Replicação do DNA

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Replicação do DNA
A complexidade surge na forma de dispositivos enzimáticos para garantir que o nucleotídeo correto seja adicionado e que a informação genética seja transmitida intacta. Erros não corrigidos que surgem durante a síntese do DNA podem ter terríveis consequências, não só porque podem afetar ou eliminar permanentemente a função de um gene, mas também porque a alteração é hereditária.O DNA é a única macromolécula para a qual existem sistemas de reparo; o número, diversidade e complexidade dos mecanismos de reparo do DNA refletem a ampla variedade de injúrias que podem danificá-lo.
Genes bacterianos em geral são identificados utilizando-se três letras minúsculas, em itálico, que muitas vezes refletem a função aparente de um gene. Por exemplo, os genes dna, uvr e rec afetam a replicação do DNA, a resistência aos efeitos nocivos da radiação UV e a recombinação, respectivamente. Onde vários genes afetam o mesmo processo, a letras A, B, C e assim por diante, são adicionadas – p. ex., no dnaA, dnaB, dnaQ, – geralmente refletindo sua ordem de descoberta e não sua ordem em uma sequência de reação. 
Replicação do DNA
Conceito de molde, estrutura que permitiria que as moléculas se alinhassem em uma ordem específica e se ligassem criando uma macromolécula com uma sequência e função específicas. Após a dedução de Watson-Crick sobre a estrutura do DNA, se tornou claro o mecanismo pelo qual o DNA atuava como molde para a replicação e transmissão da informação genética: uma fita é o complemento da outra. As regras estritas do pareamento de bases significam que cada fita fornece um molde para uma nova fita com uma sequência previsível e complementar.
A replicação do DNA segue um conjunto de regras fundamentais.
A replicação do DNA e semiconservativa Cada fita de DNA funciona como molde para a síntese de uma nova fita, produzindo duas novas moléculas de DNA, cada qual com uma fita nova e uma fita antiga. Isso é a replicação semiconservativa. 
O que foi comprovado por Meselson-Stahl, que cultivaram um sepa de E.coli com meio contendo 15N, isótopo pesado, o normal é 14N isótopo leve. Após identificar que o DNA das células ficou 1% mais pesado, foram transferidas para um meio de cultura de isótopo 14N, depois de dobrarem de população. O DNA isolado dessa geração formava uma única banda no gradiente de CsCl, em uma posição que indicava que as moléculas de DNA de dupla-hélice das células-filhas eram híbridas, contendo uma nova fita 14N e uma fita parental 15N. [15N] DNA pesado e [14N] DNA leve pode ser separada por centrifugação até o equilíbrio em um gradiente de densidade de cloreto de césio.
A replicação começa em uma origem e em geral segue bidirecionalmente.
A indicação inicial de que a replicação é um processo altamente coordenado no qual as fitas parentais são simultaneamente desenroladas e replicadas foi fornecido por John Cairns, utilizando autorradiografias. Ele produziu DNA de E.coli radioativo, em um meio contendo timidina marcada com trítio (3H). Quando o DNA foi isolado, espalhado e coberto com uma emulsão fotográfica por várias semanas, os resíduos de timidina radioativos geraram “rastros” de grãos de prata na emulsão, produzindo uma imagem da molécula de DNA. Ele observou que o cromossomo era um único círculo uniforme. O DNA radioativo isolado demonstrou uma volta adicional.
	Cairns concluiu que a volta resultava da formação de duas fitas filhas radioativas, cada uma complementar a uma fita parental. Uma ou ambas as extremidades da volta são pontos dinâmicos, denominados de forquilhas de replicação, onde o DNA parental está sendo desenrolado e as fitas separadas rapidamente replicadas. Os resultados de Cairns demonstraram que ambas as fitas de DNA são replicadas simultaneamente, e variações no seu experimento indicaram que a replicação de cromossomos bacterianos é bidirecional: ambas as extremidades da volta possuem forquilhas de replicação ativas.
Determinar se as voltas de replicação se originam em um único ponto no DNA requer marcações ao longo da molécula de DNA. Elas foram fornecidas por uma técnica chamada de mapeamento de desnaturação, desenvolvida por Ross Inman e colaboradores. Utilizando o cromossomo de 48.502 pb do bacteriófago l, Inman demonstrou que o DNA poderia ser seletivamente desnaturado em sequências extraordinariamente ricas em pares de bases A=T, gerando um padrão reproduzível de bolhas de fitas simples. 
O DNA isolado contendo voltas de replicação pode ser parcialmente desnaturado do mesmo modo. Isso permite que a posição e o progresso das forquilhas de replicação sejam medidos e mapeados, utilizando as regiões desnaturadas como pontos de referência. A técnica revelou que nesse sistema as voltas de replicação sempre se iniciam em um único ponto, chamado de origem. Ele também confirmou a observação inicial de que a replicação é geralmente bidirecional. Para moléculas de DNA circulares, as duas forquilhas de replicação se encontram em um ponto do lado do círculo oposto ao de origem. 
A síntese de DNA segue em uma direção 5՛→3՛e é semidescontínua. Uma nova fita de DNA é sempre sintetizada na direção 5՛→3՛, com a 3՛OH livre como o ponto no qual o DNA é alongado. duas fitas de DNA são antiparalelas, a fita que serve de molde é lida a partir da extremidade 3՛ em direção à extremidade 5՛.
Okazaki descobriu que uma das novas fitas de DNA é sintetizada em pedaços pequenos, atualmente denominados de fragmentos de Okazaki. Esse trabalho levou à conclusão final de que uma fita é sintetizada continuamente e a outra descontinuamente. A fita contínua, ou fita líder, é aquela em que a síntese 5՛→3՛ segue na mesma direção do movimento da forquilha de replicação. A fita descontínua, ou fita retardada, é aquela em que a síntese 5՛→3՛ prossegue na direção oposta da direção do movimento da forquilha. Os fragmentos de Okazaki variam em comprimento desde poucas centenas até poucos milhares de nucleotídeos, dependendo do tipo celular.
O DNA é degradado por nucleases.
As enzimas que degradam o DNA em vez de sintetizá-lo. Essas enzimas são conhecidas como nucleases ou DNases, se forem específicas para o DNA e não para RNA. Cada célula contém várias nucleases diferentes, pertencendo a dois tipos de classes amplas: exonucleases e endonucleases. 
Exonucleases degradam os ácidos nucleicos de uma extremidade da molécula. Muitas operam apenas na direção 5՛→3՛ ou 3՛→5՛, removendo nucleotídeos apenas a partir da extremidade 5՛ ou 3՛, respectivamente, de uma fita de um ácido nucleico de fita dupla ou de um DNA de fita simples. As endonucleases podem iniciar a degradação em sítios internos específicos em uma fita ou molécula de ácido nucleico, reduzindo-a a fragmentos cada vez menores. Poucas exonucleases e endonucleases degradam apenas DNA de fita simples. Há algumas poucas importantes classes de endonucleases que clivam apenas em sequências específicas de nucleotídeos (tais como as endonucleases de restrição tão importantes em biotecnologia.
O DNA é sintetizado por DNA-polimerases
 Purificação e caracterização de uma DNA-polimerase de células de E.coli, uma enzima de um único polipeptídeo atualmente denominada DNA-polimerase I (Mr 103.000; codificada pelo gene polA). Mais tarde, investigadores descobriram que a E. coli contém, pelo menos, quatro outras DNA-polimerases distintas, descritas a seguir.
Estudos com a DNA-polimerases I revelaram características comuns em todas as DNA-polimerases. A reação fundamental é a transferência do grupo fosforil. O nucleófilo é o grupo 3՛-hidroxila do nucleotídeo na extremidade 3՛ da fita em crescimento. O ataque nucleofílico ocorre no fósforo a do desoxinucleosídeo-5՛-trifosfato que chega. O pirofosfato inorgânico é liberado na reação. A reação geral é:
onde dNMP e dNTP são desoxinucleosídeos 5՛-monofosfato e 5՛-trifosfato, respectivamente. A catálise por praticamente todas as DNA-polimerases envolve principalmente dois íons de Mg2+ no sítio ativo. Um desses auxilia a retirar o próton do grupo 3՛-hidroxila, tornando-o um nucleófilomais eficaz. O outro se liga ao dNTP de entrada e facilita sua saída do pirofosfato.
	reação parece prosseguir com apenas uma alteração mínima na energia livre, uma vez que uma ligação fosfodiéster é formada à custa de um anidrido fosfato um pouco menos estável. Entretanto, o empilhamento de bases não covalentes e as interações de pareamento de bases fornecem estabilização adicional ao produto alongado de DNA em relação ao nucleotídeo livre. Além disso, a formação de produtos é facilitada na célula pelos 19 kJ/mol gerados na posterior hidrólise do produto de pirofosfato, pela enzima pirofosfatase.
	Trabalhos recentes com a DNA-polimerase I levaram à definição de duas exigências centrais para a polimerização; Em primeiro lugar, todas as DNA- polimerases precisam de um molde. A reação de polimerização é guiada por uma fita-molde de DNA. onde uma guanina está presente em um molde, um desoxinucleotídeo citosina é adicionado à nova fita, e assim por diante.
Em segundo lugar, as polimerases precisam de um primer (iniciador). Um iniciador é um segmento de fita (complementar ao molde) com um grupo 3՛-hidroxila livre, ao qual um nucleotídeo pode ser adicionado; a extremidade 3՛ livre do iniciador é chamada de terminal do iniciador.
Em outras palavras, parte dessa nova fita já deve estar no lugar: todas as DNA-polimerases só podem adicionar nucleotídeos a uma fita preexistente. Muitos iniciadores são oligonucleotídeos de RNA em vez de DNA, e enzimas especializadas sintetizam iniciadores quando e onde são necessários.
Um sítio ativo de DNA-polimerase tem duas partes. O nucleotídeo que chega é inicialmente posicionado no sítio de inserção. Uma vez que a ligação fosfodiéster
é formada, a polimerase desliza para frente no DNA e um novo par de bases é posicionado no sítio de pós-inserção. Esses elementos estão localizados em um bolso
que se assemelha à palma de uma mão.
	
Após a adição de um nucleotídeo em uma fita de DNA em crescimento, uma DNA-polimerase pode tanto se dissociar como se mover ao longo do molde e adicionar outro nucleotídeo. A dissociação e a reassociação da polimerase podem limitar a taxa de polimerização geral – o processo é geralmente mais rápido quando uma polimerase adiciona mais nucleotídeos sem se dissociar do molde. O número médio de nucleotídeos adicionados antes da dissociação de uma polimerase define sua processividade. DNA-polimerases variam muito em processividade; algumas adicionam apenas alguns poucos nucleotídeos antes de sua dissociação, outras adicionam muitos milhares.
A replicação tem alto grau de precisão
A replicação prossegue com extraordinário grau de fidelidade. Em E. coli, um erro acontece apenas a cada 109 a 1010 nucleotídeos adicionados. Para o cromossomo de E. Coli de aproximadamente 4,6 3 106 pb, isso significa que um erro ocorre apenas uma vez por 1.000 a 10.000 replicações. Durante a polimerização, a diferenciação entre nucleotídeos corretos e incorretos depende não apenas das ligações de hidrogênio que especificam o pareamento correto entre bases complementares, mas também da geometria comum dos pares de bases A═T padrão e G≡C. O sítio ativo da DNA-polimerase I acomoda apenas pares de bases com essa geometria. Um nucleotídeo incorreto pode ser capaz de fazer uma ligação de hidrogênio com uma base no molde, mas ele geralmente não se encaixará no sítio ativo. Bases incorretas podem ser rejeitadas antes que a ligação fosfodiéster seja formada.
Medições cuidadosas in vitro mostraram que as DNA-polimerases inserem um nucleotídeo incorreto para cada 104 a 105 inserções corretas. Esses erros algumas vezes ocorrem porque uma base está brevemente em uma forma tautomérica incomum, permitindo que se ligue por ligação de hidrogênio com um parceiro incorreto. In vivo, a taxa de erro é reduzida por mecanismos enzimáticos adicionais.
