Relatório Bioquímica 4

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UNIVERSIDADE FEDERAL DO ABC 
CENTRO DE CIÊNCIAS NATURAIS E HUMANAS 
BACHARELADO EM QUÍMICA 
 
 
RELATÓRIO BIOQUÍMICA EXPERIMENTAL 
 
 
 
PRÁTICAS 7 E 8: 
 
Purificação de Proteínas - SDS-PAGE 
 
Componentes Do Grupo 2 RA: 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Santo André - Novembro/2018 
 
 
1. RESUMO 
 
O experimento tinha como objetivo verificar a presença da proteína α-glicosidase e 
diferenciá-la de outras proteínas presentes nas amostras por meio de seus tamanhos e então 
comparar com seu valor de tamanho teórico. Para tal, realizou-se o processo de eletroforese, 
que consiste em correr uma voltagem, para gerar uma diferença de potencial elétrico, por 
meio de um gel que contenha as amostras de proteína separadas em diferentes poços. As 
moléculas correm pelo gel por diferentes distâncias de acordo com seus tamanhos 
moleculares. Neste experimento adicionou-se amostra de lisado aos poços do gel, juntamente 
com amostras de hemoglobina, Albumina Sérica Bovina (BSA) e uma solução padrão que 
demarca tamanhos moleculares diferentes gerando uma escala de referência para 
determinação do tamanho das proteínas. Após a corrida por eletroforese, o gel passa por um 
processo de coloração e descoloração para evidenciar as regiões que contém proteínas. Ao 
final, não foi possível observar a distância percorrida no gel pela proteína estudada. 
 
 
 
 
 
 
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2. INTRODUÇÃO 
Ao se trabalhar com uma proteína no laboratório, uma das etapas mais importantes é 
mostrar a presença da proteína em questão no seu substrato, e alguns casos, onde se requer 
uma alta pureza, mostrar a presença exclusiva da proteína em questão, e um dos métodos mais 
apropriados e eficientes para esse fim é a eletroforese. 
A eletroforese é uma técnica analítica que descreve a migração de uma partícula 
carregada sob a influência de um campo elétrico. A maioria das biomoléculas (incluindo as de 
interesse para esse experimento, que são as enzimas e proteínas) possuem grupos ionizáveis e, 
consequentemente, uma carga resultante que depende do pH do meio (como verificado 
teoricamente). Dessa forma, ao submetermos essas macromoléculas a um campo elétrico, elas 
irão migrar para o cátodo ou ânodo de acordo com sua carga resultante.[1] 
Atualmente, várias técnicas de eletroforese são utilizadas, cada uma aplicada a uma 
finalidade diferente, que se resumem, em geral, em cinco passos: preparação do gel, 
preparação da amostra, aplicação da amostra, corrida no gel e coloração. 
Um dos géis mais comuns para este fim e também utilizado neste experimento é o gel 
de poliacrilamida, proveniente da reação de polimerização via radical livre entre monômeros 
de acrilamida conjunta a bis-acrilamida, iniciada pelo tetrametiletilenodiamida (TEMED) que 
funciona como um estabilizador e acelerador de formação dos radicais livres, que reagem 
então com o monômero de acrilamida. [2] 
A técnica utilizada nesse experimento se chama SDS-PAGE (Sodium Dodecyl 
Sulphate - Polyacrylamide Gel Electrophoresis, ou seja, eletroforese de gel de poliacrilamida 
com SDS), que consiste em separar as proteínas pelo seu tamanho, consequentemente 
possibilitando a determinação de sua massa molecular. A função do SDS (Dodecil sulfato de 
sódio) é ligar-se à proteína após a quebra das pontes dissulfeto das ligações terciárias e 
desnaturá-la. Essa quebra é ocasionada pelo aumento de temperatura na presença de 
β-mercaptoetanol, responsável pela quebra das pontes supracitadas. O corante bromofenol é 
aplicado de forma que a corrida eletroforética possa ser acompanhada visualmente. A amostra 
é aplicada sob o gel de empilhamento, cuja função é concentrar a amostra de proteínas para 
formar pequenas bandas antes da entrada no gel de separação. 
 
