou & D. A. Briscoe. 2002. Introduction to Conservation Genetics. Cambridge University Press, Cambridge, UK. Comprehensive textbook of conservation genetics. Chapter 1 has an extended treatment of these topics, plus references. IUCN. 2002. Red List of Threatened Species. Website with full details of the international recognized IUCN categorization system for designating threatened species, plus up-to-date summaries of the proportions of species threatened in different major groups and categorization lists for animals and links to a plant database. Leakey, R. & R. Lewin. 1995. The Sixth Extinction: Biodiversity and its Survival. Phoenix, London. Account of the biodiversity crisis written for a general audience. Meffe, G. K. & C. R. Carroll. 1997. Principles of Conservation Biology, 2nd edn. Sinauer, Sunderland, MA. Basic textbook in conservation biology, with a reasonable coverage of genetic issues. Primack, R. B. 2002. Essentials of Conservation Biology, 3rd edn. Sinauer, Sunderland, MA. Basic textbook in conservation biology with a good, but limited coverage of genetic issues. Capítulo 2 Diversidade Genética A diversidade genética é necessária para as populações se adaptarem às mudanças ambientais. Populações grandes de espécies naturalmente exogâmicas geralmente têm ampla diversidade genética, mas esta é tipicamente reduzida nas espécies em perigo. Termos Diversidade alélica, aloenzima, polimorfi smo de tamanho de fragmentos amplifi cados (AFLP), fi ngerprint de DNA, eletroforese, valor adaptativo, genoma, equilíbrio de Hardy-Weinberg, herdabilidade, hermafrodita, heterozigosidade, íntrons, loco, microssatélite, DNA mitocondrial (DNAmt), monomórfi co, carga genética, exogamia, reação em cadeia da polimerase (PCR), polimorfi smo, sonda, caráter quantitativo, variação genética quantitativa, locos de caracteres quantitativos (QTL), polimorfi smo de DNA amplifi cado ao acaso (RAPD), polimorfi smo de tamanho em fragmento de restrição (RFLP), substituição silenciosa, polimorfi smo de substituição em um único nucleotídeo (SNP), substituições sinônimas Um jabuti de Galápagos e um eletroferograma de um sequenciador de DNA ilustrando a diversidade genética em um loco de microssatélite entre indivíduos dessa espécie IMPORTÂNCIA DA DIVERSIDADE GENÉTICA 13 Importância da diversidade genética A IUCN, a primeira organização internacional para a conservação, reconhece a necessidade de conservar a diversidadegenética como uma das três prioridades globais de conservação. Existem dois aspec- tos principais e relacionados. Primeiro, a mudança ambiental é um processo contínuo e a diversidade genética é necessária para as popu- lações evoluírem e se adaptarem a tais mudanças. Segundo, a perda da diversidade genética está geralmente associada com a endogamia e a redução geral na reprodução e sobrevivência (valor adaptativo). Programas de reprodução em cativeiro e manejo da vida silvestre geralmente reconhecem a importância de minimizar a perda da diver- sidade genética e a endogamia. As ações de manejo para populações em cativeiro incluem a consulta à pedigrees para o estabelecimento de casais para a reprodução ou para a escolha de indivíduos para reintro- dução na natureza. Os níveis de diversidade genética são analisados e monitorados nas populações selvagens de espécies em perigo, e o fl uxo gênico entre populações selvagens isoladas pode ser aumentado. Este capítulo discute a base dos dois principais aspectos relaciona- dos à diversidade genética, defi ne o que ela é, descreve métodos para medi-la e faz uma revisão das evidências de sua amplitude nas espécies que estão ou não em perigo. O que é a diversidade genética? A diversidade genética é manifestada por diferenças em muitos carac- teres, incluindo a cor dos olhos, da pele e do cabelo nos humanos, cor e padrões de bandamento das conchas dos caracóis, cor das fl ores nas plantas, e diferenças nas proteínas, enzimas e seqüências de DNA de quase todos os organismos. Os genes são seqüências de nucleotídeos em uma região particular (loco) de uma molécula de DNA. A diversidade genética representa se- qüências ligeiramente diferentes. Por sua vez, variantes da seqüência do DNA podem ser expressas em diferenças na seqüência de aminoá- cidos da proteína codifi cada pelo loco. Tal variação na proteína pode ocasionar diferenças em funções bioquímicas, morfológicas ou com- portamentais que causam diferenças nas taxas reprodutivas, de sobre- vivência ou no comportamento dos indivíduos. A terminologia usada para descrever a diversidade genética é defi - nida na Tabela 2.1. A diversidade genética é geralmente descrita usan- do polimorfi smo, heterozigosidade média, e diversidade alélica. Por exemplo, a análise eletroforética de aloenzimas (ver adiante) em leões Africanos revelou que seis dos 26 locos que codifi cam proteínas (23%) eram variáveis (polimórfi cos), 7,1% dos locos, em média, eram hetero- zigotos, e que existia uma média de 1,27 alelos por loco (diversidade alélica). Estes níveis de diversidade genética são típicos de variação eletroforética para mamíferos não ameaçados. Ao contrário, leões Asi- áticos em perigo têm pouca diversidade genética. A diversidade genética é o material bruto sobre a qual a seleção natural atua para permitir a adaptação e evolução dos organismos e a sua adequação às mudanças ambientais. A perda da diversidade genética reduz o potencial evolutivo e está também associado com a redução do sucesso reprodutivo. Diversidade genética é a variedade de alelos e genótipos presentes no grupo sob estudo (populações, espécies ou grupos de espécies) Leão Asiático DIVERSIDADE GENÉTICA14 Medindo a diversidade genética Técnicas moleculares tais como eletroforese de aloenzimas ou genoti- pagem de microssatélites (ver abaixo) medem a diversidade genética em locos individuais. A composição genética de uma população é geralmente descrita em termos de freqüências dos alelos, número de alelos e