Um mecanismo intrínseco a praticamente todas as DNA-polimerases é uma atividade de exonuclease separada 3՛→5՛ que realiza uma dupla verificação em cada nucleotídeo após sua adição. Essa atividade de nuclease permite a remoção pela enzima de um nucleotídeo adicionado recentemente e é altamente específica para pares de bases não correspondentes. Se a polimerase adicionou o nucleotídeo errado, a translocação da enzima para a posição onde o próximo nucleotídeo seria adicionado é inibida. Essa pausa cinética fornece a oportunidade para uma correção. A atividade da exonuclease de 3՛→5՛ remove o nucleotídeo malpareado, e a polimerase reinicia novamente. Essa atividade, conhecida como revisão, não é simplesmente o inverso da reação de polimerização porque o pirofosfato não está envolvido. As atividades de polimerização e revisão de uma DNA-polimerase podem ser medidas separadamente. A revisão aperfeiçoa a precisão inerente da reação de polimerização em 102 a 103 vezes. Na DNA-polimerase I monomérica, as atividades de polimerização e revisão possuem sítios ativos separados no interior do mesmo polipeptídeo.
A precisão medida em E. coli é ainda maior. A precisão adicional é fornecida por um sistema enzimático separado que repara o pareamento de bases malpareado (mismatched) que permaneceu após a replicação. Esse reparo de malpareamento (mismatch) é descrito, junto com outros processos de reparo do DNA. 
A E. coli tem pelo menos cinco DNA-polimerases. A DNA-polimerase I e muito lenta para fazer a replicação sozinha, além disso, se descobriu que muitos genes e proteínas agem na replicação, então ela não age sozinha. A DNA-polimerase II é uma enzima envolvida em um tipo de reparo do DNA. A DNA-polimerase III é a principal enzima de replicação em E. coli. As DNA-polimerases IV e V, estão envolvidas em uma forma incomum de reparo do DNA.
DNA-polimerase I, não é a enzima principal da replicação; em vez disso, ela executa funções de
limpeza durante a replicação, recombinação e reparo. As funções especiais das polimerases são potencializadas por sua atividade de exonuclease 5՛→3՛. Esta atividade está localizada em um domínio estrutural que pode ser separado da enzima por um tratamento com protease fraca. Quando o domínio de exonuclease 5՛→3 é removido, o fragmento remanescente (Mr 68.000), o fragmento grande ou fragmento de Klenow, mantém as atividades de polimerização e revisão. A atividade de exonuclease 5՛→3 da DNA-polimerase I intacta pode substituir um segmento de DNA (ou RNA) pareado com a fita-molde, em um processo conhecido como tradução de corte (nick translation) A maior parte das outras DNA-polimerases não tem a atividade de exonuclease 5՛→3.
A replicação do DNA precisa de muitas enzimas e fatores protéicos. A replicação em E. coli não precisa apenas de uma única DNA-polimerase, mas de 20 ou mais enzimas e proteínas diferentes, cada uma realizando uma tarefa específica. O complexo inteiro foi denominado de sistema de DNA replicase ou replissomo.
O acesso às fitas de DNA que atuam como moldes requer a separação das duas fitas parentais. Isso geralmente é conseguido pelas helicases, enzimas que se deslocam ao longo do DNA e separam suas fitas, utilizando energia química a partir do ATP. A separação das fitas cria um estresse topológico na estrutura helicoidal do DNA, que é aliviado pela ação de topoisomerases. As fitas separadas são estabilizadas por proteínas
de ligação de DNA. Como observado anteriormente, antes das DNA-polimerases poderem começar a sintetizar DNA, iniciadores devem estar presentes no molde – geralmente, pequenos segmentos de RNA sintetizados por enzimas conhecidas como primases. Em última análise, os iniciadores de RNA são removidos e substituídos por DNA; em E. coli, essa é uma das muitas funções da DNA-polimerase I. Após a remoção de um iniciador de RNA e do intervalo ser preenchido por DNA, permanece um corte (nick) no esqueleto de DNA na forma de uma ligação fosfodiéster rompida. Esses cortes são selados por DNA-ligases. Todos esses processos necessitam de coordenação e regulação, uma ação combinada mais bem caracterizada no sistema de E. coli.
A replicação do cromossomo de E. coli prossegueem estágios 
A síntese de uma molécula de DNA pode ser dividida em três estágios: iniciação, alongamento e terminação, diferenciando- se tanto pelas reações que ocorrem como pelas enzimas necessárias. 
Iniciação: A origem da replicação de E. coli, oriC, consiste em 245 pb e contém elementos sequenciais de DNA que são altamente conservados entre origens de replicação bacteriana. Dois tipos de sequências apresentam especial interesse: cinco repetições de uma sequência de 9 pb (sítios R) que funcionam como sítios de ligação para a proteína iniciadora chave DnaA, e uma região rica em pares de bases A═T chamada de elemento de desenrolamento de DNA (DUE). Há três sítios de ligação de DnaA (sítios I), e sítios de ligação para proteínas IHF (fator de integração do hospedeiro) e FIS (fator para estimulação de inversão). 
Pelo menos 10 enzimas ou proteínas diferentes participam da fase de iniciação da replicação. Elas abrem a hélice do DNA na origem e estabelecem um complexo de pré-iniciação para reações subsequentes. O componente crucial no processo de iniciação é a proteína DnaA, um membro da família de proteínas AAA+ ATPase (ATPases associadas a diversas atividades celulares). Muitas AAA1 ATPases, incluindo a DnaA, formam oligômeros e hidrolisam ATP com relativa lentidão. Essa hidrólise do ATP atua como um interruptor mediando a interconversão da proteína entre dois estados. No caso da DnaA, a forma ligada ao ATP é ativa e a forma ligada ao ADP é inativa.
Oito moléculas de proteína DnaA, todas no estado de ligadas ao ATP, se reúnem para formar um complexo helicoidal abrangendo os sítios R e I no oriC. A DnaA tem maior afinidade pelos sítios R do que pelos sítios I e se liga aos sítios R com igual facilidade tanto na forma ligada ao ATP quanto na ligada ao ADP. Os sítios I, os quais ligam apenas à DnaA ligada ao ATP, permitem a diferenciação entre as formas ativas e inativas de DnaA. O enrolamento estreito do DNA para a direita em volta desse complexo introduz um eficaz superespiralamento positivo. A tensão associada no DNA vizinho leva à desnaturação na região DUE, rica em A=T. O complexo formado na origem de replicação também inclui várias proteínas de ligação de DNA – HU, IHF e FIS – que facilitam o enovelamento do DNA.
A proteína DnaC, outra AAA1 ATPase, carrega então proteína DnaB para as fitas de DNA separadas na região desnaturada. Um hexâmero de DnaC, com cada subunidade ligada ao ATP, forma um complexo estreito com a helicase DnaB hexamérica em forma de anel. Essa interação DnaC-DnaB abre o anel de DnaB, em um processo auxiliado por uma interação adicional entre a DnaB e a DnaA. Dois hexâmeros de DnaB em forma de anel são carregados no DUE, cada um em uma fita de DNA. O ATP ligado à DnaC é hidrolisado, liberando a DnaC e deixando a DnaB ligada ao DNA.
O carregamento da helicase DnaB é a etapa-chave na iniciação da replicação. Como uma helicase replicativa, a DnaB migra ao longo da fita simples de DNA na direção 5՛→3՛, desenrolando o DNA ao longo do caminho. As helicases DnaB carregadas nas duas fitas de DNA viajam em direções opostas, criando duas forquilhas de replicação potenciais. Todas as outras proteínas na forquilha de replicação são ligadas direta ou indiretamente à DnaB. A holoenzima de DNA-polimerase III é ligada por meio de subunidades τ; 
À medida que a replicação começa e as fitas de DNA são separadas na forquilha, muitas moléculas de proteínas de ligação de DNA de fita simples (SSB) se ligam e estabilizam as fitas separadas, e a DNA-girase (DNA-topoisomerase II) alivia o estresse topológico induzido à frente da forquilha pela reação de desenrolamento.
A iniciação é a única fase da replicação do DNA que é conhecida por ser regulada, e ela é regulada de modo que a replicação ocorra apenas uma vez em cada ciclo celular. O mecanismo de regulação ainda não é completamente compreendido.
Uma vez que a DNA-polimerase III tenha sido carregada na direção do DNA, em conjunto com as subunidades β (sinalizando a finalização da fase de iniciação), a proteína Hda se liga às subunidades β e interage com a DnaA para estimular a hidrólise de seu ATP ligado. A Hda é mais outra AAA+ ATPase intimamente relacionada à DnaA (seu nome é derivado de homólogo à DnaA). Essa hidrólise do ATP leva à desmontagem do complexo de DnaA na origem. A liberação lenta do ADP pela DnaA e a religação do ATP faz a proteína circular entre suas formas inativa (ligada a ADP) e ativa (ligada a ATP) em uma escala de tempo de 20 a 40 minutos.
O tempo de iniciação da replicação é afetado pela metilação do DNA e pelas interações com a membrana plasmática bacteriana. O DNA oriC é metilado pela Dam metilase, a qual metila a posição N6 da adenina no interior da sequência palindrômica GATC (59) (Dam significa metilação da adenina do DNA – do inglês DNA adenine methylation). A região oriC de E. coli é muito rica em sequências GATC – ela possui 11 delas em seus 245 pb, ao passo que a frequência média de GATC no cromossomo de E. coli, como um todo, é de 1 em cada 256 pb.
Imediatamente após a replicação, o DNA é hemimetilado: as fitas parentais têm sequências oriC metiladas, mas as fitas recentemente sintetizadas não. As sequências oriC hemimetiladas são agora sequestradas pela interação com a membrana plasmática (o mecanismo é desconhecido) e pela ligação da proteína SeqA. Após um tempo, a oriC é liberada da membrana plasmática, se dissocia de SeqA e o DNA deve estar totalmente metilado pela Dam metilase antes que ele possa novamente se ligar à DnaA e iniciar um.
novo ciclo de replicação.
Alongamento A fase de alongamento da replicação inclui duas operações distintas, porém relacionadas: a síntese da fita líder e a síntese da fita retardada. Várias enzimas na forquilha de replicação são importantes para a síntese de ambas as fitas. O DNA parental é inicialmente desenrolado pelas DNA-helicases, e o resultante estresse topológico são aliviados pelas topoisomerases. Cada fita separada é, então, estabilizada pela SSB. A partir desse ponto, a síntese das fitas líder e retardada é completamente diferente.
A síntese da fita líder, a mais direta das duas, começa com a síntese pela primase (proteína DnaG) de um iniciador curto de RNA (10 a 60 nucleotídeos) na origem de replicação. A DnaG interage com a helicase DnaB para realizar essa reação, e o iniciador é sintetizado na direção oposta àquela em que a helicase DnaB está se movendo. Com efeito, a helicase DnaB se move ao longo da fita que se orna a fita retardada na síntese do DNA; entretanto, o primeiro iniciador formado na primeira interação DnaG-DnaB funciona como iniciador da síntese da fita líder de DNA na direção oposta. Desoxirribonucleotídeos são adicionados a esse iniciador por um complexo DNA-polimerase III ligado helicase DnaB presa à fita de DNA oposta. A síntese da fita líder prossegue então continuamente, acompanhando o desenrolamento do DNA na forquilha de replicação.
	A síntese da fita retardada é realizada em fragmentos curtos de Okazaki. Inicialmente, um iniciador de RNA é sintetizado pela primase e, como na síntese da fita líder, a DNA-polimerase III se liga ao iniciador de RNA e adiciona desoxirribonucleotídeos. Nesse nível, a síntese de cada fragmento de Okazaki parece ser direta, mas a realidade é muito complexa. A complexidade reside na coordenação da síntese das fitas líder e retardada. Ambas as fitas são produzidas por um único dímero assimétrico de DNA-polimerase III; isso é conseguido fazendo uma volta na fita retardada de DNA, que coloca juntos os dois pontos de polimerização. 
A helicase DnaB e a primase DnaG constituem uma unidade funcional
no interior do complexo de replicação, o primossomo. A DNA-polimerase III utiliza um conjunto de suas subunidades centrais (a polimerase central) para sintetizar a fita líder continuamente, enquanto o outro conjunto de subunidades centrais realiza o ciclo de um fragmento de Okazaki para o próximo na fita retardada em alça. A helicase DnaB, ligada na frente da DNA-polimerase III, desenrola o DNA, na forquilhade replicação à medida que ele viaja ao longo do molde da fita retardada na direção5՛→3՛.
primase DnaG ocasionalmente se associa à helicase DnaB e sintetiza um iniciador de RNA curto. Uma nova braçadeira β deslizante é, então, posicionada no iniciador pelo complexo carregador de braçadeiras da DNA-polimerase III. Quando a síntese de um fragmento de Okazaki se completa, a replicação para e as subunidades centrais de DNA-polimerase III se dissociam de sua braçadeira b deslizante (e do fragmento completo de Okazaki) e se associam à nova braçadeira. Isso inicia a síntese de um novo fragmento de Okazaki. Como observado anteriormente, o complexo inteiro responsável pela síntese coordenada de DNA na forquilha de replicação é conhecido como replissomo. As proteínas que atuam na forquilha de replicação.
