Bioquímica prática

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Bioquímica prática 
TAMPÕES
Tampões são soluções aquosas resistentes a variações de ph quando pequenas quantidades de ácido ou base são adicionadas ao meio. São misturas de ácidos de Bronsted (capazes de doar H pro meio ) e bases de Bronsted (capazes de captar H do meio)
A capacidade tamponante máxima ocorre no ph correspondente ao pka da solução , nesse ph a quantidade do ácido se iguala a quantidade de sua base conjugada (50% para cada). A variação de ph vai ser mínima quando um ácido de Arrhenius ( que em solução aquosa se dissocia liberando H+) ou base de Arrhenius ( se dissocia liberando OH-) for adicionada ao meio , por o sistema tampão é capaz de reduzir o nível de hidrogênio e hidroxilas livres no meio
A eficiência do sistema tampão também depende da concentração do ácido e da base conjudada.
Classificação dos ácidos :
Forte – se dissocia completamente em meio aquoso liberando água (HCl, HN03, H2SO4)
Fraco – dissocia-se parcialmente e no valor de ph correspondente ao pka 50% das moléculas estão dissociadas e 50% na forma protonada ( ácido acético)
Leitura de ph – peagâmetro , fitas de papel, indicadores . 
Em grandes quantidades e concentração ... 
Quando o ácido é adicionado ao meio , a base conjugada capta os hidrogênios livres , se protonando , quando base é adicionada ao meio o ácido libera H+ pro meio neutralizando as hidroxilas livres no meio. 
O ph sofre variação.
Na experiência na qual se sopra o tudo de ensaio , ao soprar se doa gás carbônico ao meio que combinado com a água forma o íon carbonato que libera H+ pro meio e protona as moléculas desprotonadas diminuindo o ph da solução . 
O tampão TRIS é formado pelo par TRIS e TRIS protonado pelo H+ do ácido clorídrico e baseado no principio de Le Chatelier vai manter a faixa do ph proporcional a quantidade de ácido ou base adicionada ao meio . 
2 – Caracterização de proteínas 
Ninhidrina – reage com o grupo amino livre dos aminoácidos, peptídeos ou proteínas dando origem ao produto purpura de Ruhemann de cor azul roxeada.]reação positiva = azul , reação negativa = coloração esbranquiçada.
A ninhidrina é um agente oxidante poderoso e em reação com prolina e hidroxiprolina forma um produto amarelado. 
Biureto – caracterização de ligação peptídicas , da positiva para proteínas e peptídeos com três ou mais resíduos de aminoácido.A coloração lilás ou violeta indica a presença de ligações , proporcional a concentração de peptídeos e proteínas da amostra . *biureto é originado da decomposição da ureia quando sujeita ao aquecimento.
Pauly – indicativo da presença dos aminoácidos tirosina e histidina. Histidina = cor amarela , tirosina = cor vermelha, ambas = cor alaranjada .Reação com o grupo imidazol da histidina e hidroxila da tirosina.
Xantoproteica – indicativo da presença de aminoácidos aromáticos como fenilalanina , triptofano e tirosina . Formando uma cor alaranjada resultante da formação de um nitrocomposto após o aquecimento do HNO3, e do amoníaco concentrado que reagem com o fenol .
Sakaguchi – Indicativo da presença de arginina o a-naftol e o hipoclorito de sódio reagem com o grupo guanidina da arginina dando uma cor avermelhada proporcional a sua concentração.
Millon- reação indicativa da presença de tirosina na amostra , dando produto de cor avermelhanda quando a sua hidroxila fenólica reage com o mercuro do reativo de Millon . Reação negativa da origem a um produto de cor esbranquiçada semelhante a coagulação da clara de ovo. 
Enxofre – Presença de aminoácido sulfurado como a cisteína e metionina a partir da reação do acetado de chumbo com o enxofre desses aminoácidos dando origem ao sulfato de chumbo de cor amarronzada. 
Solubilização- A solubilidade das proteínas aumentam com a presença de sal no meio, já uma solução de sulfato de amônio saturado retira a água da proteína e a torna insolúvel 
3 - Propriedade das enzimas I , II e III 
Influência da temperatura – enzimas tem uma temperatura ideal para sua atividade máxima, quando mais distante dessa temperatura menos sua atividade, ou seja , mais inativa. 
Influência do Ph- a enzima perde sua propriedade catalítica quanto mais longe de seu Ph ótimo. 
Ph alcalino não é o ph ótimo, a reação com lugol apresenta uma coloração azul , Ph ácido desnatura a enzima ela fica sem atividade e a reação também mostra coloração azul , já no ph próximo ao ph ótimo a coloração é diferente de azul e proporcional a atividade enzimática.