heterozigosidade Tabela 2.1 | Terminologia usada para descrever a diversidade genética. Loco (plural locos) A região em um cromossomo na qual um gene em particular está localizado. A seqüência nucleotídica em um loco pode codifi car para uma estrutura ou função particular, por exemplo, o segmento do DNA codifi cando para a enzima álcool desidrogenase é um loco separado daqueles que codifi cam para as hemoglobinas. Locos moleculares tais como microssatélites (ver abaixo), são simplesmente segmentos de DNA que podem ter produtos não funcionais. Alelos Variantes diferentes da seqüência nucleotídica em um mesmo loco (gene) em cromossomos homólogos, e.g. A 1 , A 2 , A 3 , A 4 , etc. Genótipo A combinação de alelos presente em um loco em um individuo, por exemplo, A 1 A 1 , A 1 A 2 , ou A 2 A 2 . Genótipos são heterozigotos (A 1 A 2 ) ou homozigotos (A 1 A 1 ou A 2 A 2 ). Genoma O material genético completo de uma espécie, ou indivíduo; a seqüência nucleotídica inteira do DNA, incluindo todos os locos e todos os cromossomos. Homozigoto Um indivíduo com duas cópias do mesmo alelo em um loco, por exemplo, A 1 A 1 . Heterozigoto Um indivíduo com dois alelos diferentes em um loco, por exemplo, A 1 A 2 . Freqüência alélica A freqüência relativa de um alelo particular em uma população (freqüentemente referido como freqüência gênica). Por exemplo, se uma população de uma espécie diplóide tem 8 indivíduos A 1 A 1 e 2 indivíduos A 1 A 2 , então existem 18 copias do alelo A 1 e 2 do alelo A 2 . Assim, o alelo A 1 tem uma freqüência de 0,9 e o alelo A 2 uma freqüência de 0,1. Polimórfi co A presença em uma espécie de dois ou mais alelos em um loco, por exemplo, A 1 e A 2 . Locos polimórfi cos são geralmente defi nidos como tendo o alelo mais freqüente em uma freqüência menor que 0,99 ou menor que 0,95 (para minimizar problemas com diferentes tamanhos amostrais). Monomórfi co Um loco é monomórfi co numa população se este possui somente um alelo, por exemplo, A 1 . Todos os indivíduos são homozigotos para o mesmo alelo. Ausência de diversidade genética. Proporção de locos polimórfi cos (P) Número de locos polimórfi cos / número total de locos amostrados. Por exemplo, se 3 de 10 locos amostrados são polimórfi cos e 7 são monomórfi cos, P 3 = 0,3 10 = Heterozigosidade média (H) Soma das proporções de heterozigotos em todos os locos / número total de locos amostrados. Por exemplo, se as proporções de heterozigotos em 10 locos em uma população são 0,2, 0,4, 0,1, 0, 0, 0, 0, 0, 0 e 0, então H (0,2 0,4 0,1 0 0 0 0 0 0 0) = 0,07 10 + + + + + + + + + = Em geral, são empregadas as heterozigosidades esperadas (ver abaixo), considerando que estas são menos sensíveis ao tamanho amostral do que a heterozigosidade observada. Em populações com acasalamento ao acaso, as heterozigosidades observada e esperada são usualmente similares. Diversidade alélica (A) Média do número de alelos por loco. Por exemplo, se o número de alelos em 10 locos são 2, 3, 2, 1, 1, 1, 1, 1, 1 e 1, então A (2 3 2 1 1 1 1 1 1 1) = 1,4 10 + + + + + + + + + = MEDINDO A DIVERSIDADE GENÉTICA 15 Tabela 2.2 | Números e freqüências para cada genótipo do loco que codifi ca a proteína da clara do ovo em patos-eider da Escócia. Os indivíduos foram genotipados por eletroforese de proteínas. R refere-se ao alelo de migração mais rápida e L ao mais lento. Genótipos RR RL LL Total Números 37 24 6 67 Freqüência genotípica 0,552 0,358 0,090 1,00 Fonte: Milne & Robertson (1965). As informações que coletamos fornecem os números de cada genótipo num loco. Isso é ilustrado para o loco de uma proteína da clara do ovo do pato-eider escocês, uma espécie que foi severamente reduzida devido a caça para obtenção de penas para a confecção de travesseiros (Tabela 2.2). As freqüências genotípicas são calculadas a partir da pro- porção de cada genótipo na amostra total (por exemplo, freqüência genotípica de RR = 37/67 = 0,552). Os resultados são geralmente descritosna forma de freqüências alélicas, ao invés de freqüências genotípicas. Usamos as letras p e q para representar as freqüências relativas para os dois alelos no loco. A freqüência do alelo R (p) é simplesmente a proporção de todos os alelos examinados que são R. Note que dobramos o número de cada homo- zigoto e do total, uma vez que os patos são diplóides (cada ave herdou uma cópia do loco de cada pai). (2 × FF) + FS = 2 × Total p (2.1) O cálculo no Exemplo 2.1 mostra que 73% dos alelos neste loco corres- pondem ao alelo R e 27% ao L. Eider ducks TRADUZIR Exemplo 2.1 Cálculo das freqüências dos alelos R e L em um loco de proteína da clara do ovo do pato-eider A freqüência para o alelo R (p) é obtida como segue: = (2 × 37) + 24 = 0,73 2 × 67 p e para L (q) como × = (2 × 6) + (1 24) = 0,27 (2 × 67) q A soma de suas freqüências é igual a 1,00, isto é = 0,73 + 0,27 = 1,00p + q As freqüências alélicas também podem ser descritas como porcentagens. DIVERSIDADE GENÉTICA16 A medida da diversidade genética em um loco é expressa como hete- rozigosidade. A heterozigosidade observada (H o ) é simplesmente a pro- porção dos indivíduos amostrados que são heterozigotos. Por exemplo, a freqüência de heterozigotos no loco da proteína da clara do ovo no pato-eider é 24/67 = 0,36 (Tabela 2.2). Em geral, quando comparamos a amplitude da diversidade genética entre populações ou espécies usa- mos a heterozigosidade média (Tabela 2.1). Diversidade Alélica O número médio de alelos por loco (diversidade alélica) também é usado para caracterizar o nível de diversidade genética. Por exemplo, existem dois alelos no loco determinando diferenças na proteína da clara do ovo nos patos-eider e três alelos num loco de microssatélite em tendilhões-de-Laysan, descrito abaixo no Exemplo 2.2. Quando mais de um loco é estudado, a diversidade alélica (A) é a média do número de alelos de todos os locos (Tabela 2.1). Por exemplo, o leão Africano tem um total de 33 alelos em 26 locos de aloenzimas amostrados, então