O complexo de carregamento de braçadeira da DNA-polimerase III, que consiste em partes de duas subunidades β ao longo das subunidades γ, δ e δ՛, também é uma AAA+ ATPase. Esse complexo se liga ao ATP e à nova braçadeira β deslizante. A ligação confere tensão à braçadeira dimérica, abrindo o anel em uma subunidade da interface. A fita retardada que acabou de sofrer priming desliza para o interior do anel pela quebra resultante. O carregador de braçadeiras, então, hidrolisa o ATP liberando a braçadeira β deslizante e permitindo que ela se feche em volta do DNA.
O replissomo promove a rápida síntese do DNA, adicionando aproximadamente 1.000 nucleotídeos/s para cada fita (líder ou retardada). Uma vez que um fragmento de Okazaki tenha se completado, seu iniciador de RNA é removido e substituído por DNA pela DNA-polimerase I e o corte (nick) remanescente selado pela DNA-ligase.
A DNA-ligase catalisa a formação de uma ligação fosfodiéster entre 3՛-hidroxila na extremidade de uma fita de DNA e 5՛-fosfato na extremidade da outra fita. O fosfato deve ser ativado por adenilação. As DNA-ligases isoladas de vírus e eucariontes utilizam ATP para esse propósito. As DNA-ligases de bactérias são incomuns pelo fato de muitas usarem NAD+ – cofator que geralmente funciona em reações de transferência de híbridos – como a fonte do grupo de ativação de AMP.
Terminação Por fim, as duas forquilhas de replicação do cromossomo circular de E. coli se encontram em uma região terminal que contém cópias múltiplas de uma sequencia de 20 pb denominada Ter. As sequências Ter são arrumadas no cromossomo para criar uma armadilha na qual a forquilha de replicação possa entrar, mas não sair. As sequências Ter funcionam como sítios de ligação para a proteína Tus (substância de utilização de terminal). O complexo Tus-Ter pode sequestrar uma forquilha de replicação a partir de apenas uma direção.
Apenas um complexo Tus-Ter funciona por ciclo de replicação – o primeiro complexo encontrado por qualquer forquilha de replicação. Uma vez que as forquilhas de replicação opostas geralmente param quando colidem, as sequências Ter não parecem ser essenciais, mas elas podem evitar o excesso de replicação por uma forquilha no evento no qual a outra está atrasada ou interrompida por um encontro com um dano no DNA ou algum outro obstáculo.
Assim, quando qualquer uma das forquilhas de replicação encontra um complexo Tus-Ter funcional, ela para; a outra forquilha para quando encontra a primeira Forquilha (presa). As poucas centenas finais de pares de bases de DNA entre esses grandes complexos proteicos são, então, replicados (por um mecanismo ainda desconhecido), completando dois cromossomos circulares topologicamente interligados (catenados). Os círculos de DNA ligados desse modo são conhecidos como catenanos. A separação desses círculos catenados em E. coli precisa da topoisomerase IV (topoisomerasede tipo II). Os cromossomos separados então se segregam em células-filhas na divisão celular. A fase terminal da replicação de outros cromossomos circulares, incluindo muitos dos vírus de DNA que infectam células de eucariontes, é semelhante.
A replicação em células eucarióticas é semelhante, porém mais complexa.
Elas são maiores, e são organizadas em estruturas de nucleoproteínas complexas. As características essenciais da replicação do DNA são as mesmas em eucariontes e bactérias, e muitos dos complexos proteicos são conservados funcionalmente e estruturalmente. Entretanto, a replicação eucariótica é regulada e coordenada com o ciclo celular, introduzindo algumas complexidades adicionais.
As origens de replicação têm uma estrutura bem caracterizada em alguns eucariontes inferiores, mas são muito menos conhecidas em eucariontes superiores. Em vertebrados, várias sequências ricas em A═T podem ser utilizadas para a iniciação da replicação, e os sítios podem variar de uma divisão celular para outra. A levedura (Saccharomyces cerevisiae) tem origens de replicação definidas, denominadas sequências de replicação autônomas (ARS), ou replicadores. Os replicadores de leveduras se estendem por aproximadamente 150 pb e contêm várias sequências conservadas essenciais. Cerca de 400 replicadores estão distribuídos entre 16 cromossomos de um genoma haploide de levedura.
A regulação garante que todo DNA celular seja replicado uma vez por ciclo celular. A maior parte dessa regulação envolve proteínas denominadas ciclinas e cinases dependentes de ciclina (CDK). As ciclinas são rapidamente destruídas pela proteólise dependente de ubiquitina no final da fase M (mitose) e a ausência de ciclinas permite o estabelecimento de complexos pré-replicativos (pré-RC) nos sítios de iniciação de replicação. Em células de crescimento rápido, o pré-RC se forma no final da fase M. Em células de crescimento lento, ele não se forma até o final de G1. A formação do pré-RC confere à célula competência para replicação, um evento algumas vezes chamado de licenciamento.
O evento-chave na iniciação da replicação em todos os eucariontes é o carregamento da helicase replicativa, um complexo hetero-hexamérico de proteínas de manutenção de minicromossomos (MCM) (MCM2 a MCM7). A helicase anelar MCM2–7, que funciona como a helicase DnaB bacteriana, é carregada no DNA por outro complexo de seis proteínas denominado ORC (complexo de reconhecimento de origem). O ORC tem cinco domínios AAA+ ATPase entre suas subunidades e é funcionalmente análogo à DnaA bacteriana. Duas outras proteínas, CDC6 (ciclo de divisão celular) e CDT1 (CDC10 dependente do transcrito 1), também são necessárias para carregar o complexo MCM2-7, e o CDC6 de levedura é outra AAA1 ATPase.
O compromisso com a replicação precisa da síntese e atividade dos complexos ciclina-CDK da fase S e CDC7-DBF4. Ambos os tipos de complexos auxiliam a ativar a replicação ligando-se a várias proteínas e as fosforilando no pré-RC. outras ciclinas e CDK funcionam para inibir a formação de mais complexos pré-RC, uma vez que a replicação tenha se iniciado. Por exemplo, o CDK2 se liga à ciclina À medida que os níveis de ciclina E diminuem durante a fase S, inibindo o CDK2 e impedindo o licenciamento de complexos pré-RC adicionais.
A replicação de cromossomos humanos é mais lenta que os bacterianos, mas em compensação ele segue bidirecionalmente a partir de varias origens, espaçadas de 30 a 300 kpb. Essas múltiplas origens são provavelmente uma característica universal de células eucariontes. Também tem vários tipos de DNA-polimerase, algumas com função especificas.
A replicação de cromossomos nucleares envolve a DNA-polimerase α, em associação com a DNA-polimerase δ. A DNA-polimerase α é geralmente uma enzima de multissubunidades com estrutura e propriedades semelhantes em todas as células eucariontes. Uma subunidade tem atividade de primase, e a maior subunidade (Mr, 180.000) contém atividade de polimerização. Entretanto, essa polimerase não tem atividade de revisão da exonuclease 3՛→5՛, tornando-a inadequada para a replicação de DNA de alta fidelidade. Acredita-se que a DNA-polimerase α funcione apenas na síntese de iniciadores curtos (tanto RNA quanto DNA) para fragmentos de Okazaki na fita retardada. Esses iniciadores são,então, estendidos pela DNA-polimerase δ de multissubunidades. Essa enzima está associada ao antígeno nuclear de proliferação celular e é por ele estimulada (PCNA; Mr 29.000), uma proteína encontrada em grandes quantidades nos núcleos de células em proliferação. A estrutura tridimensional da PCNA é muito semelhante àquela da subunidade β da DNA-polimerase III de E. coli, embora a homologia da sequência primária não seja evidente. PCNA tem uma função análoga àquela da subunidade β, formando uma braçadeira circular que potencializa muito a processividade da polimerase. A DNA-polimerase δ tem uma atividade de revisão da exonuclease 3՛→5՛ e parece executar a síntese tanto da fita líder quanto da retardada em um complexo comparável à DNA-polimerase III bacteriana dimérica.
DNA-polimerase ε, substitui a DNA-polimerase d em algumas situações, como no reparo do DNA. A DNA-polimerase ε também pode funcionar na forquilha de replicação, talvez desempenhando um papel análogo àquele da DNA-polimerase I bacteriana, removendo os iniciadores dos fragmentos de Okazaki na fita retardada.
RPA (proteína de replicação A) é uma proteína de ligação de DNA de fita simples
de eucariontes, equivalente em função à proteína SSB de E. coli. RFC (fator de replicação C) é um carregador de braçadeiras para PCNA e facilita a montagem dos complexos de replicação ativos. As subunidades do complexo RFC apresentam uma semelhança de sequência significativa com as subunidades do complexo de carregamento de braçadeira (complexo γ) bacteriano. Em cromossomos eucariontes lineares, a terminação da replicação envolve a síntese de estruturas especiais denominadas telômeros nas extremidades de cada cromossomo.
DNA-polimerases virais fornecem alvos para a terapia antiviral
RESUMO 25.1 Replicação do DNA
A replicação do DNA ocorre com fidelidade muito alta e em um tempo determinado no ciclo celular. A replicação é semiconservativa, cada fita atuando como molde para uma nova fita filha. Ela é realizada em três fases identificáveis: iniciação, alongamento e terminação. O processo se inicia em uma única origem em bactérias e normalmente segue bidirecionalmente.
O DNA é sintetizado na direção 5՛→3՛ pelas DNA-polimerases. Na forquilha de replicação, a fita líder é sintetizada continuamente na mesma direção do movimento da forquilha de replicação; a fita retardada é sintetizada descontinuamente como fragmentos de Okazaki, os quais são subsequentemente ligados.
A fidelidade da replicação do DNA é mantida por (1) seleção de bases pela polimerase, (2) atividade de revisão da exonuclease 3՛→5՛, que faz parte da maioria das DNA-polimerases, e (3) sistema de reparo específicos para malpareamentos (mismatches) deixados para trás após a replicação.
Muitas células têm várias DNA-polimerases. Em E. coli, a DNA-polimerase III é a enzima de replicação principal. A DNA-polimerase I é responsável por funções especiais durante a replicação, recombinação e reparo.
As fases de iniciação, alongamento e terminação separadas da replicação do DNA envolvem uma série de enzimas e fatores proteicos, muitos pertencentes à família AAA+ ATPase.
25.2 Reparo do DNA
O DNA pode ser danificado por vários processos, alguns espontâneos, outros catalisados por agentes ambientais. A replicação, em si, pode, muito ocasionalmente, danificar o conteúdo da informação quando erros introduzem pares de bases malpareados (tal como G pareado com T).
As mutações estão ligadas ao câncer
Uma alteração permanente na sequência de nucleotídeos de DNA é chamada de mutação. Mutações podem envolver a substituição de um par de bases por outro (mutação de substituição) ou a adição ou deleção de um ou mais pares de bases (mutações de inserção ou deleção). Se a mutação afeta um DNA não essencial ou se ela tem um efeito desprezível na função de um gene, ela é conhecida como mutação silenciosa. A maioria das mutações não silenciosas, entretanto, é neutra ou deletéria.
Em mamíferos, há uma forte correlação entre o acúmulo de mutações e o câncer. Teste de Ames: mede o potencial de um determinado composto químico em promover algumas mutações facilmente detectadas em uma linhagem bacteriana especializada. Poucas substâncias químicas encontradas no cotidiano pontuam como mutagênicos nesse teste. Os compostos conhecidos por serem carcinogênicos a partir de longos ensaios animais, mais de 90% foram considerados como mutagênicos no teste de Ames.
Todas as células têm sistemas de reparo de DNA múltiplos
O reparo do DNA é possível, em grande parte, porque a molécula de DNA consiste em duas fitas complementares.
