MDA-Edman

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MATERIAL DE APOIO DIDÁTICO – BIOQUÍMICA I – PROF. GUSTAVO – PASTA 178
DETERMINAÇÃO DA SEQÜÊNCIA PRIMÁRIA DE PROTEÍNAS PELO 
MÉTODO DE EDMAN
Todas as operações são realizadas na proteína pura, tendo alguns passos 
preliminares:
1. Determinação ou estimativa da massa molecular: pode ser feita de várias 
formas: MS (espectrometria de massa), o método mais preciso, SDS-PAGE 
(eletroforese desnaturante em poliacrilamida na presença de SDS) ou 
filtração em gel. Nestes dois últimos casos, utiliza-se padrões (proteínas com 
massa molocular conhecida).
2. Se a proteína for conjugada, o grupo prostético deve ser removido.
3. Proteínas com estrutura quaternária: devem ser dissociadas e cada cadeia 
seqüenciada em separado. Para isso podem ser usadas várias alternativas: 
alterações do pH ou da força iônica, detergentes, aquecimento “suave”, ou 
ciclos de congelamento/descongelamento. Se as cadeias forem unidas por 
ligações dissulfeto, estas devem ser quebradas por adição de um agente 
redutor tiólico como beta-mercaptoetanol ou ditiotreitol (DTT) e bloqueio, por 
exemplo com ácido iodoacético (IAA).
4. Determinação da composição de aminoácidos: o método padrão consiste na 
hidrólise ácida, feita com HCl 6N a 110oC por 12 a 36 horas, sob atmosfera 
de nitrogênio. Essa condição agressiva é capaz de clivar (hidrolisar) todas as 
ligações peptídicas sem promover racemização (L ->D ou D->L). Há alguns 
problemas com cadeias laterais, como a do Trp, Gln a Asn. O hidrolisado 
obtido e analisado com um seqüenciador automático utilizando cromatografia 
de troca iônica e ninidrina ou PITC, por exemplo. Com a medida da 
quantidade de aminoácido detectado e a massa molecular da proteína, 
permite calcular a freqüência de cada resíduo. Por exemplo, se 0,13 mM de 
Leu (17,1 mg) foram recuperadas de 0,01 mM da proteína (150 mg de 
material com massa molecular de 15.000), a proteína tem 13 resíduos de 
Leucina (0,13/0,01). Veja a figura abaixo, exemplo de uma determinação de 
aminoácidos:
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DETERMINAÇÃO DA SEQÜÊNCIA
Depois dos passos preliminares vistos acima, é necessário saber quais são 
os resíduos N e C terminais:
C-terminal: 
Método 1: A Hidrazina reage com o grupo carbonila de cada ligação peptídica, 
clivando a ligação e produzindo o derivado hidrazina de cada resíduo, com 
exceção do C-terminal, que será liberado como aminoácido livre.
Método 2: A Carboxipeptidase é uma enzima proteolítica que cliva a última 
ligação peptídica, agindo de tal forma que libera o resíduo C-terminal. O 
resíduo liberado pode ser identificado por reação com o PITC (Fenil-iso-
tiocianato) ou reagente de Edman (ver a reação mais adiante).
N-terminal:
O resíduo identificado após a reação com o PITC (Fenil-iso-tiocianato) ou 
cloreto de Dabsil (ver a reação abaixo). Promove-se a hidrólise ácida para 
liberar o resíduo modificado, e é feita sua identificação.
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Figura. Perfil de tempo de retenção de derivados PTH (fenil-tio-
hidantoína) de aminoácidos após reação com PITC (Fenil-
isotiocianato).
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Resíduos internos:
Na medida em que a reação com o reagente de Edman possibilita a 
liberação do resíduo N-terminal sem clivar outras ligações, a cadeia 
polipeptídica remanescente pode ser tratada novamente com PITC para 
identificar o N-terminal, que corresponde ao segundo resíduo na seqüência 
original, e assim por diante, em uma seqüência chamada “Degradação de 
Edman”. Cada derivado PTH é identificado pelo aparelho.
Com equipamentos automatizados, a eficiência da degradação de Edman 
é limitada a uns 30-40 resíduos. (ver abaixo as reações):
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Figura. Reação com o cloreto de Dabsil, um dos 
métodos para identificação do N-terminal.
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Figura. Reações realizadas por um seqüenciador de aminoácidos 
usando o PITC como reagente.
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Em virtude dessa limitação, a cadeia polipeptídica original deve ser 
fragmentada de diversas formas, porém com especificidade, com o uso de 
reagentes químicos e enzimas. Dessa forma, possibilita-se a formação de 
peptídios seqüenciáveis que, por superposição entre os obtidos pelos diversos 
métodos de corte, permitam deduzir a seqüência original.
Vejamos o exemplo da figura abaixo:
A cadeia original, cortada por Tripsina (ela corta do lado C de resíduos 
básicos: Lys e Arg) permitiu obter três peptídios. Cada um foi separado por 
cromatografia, e seqüenciado. A ordem dos peptídios ainda não é conhecida.
Se a proteína for submetida a outro padrão de hidrólise, como é o caso da 
quimiotripsina, vemos que ela cortou após resíduos de Phe e Trp. Os novos 
peptídios também devem ser separados e seqüenciados.
Como será deduzida a seqüência original? Por sobreposição dos peptídios 
seqüenciados, olhando as seqüências idênticas entre os peptídios obtidos por 
cada método de corte.
Em geral os peptídios são bem mais longos, por isso deve-se apelar para a 
determinação do N e C-terminais, e eventualmente outros métodos de corte.
Veja na figura da página seguinte os padrões de corte: o (C) refere-se ao 
“lado C” do resíduo: a carbonila (C=O), e o (N) ao “lado N”, da amida (NH). É 
importante ressaltar que a tripsina e não faz o corte se o próximo resíduo for 
uma Prolina ou Hidroxi-Prolina, e no caso da pepsina, se a Prolina for o resíduo 
anterior, acontece a mesma coisa. A causa disso é que a Prolina impede o 
acoplamento entre o substrato peptídico e o sítio ativo da enzima.
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Figura. Exemplo de clivagem com proteases e sobreposição para deduzir a 
seqüência original de resíduos
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Veja na figura da próxima página um exemplo com um resumo dos 
procedimentos:
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Figura. Preferências de corte de proteases e 
agentes químicos, em relação à constituição de 
resíduos que compõem a ligação peptídica.
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Um exercício por último, para testar o que foi dado:
Um polipeptídio X foi tratado com tripsina, fornecendo os seguintes peptídios:
Asp-Ser-Phe-Thr-Gln-Arg
Gly-Val-Glu-Phe-Met-Lys
Leu-His-Trp-Ile-Arg
Gly-Pro-Phe
Ala-Tyr-Lys
Quando tratado com Quimiotripsina, forneceu os seguintes peptídios:
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Thr-Gln-Arg-Gly-Pro-Phe
Met-Lys-Leu-His-Trp
Gly-Val-Glu-Phe
Lys-Asp-Ser-Phe
Ile-Arg-Ala-Tyr
O resíduo N terminal foi determinado, sendo Gly.
Qual é a seqüência do polipeptídio?
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