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Figura 2: Ilustração do aparato e esquematização do funcionamento do SDS PAGE. [3] 
 
No caso do presente experimento, diversas proteínas foram aplicadas nos poços do gel 
para visualização didática das diferentes colunas formadas de acordo com o peso molecular. 
Ao final do processo, colore-se o gel com uma solução de Comassie Blue e descolore-se com 
uma solução de descoloração, cuja função é remover o corante que não se ligou ao gel. 
Uma solução padrão de pesos moleculares é adicionada juntamente ao gel para servir 
de comparação, a solução padrão utilizada foi a C1992 ColorBurst™ Electrophoresis Marker, 
sua marca deixada sobre o gel é retratada na figura 3. Ela é composta por violeta de miosina, 
BSA, GDH (enzima Glicose Desidrogenase), ADH (hormônio Vasopressina), anidrase 
carbónica, inibidor de tripsina, lisozima (proteína), aprotinina (proteína), Tris (composto 
orgânico tris(hidroximetil)aminometano), SDS e formamida (amida derivada de ácido 
fórmico). Cada composto possui um peso molecular e cor diferentes, marcando o gel nas 
regiões que se aglomeram. Desse modo, pode ser usado como medida para determinar 
aproximadamente o peso molecular do composto de estudo. [4] 
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Figura 3: Marcas no gel de eletroforese produzida pela solução padrão utilizada. [6] 
A acrilamida é um composto orgânico com a presença de uma amida. Submetida a um 
processo de polimerização de adição ela se transforma em poliacrilamida, unindo os 
monômeros de acrilamida entre si. O gel de poliacrilamida é preparado e moldado como uma 
matriz contínua de ligação cruzada, em vez de ser moldado na forma de esferas do gel como 
na cromatografia em coluna. Em uma variação da eletroforese com gel de poliacrilamida, a 
amostra de proteína é tratada com o tensoativo dodecil sulfato de sódio (SDS), antes de ser 
aplicada ao gel. A estrutura do SDS é conforme a imagem à seguir: 
 
Figura 4: Estrutura do SDS. 
 
O ânion liga-se fortemente às proteínas via adsorção não-específica. Quanto maior a 
proteína, mais do ânion ela adsorverá. O SDS desnatura completamente as proteínas, 
rompendo todas as interações não-covalentes que determinam as estruturas terciária e 
quaternária. Isso significa que as proteínas com subunidades podem ser analisadas assim 
como as cadeias polipeptídicas componentes. Todas as proteínas em uma amostra têm uma 
carga negativa como resultado da adsorção do SO​3​- aniônico. As proteínas também terão 
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aproximadamente o mesmo formato, que será o de uma espiral aleatória. Na SDS-PAGE, a 
acrilamida oferece mais resistência a moléculas grandes do que às pequenas. Como o formato 
e a carga são aproximadamente os mesmos para todas as proteínas da amostra, o tamanho da 
proteína se torna o fator determinante na separação - as proteínas pequenas se movem mais 
rapidamente do que as maiores. Do mesmo modo que a cromatografia de peneira molecular, o 
SDS-PAGE pode ser utilizado para estimar os pesos moleculares de proteínas pela 
comparação da amostra com amostras-padrão. Para a maioria das proteínas, o log do peso 
molecular está linearmente relacionado à sua mobilidade no SDS-PAGE.6 
 
3. PROCEDIMENTO EXPERIMENTAL 
 
3.1. Preparação das amostras para gel SDS-PAGE 
As amostras foram misturadas com tampão com sal NaCl para os procedimentos de 
cromatografia de troca iônica, assim, o sal precisava ser retirado antes de realizar a 
eletroforese. Para isso, foi utilizada uma membrana de diálise que em água retiraria o sal das 
amostras. 
Inicialmente, a membrana a ser utilizada foi tratada pelos técnicos. Então, fazendo a 
manipulação com luvas, passou-se a membrana por água destilada fria e, utilizando uma 
presilha de plástico, lacrou-se bem uma das extremidades da membrana de diálise. Assim, 
transferiu-se o volume total de amostra (frações purificadas por cromatografia iônica) na 
membrana e foi lacrada em sua outra extremidade com o auxílio de outra presilha plástica. A 
membrana foi colocada em um béquer com água fria e mantida sob refrigeração. 
 