Reparo de malpareamento A correção dos raros malpareamentos deixados para trás após a replicação, melhora a fidelidade geral da replicação. Os malpareamentos são quase sempre corrigidos para refletir a informação da fita antiga (molde), o sistema de reparo deve de algum modo diferenciar entre o molde e a fita sintetizada recentemente. Que é feito por meio de marcação do DNA molde com grupos metil para diferenciá-lo das novas fitas sintetizadas.
Reparo de excisão de base Cada célula tem uma classe de enzimas denominadas DNA-glicosilases que reconhecem lesões particularmente comuns no DNA (como os produtos da desaminação da citosina e da adenina;) e removem a base afetada por meio da clivagem da ligação N-glicosil. Essa clivagem cria um sítio apurínico ou apirimidínico no DNA, comumente denominado sítio AP ou sítio abásico. Cada DNA-glicosilase é geralmente específica para um tipo de lesão.
O reparo não é realizado pela simples inserção de uma nova base e reformação da ligação N-glicosil. Em vez disso, a desoxirribose-5՛-fosfato deixada para trás é removida e substituída por um novo nucleotídeo. Esse processo começa com uma das AP endonucleases, enzimas que cortam a fita de DNA que contém o sítio AP.
Reparo de excisão de nucleotídeos. Lesões no DNA que provocam grandes distorções na estrutura helicoidal do DNA geralmente são reparadas pelo sistema de excisão de nucleotídeos, uma via de reparo crítica para a sobrevivência de todos os organismos de vida livre. No reparo de excisão de nucleotídeos, uma enzima de multissubunidades (excinuclease) hidrolisa duas ligações fosfodiésteres, uma de cada lado da distorção provocada pela lesão.
Reparo direto. Vários tipos de danos são reparados sem a remoção de uma base ou nucleotídeo. O exemplo mais bem caracterizado é a fotorreativação direta dos dímeros de ciclobutano pirimidina, reação promovida pelas DNA-fotoliases. Os dímeros de pirimidina resultam de uma reação induzida por UV, e as fotoliases utilizam energia derivada da luz absorvida para reverter o dano. As fotoliases geralmente contêm dois cofatores que funcionam como agentes de absorção de luz, ou cromóforos. Um dos cromóforos é sempre FADH-FADH2. O mecanismo de reação implica a geração de radicais livres. As DNA-fotoliases estão ausentes nas células de mamíferos placentários (que incluem os seres humanos). 
A interação das forquilhas de replicação com o dano do DNA pode levar à síntese de DNA translesão propensa a erro. 
Quebras na fita dupla e lesões no DNA de fita simples surgem mais frequentemente quando uma forquilha de replicação encontra uma lesão não reparada no DNA. Tais lesões e as ligações cruzadas de DNA também podem resultar de radiação ionizante e reações oxidativas. 
Em uma forquilha de replicação parada em bactérias, há dois caminhos para reparo. Na ausência de uma segunda fita, a informação necessária para um reparo preciso deve vir de um cromossomo separado e homólogo. O sistema de reparo envolve, portanto, recombinação genética de homólogos. Em algumas condições, uma segunda via de reparo, a síntese de DNA translesão propensa a erro (frequentemente abreviada como TLS), se torna disponível. Quando essa via é ativa, o reparo do DNA se torna significativamente menos preciso e pode resultar em uma alta taxa de mutação.
Reparo do DNA e Câncer
Os cânceres em seres humanos se desenvolvem quandogenes que regulam a divisão celular normal, não funcionam, são ativados no momento errado ou são alterados. Como consequência, as células podem crescer sem controle e formar um tumor. Os genes que controlam a divisão celular podem ser danificados por mutação espontânea ou substituídos pela invasão de um vírus tumoral.
Defeitos nos genes que codificam as proteínas envolvidas no reparo de excisão de nucleotídeos reparo de malpareamento, reparo de recombinação e síntese de DNA translesão propensa a erro estão todos ligados a cânceres em seres humanos.
RESUMO 25.2 Reparo de DNA
As células têm vários sistemas para reparo do DNA. O reparo de malpareamento em E. coli é direcionado por sequências transitórias não metiladas de (5’) GATC na fita recém-sintetizada.
Sistemas de reparo de excisão de bases reconhecem e reparam danos causados por agentes ambientais (tais como radiação e agentes alquilantes) e reações espontâneas de nucleotídeos. Alguns sistemas de reparo reconhecem e excisam apenas bases danificadas ou incorretas,
deixando um sítio AP (abásico) no DNA. Esse é reparado pela excisão e substituição do segmento de DNA que contém o sítio AP.
Os sistemas de reparo de excisão de nucleotídeos reconhecem e removem várias lesões extensas e dímeros de pirimidina. Eles retiram um segmento de fita de DNA que inclui a lesão, deixando um espaço preenchido pela ação de DNA-polimerases e ligases.
Alguns danos ao DNA são reparados por reversão direta da reação que causou o dano: dímeros de pirimidina são diretamente convertidos a pirimidinas monoméricas por uma fotoliase, e o grupo metil de O6-metilguanina é removido por uma metiltransferase.
Em bactérias, a síntese de DNA translesão propensa a erro, envolvendo DNA-polimerases TLS, ocorre em resposta a um dano muito grande ao DNA. Em eucariontes, polimerases semelhantes têm funções especializadas no reparo do DNA que minimizam a introdução de mutações.
25.3 Recombinação do DNA
Os eventos de recombinação genética caem em pelo menos três grandes classes. A recombinação genética homóloga (também chamada recombinação geral) envolve alterações genéticas entre duas moléculas de DNA quaisquer (ou segmentos da mesma molécula) que compartilham uma região estendida de sequência praticamente idêntica. A sequência real de bases é irrelevante, desde que seja semelhante nos dois DNA. Na recombinação sítio-específica as trocas ocorrem apenas em uma sequência particular do DNA. A transposição de DNA é diferente das outras duas classes porque geralmente envolve um segmento curto de DNA com a capacidade marcante para se mover de uma localização no cromossomo para outra. Esses “genes saltadores” (jumping genes) foram inicialmente observados no milho.
A recombinação homóloga bacteriana é uma função de reparo do DNA
Em bactérias, a recombinação genética homóloga é principalmente um processo de reparo do DNA e, nesse contexto é denominado de reparo do DNA recombinante. Ele é geralmente direcionado para a reconstrução das forquilhas de replicação que pararam ou colapsaram no local do dano do DNA. A recombinação genética homóloga também pode ocorrer durante a conjugação (mating), quando o DNA cromossômico é transferido de uma célula bacteriana (doadora) para outra (recipiente).
A recombinação eucariótica homóloga é necessária para a segregação adequada de cromossomos durante a meiose.
A recombinação genética homóloga pode ter várias funções na replicação e divisão celular, incluindo o reparo das forquilhas de replicação paradas. A recombinação ocorre com a mais alta frequência durante a meiose, o processo pelo qual as células germinativas diploides com dois conjuntos de cromossomos se dividem para produzir gametas haploides (espermatozoides ou óvulos) em animais (esporos haploides em plantas) – cada gameta possuindo apenas um membro de cada par de cromossomos. 
Durante a segunda divisão meiótica, as ligações centroméricas entre as cromátides-irmãs, ampliadas por coesinas depositadas durante a replicação, fornecem as ligações físicas necessárias para guiar a segregação. Entretanto, durante a primeira divisão celular meiótica, os dois pares de cromátides-irmãs que serão segregados não estão relacionados a um evento de replicação recente e não são ligados por coesinas ou por qualquer outra associação física.
A recombinação durante a meiose se inicia com quebrasna fita dupla
Uma via provável para a recombinação homóloga durante a meiose é destacada na. O modelo tem quatro características-chave. Primeiro, os cromossomos homólogos são alinhados. Segundo, uma quebra na dupla fita da molécula de DNA é criada e, então, as extremidades expostas são processadas por uma exonuclease, deixando uma extensão de fita simples com um grupo 39-hidroxila na extremidade quebrada (etapa ➊). Terceiro, as extremidades expostas 39 invadem o DNA duplex intacto do homólogo e isso é seguido pela migração de ramos e/ou replicação para criar um par de intermediários de Holiday (etapas ➋ a ➍).
Quarto, a clivagem de duas permutas cria qualquer um dos dois pares de produtos recombinantes completos (etapa➎). Observe a semelhança dessas etapas em relação aos processos de reparo bacteriano por recombinação.
Nesse modelo de reparo da quebra da fita dupla para recombinação, as extremidades 3’ são utilizadas para iniciar a troca genética. Uma vez pareada com a fita complementar no homólogo intacto, é criada uma região do DNA híbrido que contém fitas complementares de dois DNAs parentais diferentes (o produto da etapa ➋). Cada uma das extremidades 39 pode, então, agir como um iniciador para a replicação do DNA. A recombinação meiótica dos homólogos pode variar em muitos detalhes de uma espécie para outra, mas a maior parte das etapas destacadas antes está geralmente presente em alguma forma. Há dois modos para clivar ou “resolver” o intermediário de Holliday com uma nuclease semelhante à RuvC de modo que os dois produtos contenham genes na mesma ordem linear que nos substratos – os cromossomos originais e não recombinados (etapa ➎). Se clivado de uma forma, o DNA lateral à região que contém o DNA híbrido não é recombinado; se clivado do outro modo, o DNA lateral é recombinado. Ambos os resultados são observados in vivo.
A recombinação sítio-específica resulta em rearranjos de DNA precisos.
A recombinação genética de homólogos, o tipo discutido até agora, pode envolver duas sequências homólogas quaisquer. O segundo tipo geral de recombinação, a recombinação sítio-específica, é um tipo muito diferente de processo: a recombinação é limitada a sequências específicas. Reações de recombinação desse tipo ocorrem praticamente em cada célula, ocupando funções especializadas que variam muito de uma espécie para outra.
Problemas
1. Conclusões a partir do experimento de Meselson- -Stahl. O experimento de Meselson-Stahl (ver Figura 25-2) provou que o DNA sofre replicação semiconservativa em E. coli. No modelo “dispersivo” da replicação do DNA, as fitas parentais de DNA são clivadas em partes de tamanhos aleatórios, sendo então ligadas a peças do DNA recém-replicado para formar fitas duplex filhas. Explique como os resultados do experimento de Meselson e Stahl descartaram esse modelo.
2. Análise de isótopos pesados na replicação do DNA. Uma cultura de E. coli crescendo em um meio contendo 15NH4Cl é trocada para um meio contendo 14NH4Cl por três gerações (aumento de oito vezes na população). Qual é a razão molar entre o DNA híbrido (15N–14N) e o DNA leve (14N–14N) nesse ponto?
3. Replicação do cromossomo de E. coli. O cromossomo de E. coli contém 4.639.221 pb.
(a) Como as muitas voltas da dupla-hélice devem ser desenroladas durante a replicação do cromossomo de E. coli?
(b) A partir dos dados deste capítulo, quanto tempo levaria para replicar o cromossomo de E. coli a 37°C se duas forquilhas de replicação prosseguissem a partir da origem? Assuma que a replicação ocorre a uma taxa de 1.000 pb/s. Sob algumas condições, as células de E.coli podem se dividir a cada 20 min. Como isso seria possível?
(c) Na replicaçãodo cromossomo de E. coli, cerca de quantos fragmentos de Okazaki poderiam ser formados? Que fatores garantem que os numerosos fragmentos de Okazaki são reunidos na ordem correta no novo DNA?
4. Composição de bases dos DNAs feitos a partir de moldes de fitas simples. Preveja a composição de bases do DNA total sintetizado por DNA-polimerase nos moldes fornecidos por uma mistura equimolar de duas fitas complementares do DNA do bacteriófago ՓX174 (molécula de DNA circular). A composição de bases de uma fita é A, 24,7%; G, 24,1%; C, 18,5%; e T, 32,7%. Que pressuposto é necessário para responder esse problema?
5. Replicação do DNA. Kornberg e colaboradores incubaram extratos solúveis de E. coli com uma mistura de dATP, dTTP, dGTP e dCTP, todos marcados com 32P no grupo fosfato a. Após um período de tempo, a mistura da incubação foi tratada com ácido tricloroacético, que precipita o DNA, mas não os precursores de nucleotídeos. O precipitado foi recolhido e o grau de incorporação dos precursores no DNA foi determinado a partir da quantidade de radioatividade presente no precipitado. 
(a) Se qualquer um dos quatro precursores de nucleotídeos fosse omitido da mistura de incubação, a radioatividade poderia ser encontrada no precipitado? Explique.