A = 33/26 = 1,27. Examinemos agora os fatores que infl uenciam as freqüências dos alelos e genótipos em uma população, e a relação entre as freqüências alélicas e genótipicas sob o pressuposto de união aleatória dos gametas (equivalente ao cruzamento ao acaso). Equilíbrio de Hardy-Weinberg Vamos iniciar com o caso mais simples – o de uma população gran- de onde o cruzamento é ao acaso e não existe mutação, migração ou seleção. Neste caso, a freqüência dos alelos e genótipos atinge um equilíbrio depois de apenas uma geração. O equilíbrio é chamado de equilíbrio de Hardy-Weinberg, em homenagem a seus propositores. Embora simples, o equilíbrio de Hardy-Weinberg é crucial na genéti- ca da conservação e genética evolutiva. Ele proporciona a base para detectar desvios do acasalamento ao acaso, para testar a ocorrência de seleção, modelar os efeitos da endogamia e seleção, e estimar as freqüências alélicas em locos que mostram dominância. Este caso simples pode ser apresentado como um modelo matemá- tico que mostra as relações entre as freqüências dos alelos e genóti- pos. Assuma que estamos trabalhando com um loco com dois alelos A 1 e A 2 com freqüências relativas de p e q (p + q = 1) numa população grande onde os cruzamentos ocorrem ao acaso. Imagine organismos marinhos hermafroditas (no qual cada indivíduo libera esperma e ovos) espalhando seus gametas na água, de maneira que espermatozói- des e ovos unem-se ao acaso (Tabela 2.3). Uma vez que a freqüência do alelo A 1 na população é p, a freqüência dos espermatozóides ou ovos carregando este alelo também é p. A probabilidade de um espermato- zóide carregando A 1 unir-se com um ovo carregando o mesmo alelo e produzir um zigoto A 1 A 1 é, portanto, p x p = p2, e a probabilidade de um espermatozóide A 2 fertilizar um ovo A 2 , para produzir um zigoto A 2 A 2 é, da mesma forma, q x q = q2. Zigotos heterozigotos podem ser produzidos de duas formas, não interessando qual gameta contribui A heterozigosidade é a medida mais comumente utilizada para caracterizar a diversidade genética para um loco A diversidade alélica também é usada para caracterizar a diversidade genética Em populações grandes onde a reprodução ocorre ao acaso, as freqüências alélicas e genotípicas em um loco autossômico atingem o equilíbrio após uma geração quando não existe a atuação de nenhuma força (ausência de mutação, migração ou seleção) EQUILÍBRIO DE HARDY-WEINBERG 17 com qual alelo, e sua freqüência esperada é, portanto, 2 x p x q = 2pq. Conseqüentemente, as freqüências genotípicas esperadas para os zi- gotos A 1 A 1 , A 1 A 2 e A 2 A 2 , são p2, 2pq e q2, respectivamente. Estas são as freqüências genotípicas do equilíbrio de Hardy-Weinberg. Tabela 2.3 | Freqüências genotípicas resultante da união ao acaso de gametas para um loco autossômico. Ovo A 1 A 2 p q A 1 p p2 pq Espermatozóide A 1 A 1 A 1 A 2 A 2 q pq q2 A 2 A 1 A 2 A 2 As freqüências genotípicas resultante na progênie são A 1 A 1 A 1 A 2 A 2 A 2 p2 2pq q2 Estas são as freqüências genotípicas do equilíbrio de Hardy-Weinberg. Note que as freqüências genotípicas somam um, isto é, p2 + 2pq + q2 = (p + q) 2 =1. Se as freqüências dos alelos A 1 e A 2 são 0,9 e 0,1, então as freqüências genotípicas no equilíbrio de Hardy-Weinberg são: A 1 A 1 A 1 A 2 A 2 A 2 Total 0,92 2 x 0,9 x 0,1 0,12 1,0 0,81 0,18 0,01 1,0 As freqüências dos dois alelos não mudaram, indicando que as fre- qüências alélicas estão em equilíbrio. Conseqüentemente, as freqüên- cias alélicas e genotípicas estão em equilíbrio depois de uma geração de cruzamento ao acaso e se mantêm assim perpetuamente na ausên- cia de outros fatores. O equilíbrio de Hardy-Weinberg é esperado para todos os locos, exceto para aqueles localizados nos cromossomos sexuais. Esses locos ligados ao sexo possuem diferentes doses de locos em machos e fêmeas e tem um equilíbrio de Hardy-Weinberg que difere daquele de outros locos não ligados ao sexo (locos autossômicos). A relação entre as freqüências alélicas e genotípicas de acordo com o equilíbrio de Hardy-Weinberg é mostrada na Fig. 2.1. A fi gura ilustra dois pontos. Primeiro, as freqüências dos heterozigotos não podem ser maiores do que 0,5 (50%) para um loco com dois alelos. Isso ocorre quando ambos os alelos tem freqüências de 0,5. Segundo, quando um alelo é raro, a maioria de suas cópias está em heterozigose, enquanto que quando este alelo está em alta freqüência muitos deles estão em homozigose. Fig. 2.1 Relação entre freqüências genotípicas e alélicas numa população em equilíbrio de Hardy-Weinberg 0,00 0,00 0,25 0,50 0,75 1,00 0,25 0,50 0,75 1,00 G e n o ty p e f re q u e n c y Frequency of A 1 A 1 A 2 A 2 A 2 A 1 A 1 TRADUZIR DIVERSIDADE GENÉTICA18 Para obter o equilíbrio de Hardy-Weinberg nós assumimos: Um tamanho populacional grande• Uma população fechada (sem migração)• Ausência de mutação• Segregação Mendeliana normal dos alelos• Igual fertilidade dos genótipos dos pais• União dos gametas ao acaso• Igual capacidade de fertilização dos gametas• Igual sobrevivência de todos os genótipos• Na Tabela 2.4, as freqüências genotípicas para o loco da proteína da clara do ovo do pato-eider são comparadas com as freqüências do equi- líbrio de Hardy-Weinberg. Os valores de p e q, calculados previamente,são usados para calcular p2, 2pq, e q2. Essas freqüências são então multi- plicadas pelo número total (67) para obterem-se os números esperados para os três genótipos. Os números observados para cada genótipo são muito próximos dos números esperados em equilíbrio de Hardy-Weinberg. Em geral, em populações naturais grandes e exogâmicas (mais ou menos de re- produção ao acaso), encontramos concordância com as expectativas para a maioria dos locos. Isto não signifi ca que os locos não estejam sujeitos a mutação, migração, seleção e efeitos de amostragem, mas somente que estes efeitos são freqüentemente muito pequenos para serem detectados com tamanhos amostrais realísticos. As