3.2. Preparação do gel de separação de SDS-PAGE 
A princípio, as placas de vidro de eletroforese foram limpas com álcool propílico e 
montadas devidamente em seu suporte. 
Em seguida, adicionou-se 4,0 mL de água destilada, 100 μL de SDS, 3,33 mL da 
solução 1 (acrilamida, N’N’bis metilenoacrilamida e água destilada), 2,5 mL da solução 2 
(Tris 1,5 M), 5 μL de TEMED e 50 μL de persulfato de amônio em um tubo falcon de 15 mL, 
homogeneizando vagarosamente com a pipeta volumétrica. Essa mistura foi transferida para 
as placas de vidro até o limite pré-estabelecido pelo grupo. O volume restante da placa foi 
preenchido com água para que o gel não tivesse contato com o oxigênio e fosse polimerizado. 
Obtendo a amostra restante no tubo falcon como parâmetro, após aproximadamente 
20 minutos notou-se que o gel havia sido polimerizado e então a água foi retirada e às placas 
foram secas com papel filtro, tomando cuidado para não ferir o gel. 
 
 
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3.3. Preparação do gel de empilhamento de SDS-PAGE 
Adicionou-se 3,5 mL de água destilada, 50 μL de SDS, 0,65 mL da solução 1 
(acrilamida, N’N’bis metilenoacrilamida e água destilada), 1,25 mL da solução 3 (Tris 0,5 
M), 5 μL de TEMED e 25 μL de persulfato de amônio em um tubo falcon de 15 mL, 
homogeneizando vagarosamente com a pipeta volumétrica. Essa mistura foi transferida para 
as placas de vidro até o limite e colocou-se o pente para que o gel não tivesse contato com o 
oxigênio e assim fosse polimerizado. O sistema foi refrigerado por uma semana. 
 
3.4. Desnaturação das proteínas 
As amostras de lisado, obtido anteriormente, foram dialisadas e adicionadas 100 μg 
em eppendorfs. 100 μg de hemoglobina e albumina bovina (BSA) foram adicionadas em 
outros dois eppendorfs. Foi adicionado o tampão da amostra até completar o volume de 25 
μL em cada eppendorf. O tampão era composto por 3,55 mL de água destilada, 1,25 mL de 
“solução C” (composição desconhecida), 2,5 mL de Glicerol, 2 mL de SDS 100g/L, 5 g/L de 
Azul de bromofenol e 0,05 mL de β-mercaptoetanol. Todos os tubos foram levados ao banho 
fervente por 10 minutos para serem utilizados posteriormente. 
 