TRANSCRIÇÃO
A expressão da informação em um gene geralmente envolve a produção de uma molécula de RNA transcrita a partir de um molde de DNA. Na transcrição informação genética de um segmento de fita dupla de DNA em um filamento de RNA com uma sequência de bases complementar a uma das fitas de DNA. Três tipos principais de RNA são produzidos. Os RNAs mensageiros (mRNA) codificam a sequencia de aminoácidos de um ou mais polipeptídeos especificados por um gene ou conjunto de genes. Os RNAs transportadores (tRNA) leem a informação codificada no mRNA e transferem o aminoácido adequado para uma cadeia polipeptídica em crescimento durante a síntese de proteínas. 
Os RNAs ribossomais (rRNA) são constituintes dos ribossomos, as máquinas celulares intrincadas que sintetizam proteínas.
A transcrição é, mas seletiva que a replicação, já que seleciona apenas porções do genoma e genes particulares são transcritos, algumas porções do genoma de DNA nunca são transcritas.
A soma de todas as moléculas de RNA produzidas em uma célula sob um determinado conjunto de condições é chamado de transcriptoma celular.
A moderna análise de microarranjo dos padrões de transcrição revelou que a maior parte do genoma de humanos e de outros mamíferos é transcrita em RNA. Os produtos não são predominantemente mRNA, tRNA ou rRNA, mas sim RNAs de função especial, dos quais uma série está sendo descoberta. Muitos deles parecem estar envolvidos na regulação da expressão gênica;
26.1 Síntese de RNA dependente de DNA
A transcrição se parece com a replicação no seu mecanismo químico fundamental, na sua polaridade (direção da síntese) e no seu uso de um molde, a transcrição tem fases de iniciação, alongamento e terminação.
O RNA é sintetizado pelas RNA-polimerases
A RNA-polimerase dependente de DNA precisa, além de um molde DNA, de todos os quatro ribonucleosídeos 5՛-trifosfatos (ATP, GTP, UTP e CTP) como precursores das unidades de nucleotídeos de RNA, bem como de Mg2+. A proteína também liga um Zn2+. A química e o mecanismo de síntese de RNA se assemelham fortemente àqueles usados pelas DNA-polimerases. A RNA-polimerase alonga uma fita de RNA ao adicionar unidades de ribonucleotídeos à extremidade hidroxila 3՛, construindo o RNA na direção 5՛→3՛. O grupo hidroxila 3՛ atua como nucleófilo, atacando o α fosfato do ribonucleosídeo trifosfato que chega (Figura 26-1a) e liberando o pirofosfato. A reação total é 
 (NMP)ո + NTP → (NMP)n+1 + PPi
 RNA RNA aumentado
A RNA-polimerase precisa de DNA para sua atividade e é mais ativa quando ligada a um DNA de fita dupla. A fita de DNA molde é copiada na direção 3՛→5՛ (antiparalela à nova fita de RNA), exatamente como na replicação do DNA. Cada nucleotídeo no RNA recentemente formado é selecionado pelas interações de pareamento de bases de Watson-Crick: resíduos U são inseridos no RNA para parear com resíduos A no molde de DNA, resíduos G são inseridos para parear com resíduos C, e assim por diante. A geometria dos pares de bases também pode desempenhar um papel na seleção de bases.
A RNA-polimerase não precisa de um iniciador para a síntese. A iniciação ocorre quando a RNA-polimerase se liga a sequências de DNA específicas chamadas de promotores, O grupo 5’-trifosfato do primeiro resíduo em uma molécula de RNA nascente (recentemente formada) não é clivado para liberar PPi, mas em vez disso permanece intacto ao longo de todo o processo de transcrição. Durante a fase de alongamento da transcrição, as bases da extremidade crescente da nova fita de RNA pareiam temporariamente com o molde de DNA para formar um pequeno RNA-DNA híbrido de dupla-hélice, estimado em 8 pb de comprimento. O RNA nesse duplex híbrido “descasca” logo após a sua formação e o duplex de DNA volta a se formar.
 A fim de permitir que a RNA-polimerase sintetize uma fita de RNA complementar a uma das fitas de DNA, o duplex de DNA deve se desenrolar em um pequeno trecho, formando uma “bolha” de transcrição. Durante a transcrição, a RNA-polimerase da E. coli geralmente mantém 17 pb desenrolados. Os híbridos de RNA-DNA de 8 pb ocorrem nessa região desenrolada. O alongamento de um transcrito pela RNA-polimerase da E. coli continua a uma taxa de 50 a 90 nucleotídeos/s. Como o DNA é uma hélice, o movimento de uma bolha de transcrição precisa de uma considerável rotação da fita das moléculas de ácido nucleico. A rotação da fita de DNA é restrita na maioria dos DNAs por proteínas que se ligam ao DNA e outras barreiras estruturais. Como resultado, uma RNA-polimerase em movimento gera ondas de superespirais positivas para frente da bolha de transcrição e superespirais negativas para trás. Isso foi observado tanto in vitro quanto in vivo (em bactérias). Na célula, os problemas topológicos causados pela transcrição são aliviados pela ação das topoisomerases.
CONVENCAOCHAVE: As duas fitas de DNA complementar têm papéis diferentes na transcrição. A fita que serve como um molde para a síntese de RNA é chamada de fita-molde. A fita de DNA complementar ao molde, a fita não molde, ou fita codificadora, é idêntica na sequência de bases ao RNA transcrito a partir do gene, com o U no RNA no lugar do T no DNA. A fita codificadora de um gene em particular pode estar situada em qualquer das fitas de um determinado cromossomo. Por convenção, as sequências regulatórias que controlam a transcrição são designadas pelas sequências na fita codificadora.
A RNA-polimerase dependente de DNA da E. coli é uma enzima complexa, grande, com cinco subunidades centrais (a2bb9v; Mr 390.000) e uma sexta. 
subunidade, de um grupo denominado σ, com variantes designadas por tamanho (peso molecular). A subunidade σ se liga transitoriamente ao centro e direciona a enzima para sítios de ligação específicos no DNA (descritos a seguir). Essas seis subunidades constituem a holoenzima da RNA-polimerase. A holoenzima da RNA-polimerase da E. coli existe, portanto, em várias formas, dependendo do tipo da subunidade s. A subunidade mais comum é a σ70 (Mr 70.000) e a discussão a seguir foca na holoenzima da RNA-polimerase correspondente.
As RNA-polimerases não apresentam um sítio ativo distinto de exonuclease de revisão 3՛→5՛ (como aquele de várias DNA-polimerases), e a taxa de erro de transcrição é mais alta do que aquela de replicação do DNA cromossomal – aproximadamente um erro a cada 104 a 105 ribonucleotídeos incorporados ao RNA. Muitas RNA-polimerases, incluindo a RNA-polimerase bacteriana e a RNA-polimerase II de eucariontes, pausam realmente quando uma base mal pareada é adicionada durante a transcrição, e elas podem remover os nucleotídeos errados da extremidade 3’ de um transcrito por reversão direta da reação da polimerase.
A síntesede RNA começa nos promotores
A iniciação da síntese de RNA em pontos aleatórios da molécula de DNA seria um processo de desperdício extraordinário. Em vez disso, uma RNA-polimerase se liga a sequências específicas no DNA chamadas de promotores, que dirigem a transcrição de segmentos adjacentes de DNA (genes). As sequências em que as RNA-polimerases se ligam podem ser muito variáveis, e muitas pesquisas tiveram como foco a identificação das sequências particulares que são críticas para a função do promotor. A via de iniciação da transcrição e o destino da subunidade σ estão se tornando muito melhor definidos. A via consiste em duas partes principais, ligação e iniciação, cada qual com múltiplas etapas. Primeiro, a polimerase, dirigida por seu fator ligado s, se liga ao promotor. Um complexo fechado (em que o DNA ligado é intacto) e um complexo aberto (em que o DNA ligado está intacto e parcialmente desenrolado próximo da sequência –10) se formam em sucessão. Segundo, a transcrição é iniciada no interior do complexo, levando a uma mudança conformacional que converte o complexo na forma de alongamento, seguida pelo movimento do complexo de transcrição para longe do promotor (distanciamento do promotor).
Qualquer quer uma dessas etapas pode ser afetada pela composição específica das sequências promotoras. A subunidade σ se dissocia estocasticamente (de modo aleatório) à medida que a polimerase entra na fase de alongamento da transcrição. A proteína NusA (Mr 54.430) se liga à RNA-polimerase em alongamento, competitivamente com a subunidade σ. Uma vez que a transcrição esteja completa, a NusA se dissocia da enzima, a RNA se dissocia do DNA, e um fator σ (σ 70 ou outro) pode novamente se ligar à enzima para iniciar a transcrição.
A transcrição é regulada em vários níveis
As necessidades para qualquer produto gênico variam com as condições celulares ou estágio de desenvolvimento, e a transcrição de cada gene é cuidadosamente regulada para formar produtos gênicos apenas nas proporções necessárias. 
A regulação pode ocorrer em qualquer etapa na transcrição, incluindo o alongamento e a terminação. Entretanto, boa parte da regulação é direcionada para a ligação da polimerase e etapas de iniciação da transcrição destacadas na. Diferenças nas sequências de promotores são apenas um dos vários níveis de controle. A ligação de proteínas pode ativar a transcrição ao facilitar tanto a ligação da RNA-polimerase ou etapas mais adiante no processo de iniciação, ou ela pode reprimir a transcrição ao bloquear a atividade da polimerase. Em E. coli, uma proteína que ativa a transcrição é a proteína receptora cAMP (CRP), que aumenta a transcrição de genes que codificam enzimas que metabolizam outros açúcares além da glicose quando as células crescem na ausência da mesma. Repressores são proteínas que bloqueiam a síntese do RNA em genes específicos. No caso do repressor Lac, a transcrição dos genes para as enzimas do metabolismo da lactose é bloqueada quando a lactose está indisponível.
Footprinting, técnica derivada dos princípios usados no sequenciamento de DNA, identifica as sequências de DNA ligadas por uma proteína particular. Os pesquisadores isolam um fragmento de DNA que acreditam conter sequências reconhecidas por uma proteína ligadora de DNA e marcam radioativamente a extremidade de uma das fitas. Eles empregam então reagentes químicos ou enzimáticos para introduzir quebras aleatórias no fragmento de DNA (cerca de uma por molécula). 
A separação dos produtos clivados marcados (fragmentos quebrados de vários comprimentos) por eletroforese de alta resolução produz uma escala de bandas radioativas. Em um tubo separado, o procedimento de clivagem é repetido em cópias do mesmo fragmento de DNA na presença da proteína ligadora de DNA.
Sequências específicas sinalizam a terminação da síntese de RNA
A síntese de RNA é progressiva; isto é, a RNA-polimerase irá introduzir um grande número de nucleotídeos em uma molécula de RNA crescente antes de se dissociar. Isso é necessário, pois, se uma RNA-polimerase liberasse um transcrito de RNA prematuramente, ela não poderia recomeçar a síntese do mesmo RNA, tendo que, em vez disso, recomeçar. um encontro com certas sequências de DNA resulta em uma pausa na síntese de RNA, e em algumas dessas sequências a transcrição é terminada. O foco aqui é, mais uma vez, nos sistemas bem estudados de bactérias. A E. coli tem pelo menos duas classes de sinais de terminação: uma classe se baseia em um fator proteico chamado ρ (rho) e a outra é independente de ρ. 
A maioria dos terminadores independentes de ρ tem duas características distintivas. A primeira é uma região que produz um transcrito de RNA com sequências autocomplementares, permitindo a formação de uma estrutura em grampo com 15 a 20 nucleotídeos no centro antes da extremidade projetada da fita de RNA. A segunda característica é um filamento altamente conservado de três resíduos A na fita-molde que são transcritos em resíduos U próximo da extremidade 3’ do grampo. Quando uma polimerase chega a um sítio de terminação com essa estrutura, ela pausa. A formação da estrutura em grampo no RNA interrompe vários pares de bases A=U no segmento híbrido de RNA-DNA e pode interromper interações importantes.
As células eucariontes têm três tipos de RNA-polimerases nucleares
Os eucariontes têm três RNA-polimerases, designadas I, II e III, que são complexos distintos, RNA-polimerase I (Pol I) é responsável pela síntese de apenas um tipo de RNA, um transcrito chamado de RNA pré-ribossomal (ou pré-rRNA RNA-polimerase II (Pol II) é a síntese de mRNA e de alguns RNA especializados. 