freqüências genotípicas para a maioria dos locos geralmente correspondem às freqüências genotípicas esperadas de Hardy- Weinberg em populações grandes naturalmente exogâmicas Tabela 2.4 | Comparação das freqüências genotípicas observadas com as esperadas no equilíbrio de Hardy- Weinberg, para o loco da proteína da clara do ovo do pato-eider. Genótipos RR RL LL Total Números observados (O) 37 24 6 67 Freqüências esperadas p2 2pq q2 1,0 0,732 2 x 0,73 x 0,27 0,272 1,0 0,5329 0,3942 0,0729 1,0 Números esperados (E) (freqüências esperadas x 67) 35,7 26,4 4,9 67 Os desvios das freqüências genotípicas daquelas esperadas no equilíbrio de Hardy- Weinberg são altamente informativos, permitindo-nos detectar a ocorrência de endogamia, fragmentação de populações, migração e seleção Desvios do equilíbrio de Hardy-Weinberg Quando qualquer dos pressupostos que compõem a base do equilí- brio de Hardy-Weinberg (ausência de migração, seleção ou mutação, e união ao acaso dos gametas) é violado, então irão ocorrer desvios do equilíbrio das freqüências genotípicas. Dessa forma, o equilíbrio de Hardy-Weinberg proporciona uma hipótese nula que permite detec- tar se a população não apresenta reprodução ao acaso, se esta ocor- rendo migração ou seleção. Trataremos disso neste e nos próximos capítulos. Heterozigosidade esperada A diversidade genética num loco é caracterizada pela heterozigosidade esperada, heterozigosidade observada e diversidade alélica. Para um EQUILÍBRIO DE HARDY-WEINBERG 19 loco com dois alelos com freqüências p e q, a heterozigosidade espera- da é H e = 2pq (também chamada de diversidade gênica). Quando exis- tem mais que dois alelos, é mais simples calcular a heterozigosidade esperada como sendo um menos a soma do quadrado das freqüências dos alelos: e – ∑ # alelos 2 =1 = 1 i i H p (2.2) onde p i é a freqüência do alelo i. Geralmente prefere-se descrever a H e ao invés da heterozigosidade observada. O Exemplo 2.2 ilustra os cálculos da heterozigosidade esperada para um loco de microssatélite nos tendilhões-de-Laysan. A heterozigo- sidade esperada, baseada nas freqüências alélicas desse loco, é 0,663. Para determinar o potencial evolutivo de uma espécie, é necessário estimar a amplitude da diversidade genética considerando todos os locos no genoma. É improvável que a informação sobre um único loco de uma espécie represente precisamente a diversidade genética para todos os locos. Por exemplo, os mamíferos possuem ao redor de 35.000 locos funcionais. Conseqüentemente, as medidas de diversidade ge- nética (H o , H e ) são provenientes da média de muitos locos amostrados aleatoriamente. Por exemplo, como descrito acima, a heterozigosidade média detectada usando eletroforese de proteínas para 26 locos nos leões Africanos é 7,1%. Estimativa da freqüência de um alelo recessivo Usando o método de contagem de alelo descrito acima, não é possível determinar a freqüência de um alelo que mostre dominância num loco, uma vez que os homozigotos (AA) não podem ser fenotipicamen- te distinguidos dos heterozigotos (Aa). Entretanto, o equilíbrio de Har- dy-Weinberg proporciona um meio de estimar as freqüências de tais alelos. Homozigotos recessivos (aa) são fenotipicamente distinguíveis e têm, para um loco em equilíbrio de Hardy-Weinberg, uma freqüência esperada de q2. Assim, a freqüência do alelo recessivo pode ser estima- da como a raiz quadrada dessa freqüência. Por exemplo, a freqüên- cia do nanismo associado à distrofi a de cartilagem dos ossos longos no condor da Califórnia, uma espécie em perigo de extinção, é 0,03, Exemplo 2.2 Cálculo da heterozigosidade esperada para um loco de microssatélite no ameaçado tendilhão-de-Laysan (Tarr et al. 1998) As freqüências alélicas para três alelos são 0,364, 0,352 e 0,284, respectivamente. Conseqüentemente, a heterozigosidade esperada em equilíbrio de Hardy-Weinberg é H e = 1 – (0,3642 + 0,3522 + 0,2842) = 1 – (0,1325 + 0,1239 + 0,0807) = 0,663 Nesse loco, as heterozigosidades observada e esperada de 0,659 e 0,663 são muito similares. A heterozigosidade esperada de Hardy-Weinberg é usualmente utilizada quando descrevemos a diversidade genética, uma vez que ela é menos sensível a amostragem do que a heterozigosidade observada A heterozigosidade média sobre vários locos é usada para caracterizar a diversidade genética numa espécie O equilíbrio de Hardy- Weinberg proporciona um modo para estimar as freqüências dos alelos recessivos em populações com reprodução ao acaso DIVERSIDADE GENÉTICA20 então o alelo recessivo que causa esta condição tem uma freqüência estimada de √0,03 = 0,17. Esta é uma freqüência surpreendentemente alta para um alelo recess ivo letal, mas não é incomum em outras po- pulações derivadas de muito poucos indivíduos fundadores, incluindo populações de outras espécies em perigo. Uma vez que existem vários pressupostos na base deste método de estimativa de q (acasalamento ao acaso, ausência de seleção ou migra- ção), esse nunca deve ser usado para locos onde todos os genótipos podem ser distinguidos. Extensão da diversidade genética Populações grandes de espécies exogâmicas geralmente contêm uma grande quantidade de diversidade genética. Esta é manifestada nas variações morfológicas, comportamentais e fi siológicas em muitas populações. Esta variação é composta tanto de variações sem base ge- nética, resultante da infl uência ambiental sobre os indivíduos, como por variações com base genética devidas às diferenças nos alelos e na heterozigosidade em muitos locos. Um exemplo desta grande quan- tidade de diversidade genética inerente a uma espécie é a variedade de raças de cachorros que têm sido produzidas a partir do genoma do lobo (Fig. 2.2). Com exceção de umas poucas mutações, a variedade de raças de cachorros refl ete a amplitude da diversidade genética que estava presente nos lobos ancestrais. Populações grandes de espécies naturalmente exogâmicas geralmente têm alta diversidade genética Fig. 