3.5. Eletroforese 
O pente foi retirado da superfície do gel e as amostras e o padrão foram pipetadas nas 
canaletas do gel com o auxílio de um micropipetador. Aplicou-se às amostras nos poços 
seguindo esta ordem: 10 μL de amostra dialisada, 10 μL de amostra dialisada, 10 μL de 
hemoglobina, 5 μL de BSA, 10 μL de BSA, 10 μL ​de lisado, e por fim, 5 μL do padrão de 
peso molecular. Completou-se a cuba com a solução tampão até a marca indicada para duas 
placas. A placa de gel fora colocada na cuba de corrida (Mini Protean Tetra System – 
BIO-RAD) e em seguida a cuba fora conectada a fonte Power-Pac Universal (BIO-RAD) e 
assim realizada a eletroforese a 100 V por volta de 40 minutos. Após desligado, o gel foi 
retirado do equipamento e do suporte. Em seguida foi cuidadosamente retirado das placas de 
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vidro e transferido para uma placa de Petri, obtendo assim um gel com as amostras “corridas” 
e sem coloração. 
O gel foi submerso na solução de coloração, que contém 0,1 g de Azul de Comassie 
R, 40 mL de metanol, 10 mL de ácido acético e 50 mL de água destilada. Foi levado ao 
microondas por 30 segundos. Então, foi transferido para a solução de descoloração, contendo 
40 mL de metanol, 10 mL de ácido acético e 50 mL de água destilada. E, por fim, o gel foi 
levado novamente ao microondas por mais 30 segundos até estar descolorido. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
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4. RESULTADOS 
Após a realização da desnaturação das proteínas, seguido de eletroforese em SDS- 
PAGE em que foi feita a corrida das amostras por 40 minutos com consecutivos processos de 
coloração e descoloração, o gel foi transferido para placa de Petri e lavado com água 
destilada para visualização das bandas das proteínas, o que pode ser observado na Figura 5 ao 
mostrar a aparência do gel no fim dos procedimentos. É possível perceber as pequenas linhas 
coloridas criadas pelo padrão na região direita da imagem. No centro há faixas feitas pela 
Hemoglobina e BSA. 
 
 
Figura 5: Aparência do gel após o final dos procedimentos. 
 
Cada poço do gel recebeu uma solução diferente, com as ordens descritas a seguir: 
 
● Poço 1: 10 μL de dialisada - preparado pelo grupo 
● Poço 2: 10 μL de dialisada - preparado pelo grupo 
● Poço 3: 10 μL de hemoglobina 
● Poço 4: 5 μL de solução de Albumina Sérica Bovina (BSA) 
● Poço 5: 10 μL de solução de Albumina Sérica Bovina (BSA) 
● Poço 6: 10 μL de lisado - preparado por técnicos 
● Poço 7: 5 μL de solução padrão de peso molecular 
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Ao analisar o gel, observa-se as seguintes bandas: banda da solução padrão de peso 
molecular correspondente ao último poço e tem-se a presença de uma banda discreta de 
hemoglobina e BSA. Nota-se a ausência de todas as outras bandas correspondentes. 
Desse modo, não foi possível observar as bandas da proteína purificada pelo grupo, o 
extrato bruto do grupo, nem a purificada pelos técnicos. Apresentando apenas a marca da 
solução padrão (Figura 5), uma marca de hemoglobina e uma marca da presença do BSA, 
tem-se que a concentração de ​α​-glicosidase após a realização da eletroforese é muito baixa, 
impedindo que a mesma pudesse ser identificada ou a ocorrência de algum erro sistemático 
em todo experimento provavelmente gerado nas concentrações das soluções preparadas sendo 
de proteínas ou tampão, levando em consideração que a solução padrão percorreu o gel de 
forma esperada gerando várias marcações. 
 
 
 
 
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5. DISCUSSÃO 
 
A eletroforese de proteínas é um método de purificação que visa separar as proteínas 
presentes na amostra em frações de acordo com suas respectivas cargas elétricas e seu peso 
molecular. O método utiliza forças eletroforéticas e eletroendosmóticas, onde um potencial 
elétrico é gerado pelo pólo positivo (ânodo) e outro pelo pólo negativo (cátodo), promovendoassim a migração proteica, e consequentemente gerando diferentes bandas. Sob essas 
condições, o deslocamento da partícula é resultado da carga efetiva, da molaridade do tampão 
e da resistência do meio usado como suporte. Como as proteínas possuem cargas positivas e 
negativas, o movimento delas no gel é diretamente proporcional à carga da partícula e 
inversamente proporcional à viscosidade do meio. 
Um equipamento de eletroforese consiste basicamente em dois itens: uma fonte de 
tensão e uma unidade de eletroforese. A unidade de eletroforese pode ser vertical (que será 
utilizada nesse experimento e é aplicada para proteínas) ou horizontal (utilizada para ácidos 
nucleicos). Nessa unidade também estará confinado um gel de poliacrilamida, proveniente da 
reação de polimerização de monômeros de acrilamida na presença de bis-acrilamida (que são 
duas moléculas de acrilamida ligadas por um grupo metileno, utilizada como agente de 
cross-linking), dado pela reação global abaixo: 
 