Essa enzima pode reconhecer milhares de promotores que variam enormemente em suas sequências. A RNA-polimerase III (Pol III) produz tRNA, o rRNA 5S e alguns outros RNA pequenos especializados. Os promotores reconhecidos pela Pol III são bem caracterizados.
A RNA-polimerase II precisa de muitos outros fatores proteicos para a sua atividade
Embora essa polimerase seja surpreendentemente mais complexa do que a sua contraparte bacteriana, a complexidade mascara uma impressionante conservação da estrutura, função e mecanismo. A Pol II isolada da levedura é uma enzima imensa com 12 subunidades. A maior subunidade (RBP1) apresenta um alto grau de homologia com a subunidade β՛ da RNA-polimerase bacteriana]
A Pol II deve funcionar com genomas mais complexos 
e com moléculas de DNA mais elaboradamente acondicionadas do que nas bactérias. A necessidade de contatos proteína- proteína com os outros numerosos fatores proteicos necessários para navegar esse labirinto é responsável em grande medida pela complexidade adicional da polimerase de eucariontes.
	A RNA-polimerase II requer uma série de outras proteínas, chamadas de fatores de transcrição, a fim de formar o complexo de transcrição ativo. Os fatores de transcrição gerais necessários a cada promotor da Pol II (fatores geralmente designados TFII com um identificador adicional são altamente conservados em todos os eucariontes. O processo de transcrição pela Pol II pode ser descrito em termos de várias fases – montagem, iniciação, alongamento, terminação – cada uma associada a proteínas características.
 
Montagem da RNA-polimerase e fatores de transcrição em um promotor
A formação de um complexo fechado se inicia quando proteína de ligação TATA (TBP) se liga à TATA box (Figuras 26-9a, etapa ➊ e 26-9b). Nos promotores que nãoapresentam uma TATA box, a TBP se faz presente como parte de um complexo multissubunidade chamado TFIID (não mostrado na Figura 26-9). Os elementos de sequencia que dirigem a ligação da TFIID nos promotores sem TATA são muito pouco conhecidos. A TBP, por sua vez, é ligada pelo fator de transcrição TFIIB, que também se liga ao DNA de qualquer lado da TBP. A TFIIA se liga, e, junto com a TFIIB, ajuda a estabilizar o complexo TBP-DNA. A TFIIB fornece uma ligação importante para a DNA-polimerase II e o complexo TFIIB-TBP é em seguida ligado por outro complexo consistindo na TFIIF e Pol II. A TFIIF ajuda a ligar a Pol II aos seus promotores, tanto pela interação com a TFIIB quanto reduzindo a ligação da polimerase a sítios inespecíficos no DNA. Finalmente, a TFIIE e a TFIIH se ligam para criar o complexo fechado. A TFIIH tem múltiplas subunidades e inclui uma atividade de helicase de DNA que promove o desenrolamento do DNA próximo do sítio de início do RNA (um processo que requer a hidrólise de ATP), criando assim um complexo aberto. (Figura 26-9a, etapa ➋). Somando todas as subunidades dos vários fatores essenciais (excluindo o TFIIA e algumas subunidades de TFIID), essa reunião ativa mínima tem mais de 30 polipeptídeos. Estudos estruturais por Roger Kornberg e colaboradores forneceram uma visão mais detalhada da estrutura central da RNA-polimerase II durante o alongamento.
Iniciação da fita de RNA e distanciamento do promotor A TFIIH tem uma função adicional durante a fase de iniciação. A atividade de cinase em uma de suas subunidades fosforila a Pol II em muitos locais no CTD. Várias outras proteínas cinases, incluindo a CDK9 (cinase 9 dependente de ciclina), que é parte do complexo pTEFb (fator positivo b de alongamento de transcrição), também fosforilam o CTD, principalmente nos resíduos de Ser da sequência de repetição do CTD. Isso provoca uma mudança conformacional geral no complexo, iniciando a transcrição. A fosforilação do CTD também é importante durante a fase de alongamento subsequente, com o estado de fosforilação do CTD mudando à medida que a transcrição prossegue. As mudanças afetam as interações entre o complexo de transcrição e outras proteínas e enzimas, de modo que diferentes conjuntos de proteínas são ligados na iniciação em vez de em estágios posteriores. Algumas dessas proteínas estão envolvidas no processamento do transcrito.
Durante a síntese dos 60 a 70 nucleotídeos iniciais de RNA, primeiro a TFIIE e então a TFIIH são liberadas, e a Pol II entra na fase de alongamento da transcrição.
Alongamento, terminação e liberação A TFIIF permanece associada à Pol II durante o alongamento. Durante esse estágio, a atividade da polimerase é bastante estimulada por proteínas chamadas de fatores de alongamento (Tabela 26-2). Os fatores de alongamento, alguns ligados ao CTD fosforilado, impedem a pausa durante a transcrição e também coordenam as interações entre complexos de proteínas envolvidos no processamento pós-transcricional de mRNA. Uma vez que o transcrito de RNA esteja completo, a transcrição é encerrada. A Pol II é desfosforilada e reciclada, pronta para iniciar outro transcrito (Figura 26-9a, etapas ➌ a ➎).
Regulação da atividade da RNA-polimerase II A regulação da transcrição nos promotores da Pol II é muito elaborada. Ela envolve a interação de uma grande variedade de outras proteínas com o complexo de pré-iniciação. Algumas dessas proteínas regulatórias interagem com fatores de transcrição, outras com a própria Pol II.
Diversas funções da TFIIH Em eucariontes, o reparo de DNA.
danificado (Tabela 25-5) é mais eficiente dentro de genes que estão sendo transcritos ativamente do que em outros DNA danificados, e a fita-molde é reparada de maneira mais eficiente do que a fita não molde. A TFIIH não só participa na formação do complexo fechado durante a montagem de um complexo de transcrição (como descrito anteriormente), mas algumas de suas unidades são também componentes essenciais do complexo de reparo separado de excisão de nucleotídeos Quando a transcrição da Pol II para no local de uma lesão de DNA, a TFIIH pode interagir com a lesão e recrutar todo o complexo de reparo de excisão de nucleotídeos. A perda genética de certas subunidades TFIIH pode produzir doenças humanas.
A RNA-polimerase DNA-dependente sofre inibição seletiva O alongamento das fitas de DNA pela RNA-polimerase tanto em bactérias quanto em eucariontes é inibido pelo antibiótico actinomicina D, ela deforma o DNA se inserindo sua porção planar entre as bases G≡C. A acridina inibe a síntese de RNA de modo semelhante.
A rifampicina inibe a síntese bacteriana de RNA ao se ligar à subunidade b das RNA-polimerases bacterianas, impedindo a etapa da transcrição de distanciamento do promotor
O cogumelo Amanita phalloides tem um mecanismo de defesa muito eficiente contra predadores. Ele produz α-amanitina, que interrompe a formação de mRNA nas células animais ao bloquear a Pol II e, em concentrações mais altas, a Pol III. Nem a Pol I nem a RNA-polimerase bactéria na é sensível a α-amanitina – nem o é a RNA-polimerase II do próprio A. phalloides.
RESUMO 26.1 Síntese de RNA dependente de DNA
A transcrição é catalisada por RNA-polimerases dependentes de DNA, que usam ribonucleosídeo 5’-trifosfatos para sintetizar RNA complementar à fita-molde do DNA duplex. A transcrição ocorre em várias fases: ligação da RNA-polimerase a um sítio de DNA chamado promotor, iniciação da síntese do transcrito, alongamento e terminação.
A RNA-polimerase bacteriana precisa de uma subunidade especial para reconhecer o promotor. Como primeiro passo envolvido na transcrição, a ligação da RNA-polimerase ao promotor e a iniciação da transcrição são intimamente regulados. A transcrição para em sequências chamadas terminadores. 
As células eucarióticas têm três tipos de RNA-polimerases. A ligação da RNA-polimerase II aos seus promotores precisa de um conjunto de proteínas chamadas de fatores de transcrição. Os fatores de alongamento participam na fase de alongamento da transcrição. A maior subunidade de Pol II tem um longo domínio carboxil-terminal, que é fosforilado durante as fases de iniciação e alongamento.
26.2 Processamento de RNA
Uma molécula de RNA recém-sintetizada é chamada de um transcrito primário. O transcrito primário para um mRNA eucarionte geralmente contém sequências envolvendo um gene, embora as sequências codificando o polipeptídeo possam não ser contíguas. Trechos não codificantes que interrompem a região codificadora do transcrito são chamados íntrons e os segmentos codificadores são chamados de éxons. Em um processo chamado splicing de RNA, os íntrons são removidos do transcrito primário e os éxons são ligados para formar uma sequência contínua que especifica um polipeptídeo funcional. 
Os mRNAs de eucariontes também são modificados em cada extremidade. Um resíduo modificado chamado de quepe 5’ é adicionado à extremidade 5’. A extremidade 3’ é clivada e 80 a 250 resíduos A são adicionados para criar uma “cauda” poli (A). Os complexos proteicos algumas vezes elaborados que executam cada uma dessas três reações de processamento de mRNA não operam independentemente. As proteínas envolvidas no transporte de mRNA para o citoplasma também são associadas ao mRNA no núcleo, e o processamento do transcrito é acoplado ao seu transporte.
A composição do complexo varia à medida que o transcrito primário é processado, transportado para o citoplasma e entregue ao ribossomo para tradução.
Os transcritos primários dos tRNAs bacteriano e de eucariontes são processados pela remoção de sequências de cada extremidade (clivagem) e em alguns poucos casos
pela remoção dos íntrons (splicing). Muitas bases e açúcares em tRNAs também são modificados; tRNAs maduros são repletos de bases incomuns não encontradas em outros ácidos nucleicos.
O destino final de qualquer RNA é sua completa e controlada degradação. A taxa de reposição dos RNA desempenha um papel crítico na determinação dos seus níveis estacionários e a taxa na qual as célulaspodem interromper a expressão de um gene cujo produto não é mais necessário. Durante o desenvolvimento de organismos multicelulares, por exemplo, certas proteínas devem ser expressas apenas em um estágio, e o mRNA que codifica tal proteína deve ser produzido e destruído nos tempos adequados.
Os mRNAs de eucariontes recebem um quepe na extremidade 5’
A maioria dos mRNAs de eucariontes tem um quepe 5’, um resíduo de 7-metilguanosina ligado ao resíduo do terminal 5’ do mRNA por meio de uma rara ligação trifosfato 5’, 5’-trifosfato. O quepe 59 ajuda a proteger o mRNA das ribonucleases. Ele também se liga a um complexo de proteínas ligadoras de quepe específico e participa da ligação do mRNA ao ribossomo para iniciar a tradução.
Tanto íntrons quanto éxons são transcritos de DNA para RNA
A grande maioria dos genes em vertebrados contém íntrons; entre as poucas exceções estão aqueles que codificam histonas. A ocorrência de íntrons em outros eucariontes varia. Os íntrons do DNA são transcritos junto com o resto do gene pelas RNA-polimerases. Os íntrons no transcrito de RNA primário sofrem
splicing, e os éxons são então ligados para formar um RNA.
maduro funcional. Os íntrons variam de tamanho de 50 a 20.000 nucleotídeos. Os genes dos eucariontes superiores, incluindo humanos, têm caracteristicamente muito mais DNA destinado a íntrons do que a éxons. Muitos genes têm íntrons; alguns têm dúzias deles.
O RNA catalisa o splicing de íntrons
Há quatro classes de íntrons. As primeiras duas, os íntrons do grupo I e do grupo II, diferem em detalhes dos seus mecanismos de splicing, mas compartilham uma característica surpreendente: eles sofrem autosplicing – nenhuma enzima proteica está envolvida. Os íntrons do grupo I são encontrados em alguns genes nucleares, mitocondriais e de cloroplastos que codificam rRNAs, mRNAs e tRNAs. Íntrons do grupo II são geralmente encontrados em transcritos primários de mRNAs mitocondriais ou de cloroplastos em fungos, algas e plantas. Os íntrons do grupo I e grupo II também são encontrados entre os raros exemplos de íntrons em bactérias. Nenhuma das classes precisa de um cofator de alta energia (tal como o ATP) para o splicing. Os mecanismos de splicing em ambos os grupos envolvem duas etapas de reações de transesterificação (Figura 26-13), em que um grupo ribose 29 ou 39-hidroxila faz um ataque nucleofílico em um fósforo e uma nova ligação fosfodiéster é formada à custa da antiga, mantendo o equilíbrio de energia. Essas reações são muito semelhantes às reações de quebra e religação do DNA promovidas pelas topoisomerases (ver Figura 24-20) e recombinases sítio-específicas. 