2.2 Diversidade de raças de cachorros. Todas derivam do lobo cinza. traduzir EXTENSÃO DA DIVERSIDADE GENÉTICA 21 A diversidade genética pode ser medida em diferentes níveis. Isto inclui a diversidade em caracteres mensuráveis (variação quantitativa), os efeitos diretos visíveis dos alelos deletérios, variação nas proteínas, e medidas diretas da variação nas seqüências de DNA. Variação quantitativa Os caracteres de maior importância na conservação são aqueles que determinam a saúde e o sucesso reprodutivo dos organismos. Estes in- cluem atributos como número de descendentes produzidos, produção de sementes nas plantas, habilidade de acasalamento, longevidade, taxa de crescimento, comportamentos para evitar predadores, peso corporal, altura, força, etc. Coletivamente, esses tipos de característi- cas são chamados de caracteres quantitativos. Virtualmente todos os caracteres quantitativos numa espécie exogâmica exibemdiversidade genética. Por exemplo, diversidade genética tem sido encontrada para caracteres reprodutivos (produção de ovos nas galinhas, número de descendentes em carneiros, camundongos, porcos e moscas de frutas, produção de sementes em plantas, etc.), para taxa de crescimento no tamanho (em gado, porcos, camundongos, galinhas, moscas de fruta e plantas), para composição química (conteúdo de gordura em animais, níveis de proteína e de óleo no arroz), para comportamento (em insetos e mamíferos) e para resistência a doenças em plantas e animais. Carac- terísticas quantitativas são determinadas por muitos locos (locos de caracteres quantitativos, ou QTL). A diversidade genética para um caráter quantitativo é geralmente determinada medindo-se as similaridades do caráter entre muitos indivíduos relacionados e determinando a proporção da variação fenotípica que é herdável (herdabilidade). Discutiremos isto no Ca- pítulo 3. Alelos deletérios A amplitude da diversidade encontrada nas populações que é atribu- ível a alelos deletérios é critico em biologia da conservação porque esses alelos reduzem a viabilidade e o sucesso reprodutivo quando ocorrem em homozigose devido ao endocruzamento. Alelos deletérios são constantemente gerados por mutações e removidos pela seleção. Conseqüentemente, todas as populações exogâmicas contêm alelos raros deletérios (carga genética). Geralmente eles ocorrem em freqü- ência menor que 1%. São exemplos as síndromes genéticas humanas raras, tais como fenilcetonúria, albinismo e doença de Huntington. Síndromes equivalentes existem nas populações selvagens de plantas e animais. Por exemplo, mutações que levam a ausência de clorofi la são encontradas em muitas espécies de plantas. Uma gama de defeitos com bases genéticas têm sido descritas em muitos animais que estão em perigo (nanismo no condor da Califórnia, má absorção de vitamina E no cavalo-de-Przewalski, criptorquidismo e defeitos cardíacos fatais na pantera da Florida, ausência de testículos em coalas e ausência de pelagem nos lêmures vermelho-com-colar (red-ruffed lemur). Os caracteres quantitativos são os de maior importância para a conservação Todas as populações exogâmicas possuem uma ‘carga’ de alelos deletérios raros que podem ser expostos pela endogamia DIVERSIDADE GENÉTICA22 Proteínas A primeira medida de diversidade genética molecular foi feita em 1966 pelo estudo da variação alélica em locos que codifi cam para proteínas solúveis. A técnica usada para distinguir as variantes é a eletrofore- se, a qual separa as moléculas de acordo com a sua carga elétrica e massa molecular em um gradiente de potencial elétrico (Quadro 2.1). Entretanto, somente cerca de 30% das mudanças no DNA resultam em mudanças nas cargas das proteínas, de maneira que essa técnica subes- tima signifi cativamente a medida total da diversidade genética. A eletroforese de proteínas é tipicamente realizada usando-se amos- tras de sangue, fígado ou rim em animais, ou folhas e pontas de raízes nas plantas, uma vez que estes contêm ampla quantidade e variedades de proteínas solúveis. Conseqüentemente, os animais devem ser capturados para obterem-se amostras de sangue, ou mortos para obterem-se amostras de fígado ou rim. Estas práticas são indesejáveis para espécies em perigo. Proteínas solúveis são moléculas relativamente frágeis e as técnicas para o seu estudo, ao contrário das técnicas para estudo do DNA, requerem amostras frescas ou recém-congeladas logo após sua obtenção. As primeiras análises de variações eletroforéticas, em humanos e moscas de frutas, surpreendentemente revelaram altos níveis de di- versidade genética. Resultados similares são encontrados para muitas espécies que possuem tamanhos populacionais grandes. Por exemplo, em humanos (baseado em 104 locos) 32% dos locos são polimórfi cos com uma heterozigosidade média de 6%. A Tabela 2.5 sumariza as heterozigosidades de aloenzimas para vários grupos taxonômicos principais. A heterozigosidade média (H) dentro das espécies é menor nos vertebrados (6,4%) do que nos invertebrados (11,3%), possivelmente devido ao menor tamanho populacional nos vertebrados. Muitas informações sobre a diversidade genética têm sido obtidas usando-se eletroforese para separação de proteínas Tabela 2.5 | Diversidade genética de aloenzimas em diferentes taxa. H é a heterozigosidade média das populações. H Vertebrados Total 0,064 Mamíferos 0,054 Aves 0,054 Répteis 0,090 Anfíbios 0,094 Peixes 0,054 Invertebrados Total 0,113 Insetos 0,122 Crustáceos 0,063 Moluscos 0,121 Plantas Total 0,113 Gimnospermas 0,160 Monocotiledôneas 0,144 Dicotiledôneas 0,096 Fonte: Hamrick & Godt (1989); Ward et al. (1992). Existe extensiva diversidade genética em locos que codifi cam para proteínas na maioria das populações grandes de espécies exogâmicas. Através da análise em eletroforese verifi ca-se que, em média, 28% dos locos são polimórfi cos e 7% são heterozigotos EXTENSÃO DA DIVERSIDADE GENÉTICA 23 Quadro 2.1 Medindo a diversidade genética em proteínas usando