cromatografia

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O que é Cromatografia ?
Definição:
A cromatografia é uma técnica de separação na qual os componentes a serem separados de uma mistura migram entre duas fases sendo uma fase móvel e a outra estacionária.
A natureza química e física dos componentes da mistura definem o grau de afinidade entre as duas fases, acontecendo o fenômeno de migração diferencial . 
O que é Cromatografia a Líquido HPLC?
Definição:
Na técnica de cromatografia a líquido a fase móvel é um líquido e a fase estacionária é um sólido .
O processo cromatográfico acontece na fase líquida , sendo que os componentes da amostras devem estar dissolvidos. 
Instrumentação para HPLC
CLAE -HPLC
Fase móvel
(amostra)
Fase estacionária
(Componentes retidos)
Migrações diferenciais
Analitomov ⇋ Analitoest
K = Analitoest / Analitomov= coeficiente de partição
INSTRUMENTAÇÃO
pump
injector
column
oven
detector
One pump used to 
control 4 reservoirs; 
mixing is done
before pump.
MIXER
data 
processor
Fase móvel
Instrumentação para HPLC
PURGA
INJETOR
COLUNA
FM
BOMBA
DETECTOR
7
Componentes de um Cromatógrafo a Líquido HPLC
Um cromatógrafo a líquido é composto de 3 partes principais :
Injetor : 
É o dispositivo que tem a função de introduzir a amostra na fase móvel ;
Coluna cromatografia : 
É o dispositivo que tem a função de separar os componentes da amostra ;
Detector :
É o dispositivo que tem a função de detectar os componentes eluídos da coluna cromatográficas
Componentes auxiliares de um HPLC
Bomba :
É o dispositivo que bombeia e controla o fluxo e a pressão da fase móvel ( solvente );
É composta de um ou mais pistão acoplados a um sistema de válvulas.
Fornece uma alta pressão. 
BOMBA
 Fluxo deve ser constante (0,01-10 mL/min)
 Opções: Simples, gradiente binário, quaternário
 Mede a pressão sobre o sistema
 Manutenção preventiva (selos, pistões, check valves, etc.) 
Componentes auxiliares de um HPLC
Válvula de purga:
É o dispositivo que permite a troca rápida de solvente desviando o fluxo de solvente para o dreno.
Misturador:	
É o dispositivo que homogeneíza a mistura de solventes quando operando com gradiente de eluição . 
Fase estacionária
Colunas Cromatográficas
Fases estacionárias :
Sílica- C8 
Sílica- C18 
Sílica- C18 ( ODS)
Sílica- NH2
Sílica- Diol
Sílica
Troca Iônica
Resinas DVB-ST Sulfonadas Ca
Resinas DVB-ST porosas
Pré-Coluna:
É o uma pequena coluna instalada a montante da coluna analítica .
Tem como objetivo reter sólidos e em muitos casos reter materiais que por reações químicas podem precipitar sobre a fase estacionária.
SÍLICA (suporte + usado):
 Resistência mecânica
 Variedade de forma, tamanho de partículas e poros 
- Instabilidade frente a fases móveis ácidas ou básicas 
- Superfície não homogênea
COLUNAS CROMATOGRÁFICAS
SÍLICA – GRUPOS SILANÓIS
LIVRES
GEMINAL
VICINAIS
influenciam no grau de acidez da sílica
Fase Estacionária
A fase estacionária mais utilizada é composta de partículas microporosas de sílica. 
São permeáveis ao solvente e possuem uma área superficial de varias centenas de metros por gramas.
Não deve ser utilizada em sistemas com pH acima de 8,0.