Especificidade enzima-substrato : as enzimas clivam as ligação de forma catalítica específica, de modo que cada enzima é específica para seu substrato que se encaixa no sítio ativo da enzima se ligando a aminoácidos específicos.
Influência da concentração – quanto maior a concentração do substrato mais velocidade da reação catalítica da enzima.
Benedict – verifica o potencial redutor das substâncias . Coloração azul = reação negativa , não redutor , coloração laranja = reação positiva , é redutor.( monossacarídeos como a glicose são redutores)(oligossacarídeos – maltose , lactose , com exceção da sacarose são todos redutores) (polissacarídeos – não são redutores – amido) a mudança de cor é proveniente da redução do cobre do benedict pelo OH livre do açúcar (como a sacarose não tem OH livre não há mudança de cor)
Iodo não cora carboidrato de cadeia pequena.
Inibição competitiva- o inibidor competitivo se assemelha a estrutura do substrato especifico da enzima competindo pela ligação com o sítio ativo, num processo reversível. Havendo mudança na cor do indicador vermelho de fenol (amarelo – meio neutro) (rosa – meio alcalino) 
Inibição não competitiva- o inibidor vai se ligar a enzima em síteos chamados alostéricos , o meio continua alcalino (cor rosa) 
4 – Caracterização de Carboidratos 
Molish – evidenciar a presença de carboidratos em uma solução (mono , oligo e polissacarídeos) . a Formação de uma anel violeta é decorrente da desidratação pelo ácido sulfúrico das pensoses em furfural e das hexoses em hidroximetilfurfural que combinam com os fenóis originando compostos coloridos 
Iodo – diferenciação de polissacarídeos de oligo e mononosacarídeos que não reagem com o iodo. Enquanto os poli como o amido originam uma cor azul e o glicogênio marrom-avermelhada.
Tollens – diferenciação de açúcares redutores de não redutores. Açucares redutores reduzem a prata amoniacal a prata metálica que a adere as paredes do tubo
Benedict – Diferencia açucares redutores de não redutores , os açucares redutores monossacarídeos e oligossacarídeos – com exceção da sacarose , reduzem o cobre do reativo de Benedict em óxido cuproso vermelho, já os açúcares como os oligossacarídeos não realização essa redução
Hidrolise ácida – oligo e polissacarídeos são quebrados em ácido com aquecimento em unidades menos, ou seja , monossacarídeos , juntamente com Benedict a reação ficará vermelha indicando a presença de monossacarídeos que são redutores .
Barfoed – Diferenciação de oligo e mono pela redução do íon cúprico, que ocorre mais rápida com monossacarídeos .
Saliwanoff- diferenciação de aldoses (amarelo) e cetoses(vermelho intenso) . As cetoses são rapidamente desidratadas em derivados do furfural que reagem com o resocinol originando um complexo de cor avermelhada . 
4 - Separação da caseína e Lactose do leite 
4.1 – Precipitação da caseína e separação do soro 
Com adição de ácido acético se altera o ph do meio , chegando-se no pi da caseína em que há equilíbrio de cargas , ela se torna insolúvel se se precipita , ph em torno de 4,6 .
4.2 – Solubilidade 
Água – insolúvel, diferença de polaridade 
Etanol – insolúvel 
NaOH – solúvel , a proteína reage com o metal pesado formando um complexo solúvel- caseinato de sódio que se solubiliza .
As proteínas são solúveis em metais alcalinos e insolúveis em alcalinos terrosos .
Molish – indicação do açúcar do leite – lactose = galactose + glicose (anel violeta)
Benedict – a lactose é um oligossacarídeo redutor após o aquecimento forma um precipitadovermelho tijolo.
5- Caracterização de lipídeos 
Solubilidade 
Água – isolúvel
Acetona – solúvel 
Alcool – parcialmente solúvel (parte polar e apolar)
Saponificação (hidrólise alcalina) 
Gordura + base = sal de acido graxo + glicerol 
Com adição de ácido , a base é neutralizada e os ácidos graxos insolúveis são separados . (anel insolúvel) 
Neutralização de ácidos graxos 
Adição de NaOH no tudo contendo os ácidos graxos após o aquecido os torna solúveis (sabão) voltando a fazer espuma.
Libermann-Burchard 
Coloração verde = presença de colesterol 
O colesterol é uma molécula cíclica ao adicionarmos ácido ele dissocia em SO3- e se encaixa no anel do colesterol causando mudança de cor . 
Kreis 
Coloração rosa , devido a reação da floroglucina com o derivado fenólico do produto de ransificação 
Positiva – avermelhada 
Negativa – amarela