 
Figura 1: Reação global de polimerização da acrilamida e bisacrilamida, utilizando o TEMED como iniciador. 
[5] 
 
É importante ressaltar que a amostra usada no experimento não foi aplicada 
diretamente no gel de separação e sim sob uma camada de gel mais poroso, conhecido como 
gel de empilhamento, onde se localizam as cavidades na qual são injetadas as amostras. O 
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objetivo do gel de empilhamento é concentrar a amostra da proteína para formar bandas finas 
antes de entrar no gel de separação. Nesse experimento, sete amostras foram colocadas no gel, 
sendo elas: solução padrão, solução de proteína purificada e lisado preparado por técnicos, 
solução purificada pelo grupo, lisado da amostra de interesse, Albumina Sérica Bovina (BSA) 
e hemoglobina. As soluções padrão, a BSA e a hemoglobina serviram de parâmetro para 
identificar se a metodologia foi executada da forma correta. 
Como visto nos resultados acima, não foi possível identificar as bandas do lisado e da 
amostra purificada preparado pelo grupo. A quantidade mínima de proteína necessária para 
aparecer no gel utilizando o corante Azul de Comassie é de 0,1 μg (ou 100ng) de proteína. [6] 
Desse modo, pode-se levantar a hipótese de que não atingimos a quantidade mínima de 
proteínas para a correta identificação do gel. Outras hipóteses consideradas seriam a ausência 
de proteínas ativas na amostra ou mesmo algum erro experimental. 
Com esse experimento, foi possível desenvolver técnicas e conceitos indispensáveis 
na identificação de proteínas. O conhecimento dos principais componentes de cada fração 
protéica isolada durante a realização da eletroforese é de suma importância para a 
interpretação dos resultados e, consequentemente, para realização de outros procedimentos. 
 
6. REFERÊNCIAS 
[1] WILSON, Keith; WALKER, John. ​Principles And Techniques Of Biochemistry And 
Molecular Biology​. 7. ed. New York: Cambridge University Press, 2010. 
[2] Sigma Aldrich. ​N,N,N′,N′-Tetramethylethylenediamine​: ​BioReagent, suitable for 
electrophoresis, ~99%. Disponível em: 
<https://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/t9281?lang=pt®ion=BR>. Acesso 
em: 29 nov. 2018. 
[3] Centro de Ciência Júnior. ​SDS-PAGE ​. Disponível em: 
<http://www.centrocienciajunior.com/miudos_graudos/vamosfalar01.asp?id=810>. Acesso 
em: 21 nov. 2018. 
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[4] Sigma Aldrich. ​ColorBurst™ Electrophoresis Marker: C1992​. Disponível em: 
<https://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/c1992?lang=pt®ion=BR>. Acesso 
em: 27 nov. 2018 
[5] ThermoFisher Scientific. ​Overview of Protein Electrophoresis​. Disponível em: 
<https://www.thermofisher.com/br/en/home/life-science/protein-biology/protein-biology-lear
ning-center/protein-biology-resource-library/pierce-protein-methods/overview-electrophoresi
s.html>. Acesso em: 21 nov. 2018. 
[6] WILSON, Keith; WALKER, John. ​Electrophoretic techniques: Detection, estimation 
and recovery of proteins in gels​. In: WILSON, Keith; WALKER, John. Principles and 
Techniques of Biochemistry and Molecular Biology. 7. ed. New York: Cambridge University 
Press, 2010. cap. 10, p. 417-419. 
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