eletroforese de aloenzimas A seqüência de aminoácidos que compõem uma proteína é determinada pela seqüência de bases no DNA que codifi ca aquela proteína. Uma parte das mudanças de bases que ocorrem no DNA resulta na mudança de aminoácido na posição correspondente da proteína. Como cinco dos 20 aminoácidos que ocorrem naturalmente são eletricamente carregados (lisina, arginina e histidina [+], ácido glutâmico e ácido aspártico [–]), aproximadamente 30% das substituições de bases resultam em mudanças na carga elétrica da proteína. Essas mudanças podem ser detectadas separando-se as proteínas em um gradiente de potencial elétrico e posteriormente visualizando-as através do uso de coloração histoquímica loco- específi ca. Este processo é chamado de eletroforese de aloenzimas. Por exemplo, se o DNA nos alelos de um loco tem as seqüências: DNA DNA com substituição de bases Fita do DNA . . . TAC GAA CTG CAA . . . . . . TAC GAA CCG CAA . . . RNAm . . . AUG CUU GAC GUU . . . . . . AUG CUU GGC GUU . . . Seqüências . . . met– leu– asp– val . . . . . . met– leu– gly– val . . . dos aminoácidos a proteína a direita irá migrar mais lentamente em direção ao ânodo em um gradiente de potencial elétrico devido a substituição do aminoácido glicina (gly), que não possui carga elétrica, pelo aminoácido ácido aspártico (asp), de carga negativa. Power supply Negative pole Buffer Buffer Gel S F Positive pole Positions of proteins after migration Initial positions of proteins Um aparelho de gel de eletroforese (depois de Hedrick 1983). Os extratos de proteínas solúveis são colocados em posições espaçadas ao longo do topo do gel. Um gradiente de potencial elétrico aplicado ao gel causa a migração das proteínas através do gel. Proteínas codifi cadas pelo mesmo loco gênico, mas com diferentes cargas, migram para posições diferentes (R-rápida vs. L-lenta), permitindo a identifi cação de diferentes alelos num loco. Proteínas de locos específi cos são detectadas através de sua atividade enzimática utilizando-se colorações histoquímicas. traduzir DIVERSIDADE GENÉTICA24 DNA Coleta de amostras de DNA para medidas de diversidade genética Qualquer material biológico contendo DNA pode ser usado para medir a diversidade genética com técnicas moleculares modernas. São apro- priados, por exemplo, pêlos soltos, pele, penas, fezes, urina, cascas de ovos, sangue, tecidos, saliva e sêmen. Peles de museu e tecidos preser- vados proporcionam material adequado e até mesmo fósseis podem sergenotipados. Os únicos requisitos são que as amostras contenham algum DNA não degradado e que não exista contaminação com DNA de outros indivíduos ou espécies proximamente relacionadas. Amplifi cação do DNA usando a PCR Muitos métodos atuais utilizados para medir a diversidade do DNA baseiam-se na reação em cadeia da polimerase (PCR), a qual permite a amplifi cação no laboratório de seqüências especifi cas do DNA, fre- qüentemente a partir de pequenas amostras iniciais (Fig. 2.3). A genotipagem dos indivíduos pode ser feita após uma amostragem não-invasiva ou ‘remota’ e amplifi cação via PCR do DNA Fig. 2.3 Amostragem não-invasiva do DNA e o uso da reação em cadeia da polimerase (PCR) para amplifi car o DNA. A PCR é usada para amplifi car (gerar múltiplas cópias) o DNA a partir de pequenas amostras. A PCR é essencialmente uma versão em tubo da replicação do DNA, exceto pelo fato de que através dessa técnica replica-se somente uma região de interesse do DNA. O DNA é extraído e purifi cado de amostras biológicas e adicionado a uma mistura de reação contendo todos os reagentes necessários. Estes incluem oligonucleotídeos iniciadores, uma enzima termoestável de replicação do DNA (Taq polimerase), magnésio, os quatro nucleotídeos que compõem o DNA e uma solução tampão. Os iniciadores são homólogos às seqüências conservadas de DNA existente nas extremidades (regiões fl anqueadoras) da seqüência de DNA a ser amplifi cada (isto é, o loco de interesse). A enzima Taq polimerase replica o DNA, os nucleotídeos são usados para a construção da nova fi ta de DNA e o magnésio e a solução tampão são necessários para que a enzima trabalhe. Ciclos repetidos de temperatura são usados para desnaturar o DNA (separar as fi tas), para permitir aos iniciadores se aderirem às regiões de fl anqueamento (anelamento) e para replicar as seqüências de DNA entre esses iniciadores (extensão). Cada ciclo dobra a quantidade do DNA de interesse. traduzir EXTENSÃO DA DIVERSIDADE GENÉTICA 25 A grande vantagem de medir a diversidade no DNA, ao contrário da variação na proteína, é que a amostragem pode freqüentemente ser realizada de forma não-invasiva e os genótipos podem ser identifi ca- dos após a amplifi cação do DNA. Uma vez que amostras extremamente pequenas de DNA (tão pequenas quanto o conteúdo de uma única cé- lula) podem ser amplifi cadas milhões de vezes pela PCR, somente mi- núsculas amostras biológicas são agora necessárias para a realização das análises genéticas moleculares. Isto contrasta com a eletroforese de proteínas onde os animais devem ser capturados ou mortos para obterem-se as amostras. Conseqüentemente, o desenvolvimento de metodologias de amostragem ‘remota’ representa um grande avanço para as espécies de interesse na conservação. Para amplifi car um segmento de DNA de interesse, regiões conser- vadas específi cas em cada um dos lados do segmento de interesse de- vem ser identifi cadas para permitir o desenvolvimento de iniciadores para as reações de PCR. O segmento a ser amplifi cado é defi nido pelos iniciadores e encontra-se entre eles. As seqüências dos iniciadores po- dem freqüentemente ser deduzidas das informações de seqüências publicadas para o DNA mitocondrial (DNAmt), mas freqüentemente devem ser desenvolvidas para os locos nucleares, especialmente para microssatélites (veja abaixo). Iniciadores desenvolvidos para uma es- pécie podem também funcionar numa espécie proximamente relacio- nada. Por