A reação de splicing do grupo I precisa de um nucleosídeo guanina ou de um cofator nucleotídeo, mas o cofator não é usado como uma fonte de energia; em vez disso, o grupo 3’-hidroxila da guanosina é usado como um nucleófilo na primeira etapa da via do splicing. O grupo 3’-hidroxila da guanosina forma uma ligação 3’, 5’-fosfodiéster normal com a extremidade 5’ do íntron (Figura 26-14). A 3’-hidroxila do éxon que é deslocada nessa etapa age então como um nucleófilo em uma reação semelhante na extremidade 3’ do íntron. O resultado é a remoção precisa do íntron e ligação dos éxons.
Nos íntrons do grupo II, o padrão de reação é semelhante exceto pelo nucleófilo na primeira etapa, que nesse caso é o grupo 2’-hidroxila de um resíduo Adentro do íntron (Figura 26-15). Uma estrutura em laço ramificado é formada como um intermediário.
Íntrons que sofrem autosplicing foram descobertos pela primeira vez em 1982 em estudos do mecanismo de splicing do íntron do grupo I do rRNA do protozoário ciliado Tetrahymena thermophila, realizado por Thomas Cech e colaboradores.
A maioria dos íntrons não sofre autosplicing e esses tipos não são designados com um número de grupo. A terceira e maior classe de íntrons inclui aqueles encontrados nos transcritos primários de mRNA nuclear. São chamados de íntrons do spliceossomo, pois sua remoção é catalisada por um grande complexo proteico chamado spliceossomo e ocorre no seu interior. Dentro do spliceossomo, os íntrons sofrem splicing pelo mesmo mecanismo formador de laço que os íntrons do grupo II. O spliceossomo é composto por complexos de RNA-proteínas especializados, pequenas ribonucleoproteínas nucleares (snRNP, frequentemente pronunciada “snurp”). Cada snRNP contém uma classe de RNA eucarionte, de 100 a 200 nucleotídeos de comprimento, conhecida como RNAs nucleares pequenos (snRNA).
Os íntrons do spliceossomo geralmente têm a sequencia de dinucleotídeos GU na extremidade 5’ e AG na extremidade 3’, e essas sequências marcam os sítios em que o splicing ocorre. 
Talvez 50 proteínas adicionais sejam associadas ao spliceossomo em diferentes estágios no processo de splicing, com algumas dessas proteínas tendo múltiplas funções: no splicing, transporte de mRNA para o citoplasma, tradução e na degradação final do mRNA. O ATP é necessário para a montagem do spliceossomo, mas as reações de clivagem-ligação do RNA não parecem precisar de ATP.
A quarta classe de íntrons, encontrada em certos tRNA, se distingue dos íntrons dos grupos I e II pelo fato da reação de splicing precisar de ATP e de uma endonuclease. A endonuclease de splicing cliva as ligações fosfodiéster em ambas as extremidades do íntron, e os dois éxons são ligados por um mecanismo semelhante à reação da DNA-ligase.
Os mRNA de eucariontes tem uma estrutura da extremidade 3’ característica
Na sua extremidade 3’, a maioria dos mRNAs eucarióticos tem um filamento de 80 a 250 resíduos A, que perfazem a cauda poli (A). Essa cauda serve como um sítio de ligação para uma ou mais proteínas específicas. A cauda poli (A) e suas proteínas associadas provavelmente ajudam a proteger o mRNA de destruição enzimática. Muitos mRNAs bacterianos também adquirem caudas poli (A), mas essas caudas estimulam a destruição do mRNA em vez de protegê-lo da degradação.
A cauda de poli (A) é adicionada em um processo de várias etapas.
Um gene pode dar origem a múltiplos produtos por meio do processamento diferencial do RNA
RNAs transportadores A maioria das células tem de 40 a 50
tRNAs diferentes, e as células eucariontes têm múltiplas.
cópias de vários genes de tRNA. Os RNAs transportadores
são derivados de precursores de RNA mais longos pela remoção
enzimática de nucleotídeos das extremidades 59e 39
(Figura 26-26). Em eucariontes, os íntrons estão presentes.
em poucos transcritos de tRNA e devem ser retirados.
Quando dois ou mais tRNAs diferentes estão contidos em
um único transcrito primário, eles são separados por clivagem.
enzimática. A endonuclease RNase P, encontrada em.
todos os organismos remove o RNA na extremidade 5' dos
tRNAs. Essa enzima contém tanto proteína quanto RNA. O
componente de RNA é essencial para sua atividade e em
células bacterianas ele pode desempenhar sua função de
processamento com precisão mesmo sem o componente
proteico. 
Propriedades enzimáticas dos introns do grupo I Os íntrons do
grupo I que sofrem autosplicing compartilham várias propriedades com enzimas além de acelerar a taxa de reação, incluindo seu comportamento cinético e sua especificidade. A ligação do cofator da guanosina (Figura 26-13) ao íntron do grupo I do rRNA da Tetrahymena é saturável (Km < 30 mM) e pode ser competitivamente inibida pela 3’-desoxiguanosina. O íntron é muito preciso na sua reação de excisão, em grande parte devido a um segmento chamado de sequência-guia interna que pode se parear com sequências de éxons próximas do sítio de splice 5’ (Figura 26-29). Esse pareamento promove o alinhamento de ligações específicas a serem clivadas e religadas. Como o próprio íntron é quimicamente alterado durante a reação de splicing –
Características de outras ribozimas
O componente proteico aparentemente serve para estabilizar o RNA ou facilitar sua função in vivo. A ribozima RNase P reconhece a forma tridimensional do seu substrato pré-tRNA, junto com a sequencia CCA, e, portanto, pode clivar os líderes 5’de diversos tRNAs.
RESUMO 26.3 Síntese de RNA e DNA dependente de RNA 
As DNA-polimerases dependentes de RNA, também chamadas de transcriptases reversas, foram descobertas primeiro em retrovírus, que devem converter seus genomas de RNA em DNA de fita dupla como parte do seu ciclo vital. Essas enzimas transcrevem o RNA viral em DNA, um processo que pode ser usado experimentalmente para formar DNA complementar.
Muitos transposons de eucariontes são relacionados a retrovírus e seu mecanismo de transposição inclui um RNA intermediário.
Telomerase, a enzima que sintetiza as extremidades do telômero dos cromossomos lineares, é uma transcriptase reversa especializada que contém um molde interno de RNA.
As RNA-polimerases dependentes de RNA, tais como as replicases dos bacteriófagos RNA, são específicas de molde para o RNA viral.
A existência de RNA catalíticos e vias para a interconversão de RNA e DNA levou à especulação de que um importante estágio na evolução foi o aparecimento de um RNA (ou um polímero equivalente) que poderia catalisar sua própria replicação. O potencial bioquímico dos RNA pode ser explorado pelo SELEX, um método para selecionar rapidamente sequências de RNA com propriedades particulares ou catalíticas.
O código genético
c A sequencia especifica de aminoacidos de uma proteína e construida ao longo da traducao da informação contida no mRNA. Esse processo e realizado pelos ribossomos.
c Os aminoacidos são especificados pelos códons do mRNA, os quais consistem em tríplices (trincas) de nucleotídeos. A traducao requer moléculas adaptadoras, os tRNAs, que reconhecem os códons e inserem os aminoácidos de maneira sequencial apropriada no polipeptídio.
c As sequencias das bases dos códons foram deduzidas a partir de experimentos empregando mRNAs sintéticos de composição e sequencia conhecidas.
c O códon AUG sinaliza o inicio da traducao. Os tríplices UAA, UAG e UGA sinalizam a terminação.
c O código genético e degenerado: ele tem múltiplos códons para a maioria dos aminoacidos.
c O código genético padrão e universal em todas as espécies, apresentando pequenas alterações nas mitocôndrias e em alguns organismos unicelulares. As variações ocorrem em padrões que reforçam o conceito de um código universal.
c A terceira posição em cada códon e bem menos especifica do que a primeira e a segunda, e chamada de oscilante.
c O código genético e resistente aos efeitos das mutações sem sentido.
c A mudança de fase de leitura da traducao e a edição do RNA afetam a maneira como o código genético e lido durante a traducao.
Síntese proteica
síntese de biomoléculas poliméricas pode ser considerada
como consistindo nos estágios de inicio (ou iniciação),
alongamento e termino (ou terminação). Geralmente, esses
processos fundamentais são acompanhados por dois estágios
adicionais: a ativação de precursores, anterior a síntese,
e o processamento pos-sintetico do polimero completo. ativação
dos aminoacidos antes da sua incorporação nos polipeptídios
e o processamento pos-traducional do polipeptídio
completo desempenham papeis especialmente importantes
em garantir tanto a fidelidade da síntese quanto a função
adequada do produto proteico.
A biossíntese de proteínas ocorre em cinco estágios
Estagio 1: Ativação de aminoacidos Para a síntese de um polipeptídio de sequencia definida, dois requerimentos químicos fundamentais devem ser alcançados: (1) o grupamento carboxil de cada aminoácido deve ser ativado para facilitar a formação da ligação peptídica, e (2) um elo deve ser estabelecida entre cada novo aminoácido e a informação contida no mRNA que o codifica. Ambos os requerimentos são cumpridos ligando-se o aminoácido a um tRNA no primeiro estagio da síntese proteica. A ligação do aminoácido certo ao tRNA certo e fundamental nesse processo. Essa reação ocorre no citosol, e não no ribossomo. Cada um dos 20 aminoacidos e covalentemente ligado a um tRNA especifico, à custa da energia do ATP, utilizando enzimas ativadoras dependentes de Mg21, conhecidas como aminoacil-tRNA- sintases. Quando ligados aos seus aminoacidos (aminoacilados), os tRNAs são considerados “carregados”.
Estagio 2: Iniciação O mRNA contendo o código para a síntese do polipeptídio se liga a subunidade menor do ribossomo e ao aminoacil-tRNA iniciador. A subunidade ribossomal maior se liga então para formar um complexo de iniciação. O aminoacil-tRNA iniciador estabelece um pareamento de bases com o códon AUG do mRNA, que sinaliza o começo do polipeptídio. Esse processo, que requer GTP, e promovido por proteínas citosolicas denominadas fatores de iniciação.
Estagio 3: Alongamento O polipeptídio nascente e alongado pela adição de unidades sucessivas de aminoacidos, as quais são ligadas covalentemente após serem levadas ate o ribossomo e posicionadas corretamente pelo respectivo tRNA, o qual, por sua vez, realiza um pareamento de bases com o códon correspondente no mRNA. O alongamento requer proteínas citosolicas conhecidas como fatores de alongamento. A ligação de cada aminoacil-tRNA que entra e o movimento do ribossomo ao longo do mRNA são facilitados pela hidrolise de GTP à medida que cada residuo e adicionado ao polipeptídio nascente.
Estagio 4: Terminação e reciclagem do ribossomo A conclusão da cadeia polipeptídica e sinalizada por um códon de parada no mRNA. O novo polipeptídio e liberado do ribossomo, auxiliado por proteínas denominadas fatores de liberação, e o ribossomo e reciclado para um novo ciclo de síntese.
Estagio 5: Enovelamento e processamento pos-traducional Para que possa atingir sua forma biologicamente ativa, o novo polipeptídio precisa dobrar-se em sua conformação tridimensional apropriada. Antes ou depois de dobrar-se, o novo polipeptídio pode sofrer processamento enzimático, incluindo remoção de um ou mais aminoacidos (geralmente da extremidade aminoterminal); adição de grupamentos acetil, fosforil, metil, carboxil, ou outros grupos a certos resíduos.
de aminoacidos; clivagem proteolítica, e/ou ligação de oligossacarídeos ou grupos prostéticos.
O ribossomo é uma complexa máquina supramolecular
Cada célula de E. coli contem 15.000 ribossomos ou mais o que compreende quase um quarto do peso seco da célula.