MODIFICAÇÃO SUPERFICIAL
- QUIMICAMENTE LIGADAS
- HÍBRIDAS
- RECOBERTAS COM POLÍMEROS ORGÂNICOS
Fases Quimicamente Ligadas
C18 (ODS) 
forte
C8
amostra
amostra
amostra
C4
média
fraca
POLIMÉRICAS 
Pré-hidrólise do agente silanizante
- Rede tridimensional mais espessa
- Maior estabilidade
- Dificuldade de controlar reações entrecruzamento
FASES ESTACIONÁRIAS HÍBRIDAS 
Matriz orgânica-inorgânica
- Mais estáveis do que as quim. ligadas convencionais
- Menor quantidade de grupos de silanóis
- Ultra-fast cromatografia
Tetraalcoxissilano alquiltrialcoxissilano
(RO)4Si + n(RO)3SiR’ + (1,5n+2)H2O  SiO2 (R’SiO1,5)0,5 + (3n+4)ROH
 RECOBRIMENTO COM POLÍMEROS 
RESISTÊNCIA MECÂNICA DA MATRIZ INORGÂNICA
- SELETIVIDADE E INÉRCIA QUÍMICA DOS POLÍMEROS ORGÂNICOS
- Maior recobrimento dos sítios ativos do suporte
- Maior seletividade (natureza e quantidade dos grupos funcionais nas cadeias dos polímeros, espessura dos filmes, área superficial e estrutura de poros do suporte) 
 Poli(etileno)
 Poli(butadieno)
 Poli(estireno)
 Poli(dimetilsiloxano)
 Poli(metiloctilsiloxano)
 Poli(metiloctadecilsiloxano)
 Poliéteres
 Polissacarídeos
 Poliaminas
 Polinucleotídeos
 Poliamidas
 Proteínas
Sílica
Zircônia
Titânia
Alumina 
PRINCÍPIOS DE SEPARAÇÃO
INTERAÇÃO DO SOLUTO NAS 2 FASES (EQUILÍBRIO)
INTERAÇÕES DE VAN DER VALLS
LIGAÇÕES DE HIDROGÊNIO
INTERAÇÕES DIPOLO-DIPOLO
ATRAÇÃO ELETROSTÁTICA
Fases estacionárias
Interações
C8
PH
C2
van der Waals
van der Waals
van der Waals
Si
Si
Si
Fases estacionárias
Interações
CN
NH2
2OH
Dipolo/Dipolo
O
H
Si
N
H
H
O
Si
O
H
O
O
H
H
Si
N
O
H
C
Ligação de hidrogênio
Ligação de hidrogênio
Fase Estacionária
PRS
CBA
SAX
Eletrostática
Eletrostática
Eletrostática
H
3
+
N
SO
3
-
Si
Si
H
3
+
N
O
-
O
N
+
(CH
3
)
3
Si
-
O
3
S
Fases estacionárias
Interações
Fase Estacionária
Processo de Eluição
Definição:
Pode ser descrita como deslocamento do soluto na fase estacionária.
Série eluotrópica
 Ordena os solventes de acordo com suas habilidades relativas de deslocar soluto de um dado adsorvente.
Força eluente:
 É uma medida da energia de adsorção do solvente
Cromatografia com fase normal:
 Utiliza uma fase estacionária polar e um solvente menos polar.
Cromatografia com fase reversa:
 Utiliza uma fase estacionária apolar ou fracamente polar e um solvente polar.
DETECTORES - Classificação
UNIVERSAIS:
Geram sinal para qualquer
substância eluída.
SELETIVOS:
Detectam apenas substâncias
com determinada propriedade
físico-química.
Dispositivos que geram um sinal elétrico proporcional à quantidade eluída de um analito
DETECTORES
UV
FLUORESCÊNCIA
MS
ELETROQUÍMICO
IR
POLARÍMETRO
É mais comum, usado na CLAE.
 Porque muitos solutos absorvem a luz ultravioleta.
 São bons para a eluição por gradiente com solventes não-absorventes.
Detectores Ultra violeta:
Princípio: Absorção de luz ultravioleta ou visível pela amostra, quando nela passa radiação eletromagnética.
 Seletivo (moléculas com cromóforos)
 Comprimento de onda (λ) fixo
 λ pode ser selecionado (190 – 600 nm)
 Varredura (DAD)
 Solventes também absorvem
Ultra violeta (UV-visível):
Água
MeOH
ACN
Acetona
Hexano
Clorofórmio
THF
 190
 210
 200
 330
 200
 245
 215
λ nm
Solvente
Princípio: Emissão de energia fluorescente de um soluto que foi excitado por radiação UV
 Seletivo (moléculas que fluorescem)
 Exemplo: Aromáticos policíclicos e duplas ligações conjugadas
 Mais sensível que UV por ser emissão
 Podem ser feitas reações de derivação pré ou pós-coluna para que o analito se torne fluorescente.