exemplo, iniciadores humanos geralmente funcionam em chimpanzés, e alguns dos iniciadores dos ruminantes domésticos fun- cionam na gazela da Arábia, que está em perigo. Existe uma série de técnicas disponíveis para medir direta ou indi- retamente a variação na seqüência de bases do DNA, e novos métodos são desenvolvidos regularmente (Quadro 2.2). O seqüenciamento do DNA é conduzido rotineiramente, especialmente para propósitos taxo- nômicos. Os microssatélites (número variável de repetições curtas em tandem) tornaram-se os marcadores de escolha para estudos popula- cionais. Os microssatélites apresentam vantagens sobre os outros mé- todos disponíveis para se avaliar o polimorfi smo do DNA uma vez que eles são altamente variáveis, genótipos individuais podem ser direta- mente inferidos, e indivíduos podem ser genotipados após amostragem não-invasiva. Eles têm a desvantagem de que novos iniciadores devem ser desenvolvidos para cada espécie, embora iniciadores de espécies relacionadas irão freqüentemente funcionar em ambas espécies. Quadro 2.2 Técnicas para medir a diversidade genética no DNA MICROSSATÉLITES: REPETIÇÕES DE SEQÜÊNCIAS SIMPLES (SSR) OU REPETIÇÕES CURTAS EM TANDEM (STR) Locos de microssatélites são repetições em tandem de pequenos motivos de DNA, que tipicamente apresentam tamanho entre 1-5 bases. Como exemplo, são mostradas seqüências de DNA com as bases CA repetidas 7 e 9 vezes. Repetições CA são encontradas em muitas espécies. O número de repetições de microssatélites é muito variável devido a ‘escorregões’ durante a replicação do DNA. Abaixo são ilustrados as seqüências da fi ta dupla do DNA de três genótipos, dois homozigotos diferentes e um heterozigoto, junto com seus padrões de bandas visto em gel de eletroforese. X e Y são seqüências conservadas de DNA que fl anqueiam a repetição do microssatélite e que representam os sítios de ligação dos iniciadores. Uma ampla variedade de métodos está disponível para medir a diversidade genética nas seqüências de bases do DNA, sendo os microssatélites o método atualmente preferido DIVERSIDADE GENÉTICA26 A 1 A 1 A 1 A 2 A 2 A 2 X C A C A C A C A C A C A C A Y X G T G T G T G T G T G T G T Y XCACACACACACACACACAY XGTGTGTGTGTGTGTGTGTY XCACACACACACACACACAY XGTGTGTGTGTGTGTGTGTY X A C A C A C A C A C A C A C Y X T G T G T G T G T G T G T G Y X A C A C A C A C A C A C A C Y X T G T G T G T G T G T G T G Y XACACACACACACACACACY XTGTGTGTGTGTGTGTGTGY Tamanhos dos fragmentos no gel (Amostras aplicadas no topo, migração para a parte inferior da página, com os fragmentos menores, de migração mais rápida, produzidos pelo alelo A 1 ). A diversidade dos microssatélites é detectada pela amplifi cação do DNA usando PCR. Seqüências únicas conservadas (iniciadores) fl anqueando os microssatélites são usadas para especifi car a região do DNA a ser amplifi cada. Os fragmentos de DNA resultantes são separados de acordo com o tamanho usando eletroforese em gel de acrilamida ou agarose. Após a separação, os fragmentos são detectados por (1) géis corados com brometo de etídio (um corante de DNA), (2) uso de iniciadores marcados radioativamente e autoradiografi a de géis, ou (3) uso de iniciadores marcados com fl uorescência e separação do produto da PCR em seqüenciador automático de DNA. Como mostrado acima, se um indivíduo é heterozigoto para dois alelos de microssatélites que apresentam números diferentes de repetições, serão detectadas duas bandas de diferentes tamanhos. Os microssatélites medem a variação genética para locos que são neutros (não sujeitos a seleção) uma vez que as repetições em tandem estão geralmente localizadas em segmentos não-codantes do DNA. FINGERPRINT DE DNA: MINISSATÉLITES OU NÚMERO VARIÁVEL DE REPETIÇÕES EM TANDEM (VNTR) Seqüências com número variável de repetições em tandem são encontrados por todo o genoma de humanos e outros eucariotos. Essas seqüências de minissatélites têm seqüências centrais de repetição com tamanhos variáveis de 10-100 bases (isto é, são maiores do que os microssatélites). A tipagem de indivíduos para um fi ngerprint de DNA resulta em um ‘código de barras’, onde cada indivíduo é geralmente único. Para identifi car minissatélites,o DNA é purifi cado, cortado com uma enzima de restrição que corta fora da repetição, liberando o fragmento de DNA minissatélite, e o DNA fragmentado é separado de acordo com o tamanho em um gel de agarose. As duas fi tas dos fragmentos de DNA são separadas (desnaturadas) e transferidas para uma membrana (Southern blotting). A membrana com o DNA aderido é colocada em uma solução contendo muitas cópias de DNA de fi ta simples da seqüência central de repetição marcado radioativamente (sonda). As sondas radioativamente marcadas ligam-se (hibridam-se) a fragmentos de minissatélites sobre a membrana por complementaridade de pareamento de bases. As sondas de DNA fi ta simples não hibridadas retiradas através de lavagens, a membrana é secada e a posição dos minissatélites é revelada por autoradiografi a. O número de repetições é altamente variável, de forma que cada indivíduo em espécies exogâmicas normalmente tem um fi ngerprint de DN A único (com exceção dos gêmeos idênticos). São ilustrados abaixo três genótipos para um único loco de minissatélites e os seus padrões de bandas no gel. ‘o’ representa uma única repetição da seqüência central. Muitos desses locos são tipados simultaneamente, resultando em um padrão de bandas equivalentes a um código de barras. EXTENSÃO DA DIVERSIDADE GENÉTICA 27 -----ooooo----- -----oooooo----- -----oooooo----- -----ooooo----- -----ooooo----- -----oooooo----- Fragmentos de DNA sobre o gel Os fi ngerprints de DNA são altamente variáveis, identifi cam a variação do DNA nuclear sob uma ampla faixa de locos, e não necessitam de conhecimento a priori da seqüência de DNA nas espécies a serem genotipadas. As desvantagens são que os locos não são normalmente identifi cáveis separadamente, uma vez que os fragmentos