Biotec PCR Técnicas de Biologia Molecular

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NÚCLEO: ESTÁCIO LITERATUS 
Técnicas de Biologia 
Molecular 
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PCR 
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PCR Reação em Cadeia da Polimerase 
• Diagnóstico de doenças 
• Biologia Forense 
• Engenharia Genética 
 
• A técnica de PCR (polymerase chain reaction - reação 
em cadeia pela polimerase) baseia-se no processo de 
replicação de DNA que ocorre in vivo. 
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MATERIAIS 
• Pequenas quantidades do DNA alvo, um tampão salino 
contendo a polimerase, oligonucleotídeos iniciadores 
(primers), os quatro desoxinucleotídeos constituintes do DNA 
e o cofator Mg2+ 
 
EQUIPAMENTO  TERMOCICLADOR 
 
 Um ciclo de PCR consiste nos seguintes passos: 
1. Desnaturação 
2. Hibridização 
3. Extensão 
Estácio - Literatus 7 
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1. DESNATURAÇÃO TÉRMICA 
 
 A temperatura elevada (geralmente > 90ºC) 
separa a cadeia dupla de DNA em dois 
filamentos, sendo este processo conhecido 
como “desnaturação”. 
 
Os dois filamentos de DNA são mantidos por 
ligações de hidrogênio que quebram-se a altas 
temperaturas, ao passo que as ligações entre 
as moléculas de fosfato e desoxirribose, 
permanecem intactas. 
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2. HIBRIDIZAÇÃO 
 
 O objetivo da PCR não é replicar a cadeia inteira de DNA, mas apenas 
replicar a sequência de interesse (normalmente com tamanhos entre 100 
e 600 pares de bases). 
 
 Os iniciadores (ou primers) marcam as extremidades da sequência alvo: 
estes iniciadores são curtas sequências sintéticas de nucleotídeos, entre 
20 e 30 bases. 
 
 
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• Numa reação de PCR são incluídos dois primers, um para cada cadeia 
simples de DNA que foi produzida durante o passo de desnaturação. 
 
• O início da sequência de DNA alvo é marcada pelos primers que se 
ligam (hibridizam) com a sequência complementar. 
 
• A temperatura de hibridização normalmente encontra-se entre 40 
ºC e 65 ºC, dependendo do comprimento dos primers e da sua 
sequência. 
 
• A escolha criteriosa desta temperatura permite que estas sequências 
iniciadores se liguem à sequência alvo com elevada especificidade. 
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3. EXTENSÃO 
 
 Após a ligação dos primers ou iniciadores às sequências 
complementares de DNA, a temperatura eleva-se a aproximadamente 
72 ºC e a enzima Taq polimerase replica a cadeia de DNA. 
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• A Taq polimerase é uma polimerase de DNA termo-estável 
recombinante do organismo Thermus aquaticus, que, ao contrário de 
outras polimerases, se mantém ativa a temperaturas elevadas. 
 
• O processo de síntese é iniciado numa zona com cadeia dupla (onde 
estão ligados os primers), incorporando os nucleotídeos 
complementares à sequência alvo e utilizando as bases nitrogenadas 
em solução. 
 
• A extensão inicia-se sempre no extremo 3’ do primer, criando uma 
cadeia dupla a partir de cada uma das cadeias simples. A Taq 
polimerase sintetiza exclusivamente na direção 5’ para 3’. 
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 O processo envolvendo estes três passos 
pode ser repetido várias vezes (25 a 30 
ciclos), sendo possível aumentar, em cada 
ciclo, duas vezes a concentração de DNA 
pré-existente. Em teoria, se for possível 
levar a cabo 25 ciclos de amplificação 
seguidos, a concentração de DNA 
aumentaria 225 vezes, embora, na prática, 
devido a alguma ineficiência no processo 
de amplificação, esse aumento fique por 
um milhão de vezes. 
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Termocicladores 
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SÍNTESE QUÍMICA AUTOMÁTICA DE DNA 
MÉTODO DOS FOSFOAMIDITOS 
(FOSFITO TRIESTER) 
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DESBLOQUEIO 
ACOPLAMENTO 
OXIDAÇÃO 
CAPPING 
Detritilação 
Ligação do novo Fosfoamidito 
Fosfito - Fosfato 
Adição de grupos acetil 
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Desbloqueio e purificação dos oligos 
• Desbloqueio – incubação com hidróxido de amomium à 55ºC por 
mais de 2 horas 
 
• Purificação- 
 1 – Simples dessalinização – cromatografia de filtração molecular 
em gel : mini-colunas. 
 2 – HPLC 
 3 - Eletroforese em gel de poliacrilamida desnaturante 
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MONÔMERO FOSFOAMIDITO 
CYANOETHYL – DIISOPROPILAMINO AMIDITO 
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