 Reagentes de derivatização comuns: fluorescamina e cloreto de dansila
Fluorescência:
Detectores por Índice de Refração: 
Princípio: Mede a diferença no índice de refração da fase móvel e do eluente vindo da coluna
 Não- seletivo
 Sensível a variações de:
 Temperatura
 Pressão
 Fluxo
 Composição fase móvel
 Baixa sensibilidade e difícil de estabilizar
 Muito usado em cromatografia preparativa
Indice de refração:
Princípio: Determinação da massa de solutos através da ionização e determinação da relação massa-carga (m/z)
 Destrutivo
 Pode ser extremamente seletivo (SIM e massas tandem MS/MS)
 Interfaces de ionização mais comuns: ESI, ApCI
 Análise de micro e macromoléculas.
 Alta sensibilidade
Espectrometria de massas:
MODOS DE SEPARAÇÃO
NORMAL
REVERSO
TROCA IÔNICA
MODO NORMAL
MECANISMO DE INTERAÇÃO:
ADSORÇÃO
Fase estacionária: + POLAR que a fase móvel
Fase móvel: mistura de solventes orgânicos
 Colunas: Sílica, Ciano, fenil, amino
MODO REVERSO
INTERAÇÃO DA PARTE NÃO POLAR DO
SOLUTO E A FASE ESTACIONÁRIAHIDROFOBICIDADE
Fase estacionária: APOLAR
Fase móvel: H2O, MeOH, CH3CN
 ÁREA DE C SOLUTO RETENÇÃO
Tempo de Retenção e Hidrofobicidade
OH
OH
C18 (ODS) 
forte
Interação
fraca
Hidrofobicidade
Se a amostra possui
CH3CH2CH2--- : cadeia carbônica
 	 : grupo aromático
Se a amostra possui
-COOH		 : grupo carboxílico
-NH2		 : grupo amino
-OH		 : grupo hidróxi
A hidrofobicidade será forte
A hidrofobicidade será fraca
TROCA IÔNICA
MECANISMO DE INTERAÇÃO :
ATRAÇÃO ELETROSTÁTICA
Fase estacionária: Resinas trocadoras de íons (catiônicas / aniônicas)
Fase móvel: Tampão (pH, , força iônica, temperatura)
Aniônicas: amônio quaternário, aminas
Catiônicas: ácido sulfônico, ácido carboxílico
Microsseringas para Injeção
LÍQUIDOS Capacidades típicas: 1 L, 5 L e 10 L
êmbolo
corpo (pirex)
agulha (inox 316)
Obs: Seringa de HPLC 
Seqüência
Lavagem da coluna -MeOH por 30 minutos
Condicionamento da coluna com fase móvel
Monitoramento da linha de base
Injeção das amostras
PARÂMETROS CROMATOGRÁFICOS
FATOR DE RETENÇÃO (k)
FATOR DE SEPARAÇÃO ()
NÚMERO DE PRATOS (N)
Cromatograma
tR
tM
TEMPO
SINAL
tR = Tempo de Retenção (tempo decorrido entre a injeção e o ápice do pico cromatográfico)
 tM (tempo morto) = Tempo de Retenção do Composto Não-Retido (tempo mínimo para um
 composto que não interaja com a FE atravesse a coluna)
A migração de um analito pela coluna provoca inevitavelmente o alargamento da sua banda:
TEMPO
Efeitos do alargamento excessivo de picos:
EFICIÊNCIA Capacidade de eluição com o mínimo de dispersão do analito.
w2 na linha de base
BANDA CROMATOGRÁFICA
Representa a capacidade de distribuição do soluto nas fases
Não leva em conta o tempo morto da coluna
FATOR DE RETENÇÃO (k)
tr – to
k
=
to
tr = tempo retenção analito
to = tempo morto da coluna
Se: 
t0 = 1,5 min
t1 = 3,5 min
t2 = 4,2 min
k1 = 1,3
k2 = 1,8
FATOR DE SEPARAÇÃO ()

k2
=
k1
AVALIA A SELETIVIDADE
Se: 
k1 = 1,3 
k2 = 1,8
 = 1,38 
k1 = 1,3
k2 = 1,8

k2
=
k1
 = 1 não houve separação
NÚMERO DE PRATOS (N)
Mede a eficiência do sistema
Depende da coluna, da amostra e do fluxo da fase móvel
tr
N
= 5,54
w0,5
2
Resolução 
é função da 
 
Seletividade ()
Eficiência da coluna (N)
Fator de retenção (k)
Resolução
Rs = 0.8
Rs = 1.25
Rs = 1.05
FASE MÓVEL
 Solvente grau HPLC (alta pureza)
 Filtração (membrana 0.45 μm)
 Degaseificação do solvente (ultrassom, borbulhamento de He ou automático)
 Purgar os solventes
MODOS DE ELUIÇÃO
ISOCRÁTICO:
	Uma única composição de fase móvel ao longo da corrida; a composição ds FM é CONSTANTE. 