derivam de muitos locais diferentes no genoma. A herança das bandas não é defi nida e, por requerer uma considerável quantidade de DNA, essa técnica não pode ser usada em casos de amostragem não-invasiva. Atualmente o fi ngerprint de DNA está sendo substituído por métodos que permitam a amostragem não-invasiva e seguida pela análise por PCR, tais como microssatélites, AFLP ou RAPDs. SEQÜENCIAMENTO DE DNA A maneira mais direta para medir a diversidade genética é determinar a seqüência de bases do DNA. Isto é geralmente feito usando-se seqüenciadores de DNA. O seqüenciamento ainda é relativamente demorado e caro, e tem sido usado primariamente para propósitos taxonômicos, onde o DNAmt e/ou locos nucleares são seqüenciados para um pequeno número de indivíduos. Entretanto, melhorias técnicas têm reduzido marcadamente os custos e o tempo para o seqüenciamento de DNA, como é evidente no Projeto Genoma do DNA Humano e em esforços similares para outras espécies. OUTROS MÉTODOS Outros métodos, incluindo polimorfi smo de tamanho em fragmento de restrição (RFLP), polimorfi smo de DNA amplifi cado ao acaso (RAPD), polimorfi smo de tamanho em fragmento amplifi cado (AFLP), polimorfi smo de conformação em fi ta simples (SSCP) e polimorfi smo de um único nucleotídeo (SNP) são detalhados em Frankham et al. (2002). DNA Mitocondrial (DNAmt) A mitocôndria possui uma pequena molécula de DNA circular que é maternalmente herdada (da mãe para a prole) na maioria das espécies. O DNAmt é relativamente abundante, uma vez que existem muitas mi- tocôndrias por célula, e é fácil purifi car. A diversidade genética nesse DNA pode ser detectada através de diversos métodos, incluindo cortes com enzimas de restrição (RFLP), SSCP e seqüenciamento (Quadro 2.2). Já estão disponíveis iniciadores para vários locos do DNAmt que fun- cionam para muitas espécies. Esses locos podem ser amplifi cados via PCR e os produtos seqüenciados. O seqüenciamento do DNAmt tem algumas vantagens sobre outras técnicas, como o fato de poder ser uti- lizado após uma amostragem não-invasiva, apresentar uma alta taxa de mutação e ser altamente variável, e poder ser usado para rastrear especifi camente a linhagem feminina dos descendentes ou os padrões de migração. Sua desvantagem é que investiga somente a unidade de herança materna. Nos Capítulos 6 e 9 apresentaremos considerações O DNA mitocondrial é maternalmente herdado na maioria das espécies. Ele é amplamente usado para estudar as relações taxonômicas e as diferenças entre as populações de uma espécie DIVERSIDADE GENÉTICA28 adicionais sobre a variação do DNAmt, considerando que seu principal uso na conservação está na resolução de incertezas taxonômicas, na defi nição de unidades de manejo, e no auxílio ao entendimento de aspectos importantes da biologia das espécies. O DNA dos cloroplastos das plantas pode ser usado para propostas similares. Níveis de diversidade genética no DNA O primeiro estudo extensivo da variação na seqüência do DNA em um loco numa população foi realizado para o loco do gene álcool de- sidrogenase (Adh) em moscas de frutas. Entre 11 amostras, 43 sítios foram polimórfi cos ao longo de 2379 pares de bases. A maioria das mu- danças de base (42/43) não resultou em substituições de aminoácidos (isto é, são silenciosas, ou substituições sinônimas) uma vez que elas ocorriam em regiões não-codantes dos locos (íntrons), ou envolviam a terceira posição do códon que determinava o aminoácido. Tais va- riações não são detectadas pela eletroforese das proteínas. Variações de seqüências no loco da Adh foram ainda maiores em duas espécies de plantas exogâmicas da família Brassica do que a encontrada nas moscas de frutas. Os maiores níveis de diversidade genética no DNA são tipicamente encontrados nas seqüências com pouco signifi cado funcional. Essas va- riantes ou não codifi cam para produtos funcionais, ou as substituições não mudam as funções das moléculas, isto é, não são fenotipicamen- te expressas. Dessa forma, a seleção não atua contra tais mudanças. Inversamente, a menor diversidade genética é encontrada em regiões moleculares funcionalmente importantes, tais como os sítios ativos das enzimas. Muito do DNA em um organismo não codifi ca para pro- dutos funcionais. Existem duas exceções importantes para a generalização de que o polimorfi smo é menor em regiões com funções importantes. Essas são o complexo de histocompatibilidade principal (MHC – uma grande fa- mília de genes que desempenham um papel central no sistema imune dos vertebrados e no combate a doenças) e os locos de auto-incompa- tibilidade (SI) em plantas. Ambas as regiões têm níveis extremamente altos de diversidade genética devido à seleção natural que favorece diferenças entre indivíduos dentro das populações. Os microssatélites são atualmente usados rotineiramente para medir a diversidade genética em uma variedade de espécies, muitas delas em perigo. Tipicamente eles mostram altos níveis de polimorfi s- mo e muitos alelos por loco. Por exemplo, repetições CA são comuns e freqüentemente variam em número de repetições dentro de uma população. Tal diversidade tem sido encontrada em todas as espécies até agora examinadas. Dados de uma pesquisa sobre a variação de mi- crossatélites em oito locos em 39 chimpanzés selvagens detectaram uma média de 5,75 alelos por loco e uma heterozigosidade média de 0,70 (Tabela 2.6). O poder de resolução dos microssatélites permite a determinação de paternidades e a detecção de migrantes, geralmente impossível de ser realizado com a resolução das aloenzimas. Existe uma grande diversidade genética nas seqüências do DNA entre os indivíduos de uma espécie exogâmica A maioria do polimorfi smo encontrado no DNA tem pouco signifi cado funcional, uma vez que ocorrem em regiões não-codantes do genoma, ou não alteram as seqüências de aminoácidos de uma proteína Os microssatélites proporcionam
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