GRADIENTE:
 - Variação da composição da fase móvel (FM) ao longo da corrida.
	- Amostras com ampla faixa de k (0,5 < k < 20)
Mudança no modificador orgânico
a
b
c
d
a
b
c
d
[ MeOH/H2O ]
par crítico : c,d
[ THF/H2O ]
par crítico : a,b
a
b
c
d
[ MeOH/THF/H2O ]
COLETA/OBTENÇÃO (QUANTIDADE, LUGAR, ETC..)
ESTOCAGEM E PREPARAÇÃO (ESTABILIDADE)
EXTRAÇÃO:
 - LÍQUIDO-LÍQUIDO
		 - LÍQUIDO-SÓLIDO
		 - SOXHLET
		 - FLUÍDO SUPER CRÍTICO
		 - EXTRAÇÃO EM FASE SÓLIDA (EFS / SPE)
PREPARAÇÃO DA AMOSTRA
Filtração
É necessária, previamente à injeção, usualmente com membranas de 0.45 mm mesh para a remoção do material insolúvel.
DESENVOLVIMENTO DE MÉTODO
Fixas as condições operacionais, o tempo de retenção ajustado de um analito é uma constante
AMOSTRA
PADRÃO
Comparação de cromatogramas da amostra e de uma solução padrão do analito suspeito
ANÁLISE QUANTITATIVA
A área do pico é proporcional a massa que passa pelo detector
Cálculo de área:
ANÁLISE QUANTITATIVA
Se ambos os compostos
respondessem igualmente ao
detector poderíamos usar a relação:
Massa A Área A
Massa B Área B 
 No entanto, a mesma massa de compostos diferentes nos dá áreas diferentes, em função da resposta ao detector.
PADRONIZAÇÃO EXTERNA
Este método baseia-se na comparação de uma certa substância presente na amostra com seu respectivo padrão.
Primeiramente deve-se construir um gráfico de (área x concentração) da substância padrão:
PADRONIZAÇÃO EXTERNA
 Em seguida, injeta-se a amostra, e a partir da área obtida no cromatograma tira-se do gráfico traçado a concentração dessa substância na amostra.
 É importante salientar que o gráfico deve ser construído com concentrações próximas da concentração esperada na amostra. Outro fator muito importante é que o volume injetado do padrão tem de ser exatamente igual ao volume injetado de amostra. Por esta razão este tipo de padronização é mais conveniente quando se utiliza válvulas para injeção da amostra, que reproduzem fielmente o volume injetado.
 Neste método não são usados fatores de correção para corrigir as áreas, por haver comparação da mesma substância
PADRONIZAÇÃO INTERNA
 Uma quantidade de amostra é pesada juntamente com um padrão de massa conhecida. Esta mistura é injetada e, a partir dos dados obtidos no cromatograma, compara-se a área corrigida de cada componente que se deseja determinar com a área corrigida do padrão adicionado, do qual se conhece a concentração.
Mx = massa do componente x
Ma = massa da amostra
Mp = massa do padrão
Ap = área do padrão
Ax = área corrigida do componente x
PADRONIZAÇÃO INTERNA
 A escolha do padrão deve ser feita, sempre que possível, entre compostos semelhantes aos que existem na amostra, não devendo coincidir com nenhum composto da mesma, e estar próximo ou entre os picos da amostra. Deve ser também uma substância pura para que apresente apenas um pico no cromatograma, e para que esse pico possa ser relacionado à massa pesada
 Este método possibilita a determinação de apenas um dos componentes de uma mistura, sem haver necessidade de conhecer os outros componentes.
APLICAÇÕES
APLICAÇÕES cont…
APLICAÇÕES cont…