 Os ribossomos bacterianos contem cerca de 65% de rRNA e 35% de proteína; eles tem um diâmetro de aproximadamente 18 nm e são compostos de duas subunidades diferentes, com coeficientes de sedimentação de 30S e 50S e um coeficiente de sedimentação combinado de 70S. Ambas as subunidades tem dúzias de proteínas ribossomais e pelo menos uma molécula grande de rRNA Masayasu Nomura e colaboradores demonstraram que as duas subunidades ribossomais podem ser separadas em RNA e proteínas que as compõem e, depois, reconstituídas in vitro. Sob condições experimentais apropriadas, o RNA e as proteínas se reorganizam espontaneamente para formar as subunidades 30S e 50S, quase que de forma idêntica, em estrutura e atividade, as subunidades nativas;
As subunidades ribossomais são imensas moléculas de RNA. Na subunidade 50S, os rRNA 5S e 23S formam o cerne estrutural. As proteínas são elementos secundários no complexo, decorando a superfície. Em segundo lugar, e mais importante, não existe proteína no espaço de 18 A do sitio ativo para a formação da ligação peptídica. Assim, a estrutura em alta resolução confirma o que Harry Noller havia predito anos antes: o ribossomo e uma ribozima.
O ribossomo bacteriano e complexo, com um peso molecular combinado de 2,7 milhoes. As duas subunidades ribossomais, com formatos irregulares, encaixam-se de maneira a formar uma fenda, pela qual o mRNA passa à medida que o.
ribossomo se desloca ao longo dele durante a traducao (Figura 27-14a). As 57 proteínas
nos ribossomos bacterianos variam enormemente em tamanho e estrutura.
Os pesos moleculares variam de cerca de 6.000 a 75.000. A maioria das proteínas tem domínios globulares organizados na superfície do ribossomo.
Algumas também tem extensões alongadas que se projetam para dentro do cerne de rRNAdo ribossomo, estabilizando sua estrutura. As funções de algumas dessas proteínas ainda não foram elucidadas em detalhe, mas parece evidente que muitas delas tem papel estrutural. Os ribossomos das células eucarióticas (exceto os ribossomos das mitocôndrias e dos cloroplastos) são maiores e mais complexos do que os ribossomos bacterianos (Figura 27-16, compare com a Figura 27-14b), com um diâmetro de.
cerca de 23 nm e um coeficiente de sedimentação de cerca de 80S. Eles também tem duas subunidades, que variam em tamanho entre as espécies, mas tem, em media, 60S e.
40S. Os ribossomos eucarióticos contem, ao todo, mais de 80 proteínas diferentes. Os ribossomos de mitocôndrias e cloroplastos são um pouco menores e mais simples do que os ribossomos das bactérias. Ainda assim, a estrutura e a função dos ribossomos são surpreendentemente semelhantes em todos os organismos e organelas.
RNA transportadores têm características estruturais Próprias
Estágio 1: As aminoacil-tRNA-sintases ligam os aminoácidos corretos aos seus respectivos tRNA
Durante a primeira etapa da síntese de proteínas, que ocorre no citosol, as aminoacil-tRNA-sintases esterificam os 20 aminoacidos aos seus respectivos tRNAs. Cada enzima e especifica para um aminoácido e um ou mais tRNAs correspondentes. A maioria dos organismos tem uma aminoacil- tRNA-sintase para cada aminoácido. Para aminoacidos
com dois ou mais tRNAs correspondentes, a mesma enzima pode, geralmente, aminoacilar todos eles. As estruturas de todas as aminoacil-tRNA-sintases de E. coli ja foram determinadas. Os pesquisadores dividiram- nas em duas classes (Tabela 27-7), com base em diferenças consideráveis nas suas estruturas primaria e terciaria e no mecanismo de reação (Figura 27-19); essas duas classes são as mesmas em todos os organismos.
Essa reação ocorre em duas etapas no sitio ativo da enzima. Na etapa ➊ (Figura 27-19), e formado um intermediário ligado a enzima, o aminoacil-adenilato (aminoacil-AMP).
Na segunda etapa, o grupo aminoacila e transferido do aminoacil-AMP ligado à enzima para o seu tRNA especifico correspondente. O caminho pelo qual ocorre essa segunda etapa depende da classe a qual pertence à enzima, como mostrado nas etapas e da Figura 27-19. A ligação Ester resultante entre o aminoácido e o tRNA (Figura 27-20) tem uma energia livre de hidrolise altamente negativa (ΔG9º 5 –29 kJ/mol). O pirofosfato formado na reação de ativação sofre hidrolise, formando fosfato, pela ação da pirofosfatase inorgânica. Assim, para cada molécula de aminoácido ativada, duas ligações fosfato de alta energia são gastas no final, tornando a reação global de ativação de um aminoácido essencialmente.
irreversível: 
]
Edição pelas aminoacil-RNA-sintases
A aminoacilação do tRNA cumpre duas finalidades: (1) ativa um aminoácido para a formação de uma ligação peptídica e (2) garante o posicionamento apropriado do aminoácido no polipeptídio nascente. A identidade do aminoácido ligado a um tRNA não e conferida no ribossomo; portanto, a ligação do aminoácido correto ao seu tRNA e essencial para a fidelidade da síntese proteica. se as interações de ligação disponíveis não fornecerem discriminação suficiente entre dois substratos, a especificidade necessária poderá ser obtida pela ligação especifica do substrato em duas etapas sucessivas. Forçar o sistema por meio de dois filtros sucessivos tem um efeito multiplicativo. No caso da Ile-tRNA-sintase, o primeiro filtro e a ligação inicial do aminoácido a enzima e a sua ativação a aminoacil-AMP. 
O segundo e a ligação de qualquer produto aminoacil-AMP incorreto em um sitio ativo separado na enzima; um substrato que se ligar nesse segundo sitio ativo e hidrolisado. O grupo R da valina e um pouco menor do que o da isoleucina, de modo que Val-AMP cabe no sitio hidrolitico (de edição) da Ile-tRNA-sintase, enquanto o Ile-AMP não cabe. Assim, Val-AMP e hidrolisado a valina e AMP no sitio ativo de edição, e o tRNA ligado a sintase não se torna aminoacilado ao aminoácido errado. 
A taxa de erro da síntese de proteínas (, 1 erro para cada 104 aminoacidos incorporados) não chega perto daquela da replicação do DNA, que e bem mais baixa. Como os defeitos nas proteínas são eliminados quando as proteínas são degradadas e não são passados adiante para as gerações seguintes, eles tem um menor significado biológico.
Estágio 2: Um aminoácido específico inicia a síntese de proteínas
A síntese de proteínas começa na extremidade aminoterminal e procede a adição de aminoacidos passo a passo em direção à extremidade carboxiterminal do polipeptídio nascente, como determinado por Howard Dintzis em 1961 (Figura 27-24). O códon de iniciação AUG, dessa maneira, especifica um residuo de metionina aminoterminal. Apesar de a metionina possuir apenas um códon, (5’) AUG, todos os organismos tem dois tRNAs para metionina. Um deles e utilizado exclusivamente quando (5’) AUG e o códon de iniciação para a síntese de proteínas. O outro e utilizado para codificar resíduos Met em posições internas no polipeptídio. 
A distinção entre um (5’) AUG iniciador e um interno e direta. Em bactérias, os dois tipos de tRNA específicos para metionina são designados tRNAMet e tRNAfMet. O aminoácido incorporado em resposta ao códon de iniciação (5’) AUG e a N-formilmetionina (fMet). Ele chega ao ribossomo como N-formilmetionil-tRNAfMet. qual e formado em duas reações sucessivas. Primeiramente, a metionina e ligada ao tRNAfMet pela Met-tRNA sintase (a qual, em E. coli, aminoacila tanto o tRNAfMet quanto o tRNAMet): Em células eucarióticas, todos os polipeptídios sintetizados por ribossomos citosolicos iniciam com um residuo Met (em vez de fMet), mas, novamente, a célula utiliza um tRNA iniciador especializado, que e diferente do tRNAMet utilizado em códons (5’) AUG em posições internas no RNA. Os polipeptídios sintetizados pelos ribossomos das mitocôndrias e dos cloroplastos, entretanto, iniciam com N- -formilmetionina. As três etapas da iniciação A iniciação da síntese de um polipeptídio nas bactérias requer (1) a subunidade 30S do ribossomo, (2) o mRNA que codifica o polipeptídio a ser produzido, (3) o fMet-tRNAfMet iniciador, (4) um conjunto de três proteínas denominadas fatores de iniciação (IF-1, IF-2 e IF-3), (5) GTP, (6) a subunidade 50S do ribossomo e (7) Mg2+. A formação do complexo de iniciação se da em três etapas (Figura 27-25). Na etapa ➊, a subunidade 30S do ribossomo se liga a dois fatores de iniciação, IF-1 e IF-3. O fator IF-3 impede que as subunidades 30S e 50S se combinem prematuramente. O mRNA se liga entao, a subunidade 30S. O (5’) AUG iniciador e guiado ate sua posição correta pela sequencia de Shine-Dalgarno (assim chamada em virtude dos pesquisadores australianos que a identificaram, John Shine e Lynn Dalgarno), presente no mRNA. Essa sequencia consenso e um sinal de iniciação contendo de quatro a nove resíduos de purina, 8 a 13 pb no lado 5’ do códon de iniciação. A sequencia realiza um pareamento de bases com uma sequencia complementar rica em pirimidina próxima à extremidade 3’ do rRNA 16S da subunidade 30S do ribossomo. Essa interação mRNA-rRNA coloca a sequencia iniciadora (5’) AUG do mRNA em uma posição precisa da subunidade 30S, onde ela e necessária para o inicio da traducao. O (5’) AUG especifico no qual o fMet-tRNAfMet deve se ligar e distinguido de outros códons de metionina pela sua proximidade a sequencia Shine-Dalgarno no mRNA. 
Os ribossomos bacterianos tem três sítios que ligam tRNA, o sítio aminoacil (A), o sítio peptidil (P) e o sítio de saída (E) (de exit). Os sítios A e P se ligam a um aminoacil-tRNA, enquanto o sitio E se liga apenas a tRNA não carregados, que ja completaram sua tarefa no ribossomo. Ambas as subunidades 30S e 50S contribuem para as características dos sítios A e P, enquanto o sitio E restrito a subunidade 50S. O (5') AUG iniciador e posicionado no sitio P, o único sitio no qual o fMet-tRNAfMet consegue se ligar. O fMet-tRNAfMet e o único aminoacil-tRNA que se liga primeiro ao sitio P; durante o estagiosubsequente de alongamento, todos os outros aminoacil-tRNA que chegam (incluindo o Met-tRNAMet, que se liga a códons AUG internos), ligam-se primeiro ao sitio A e só depois aos sítios P e E. O sitio E e o sitio pelo qual os tRNA “não carregados” saem durante o alongamento. O fator IF-1 se liga ao sitio A e impede a ligação do tRNA nesse sitio durante a iniciação.
Na etapa ➋ do processo de iniciação, o complexo constituído da subunidade 30S do ribossomo, do IF-3 e do mRNA se junta ao IF-2 ligado a GTP e ao fMet- -tRNAfMet iniciador. O anticódon desse tRNA pareia então corretamente com o códon iniciador do mRNA.
Na etapa ➌, esse grande complexo se combina com a subunidade 50S do ribossomo; simultaneamente, o GTP ligado ao IF-2 e hidrolisado a GDP e PI, os quais são liberados do complexo. Nesse ponto, todos os três fatores de iniciação saem do ribossomo.
O termino das etapas mostradas na Figura 27-25 produz um ribossomo funcional 70S chamado de complexo de iniciação, o qual contem o mRNA e o fMet-tRNAfMet iniciador. A ligação correta do fMet-tRNAfMet no sitio P no complexo de iniciação 70S e garantida por, pelo menos, três pontos de reconhecimento e de ligação: a interação codon-anticodon envolvendo o AUG iniciador posicionado no sitio P; a interação entre a sequencia de Shine-Dalgarno do mRNA e o rRNA 16S, e as interações de ligação entre o sitio P do ribossomo e o fMet-tRNAfMet. O complexo de iniciação esta agora pronto para o alongamento.
A iniciação nas células eucarióticas A traducao e, de modo geral, semelhante em células eucarióticas e em células bacterianas; a maioria das diferenças significativas estão no numero de componentes envolvidos e em detalhes do seu mecanismo. O processo de iniciação em eucariotos esta esquematizado na Figura 27-27. O mRNA de eucariotos se liga ao ribossomo formando um complexo com varias proteínas ligantes especificas. As células eucarióticas tem pelo menos 12 fatores de iniciação. Os fatores de iniciação eIF1A e eIF3 são homólogos funcionais do IF-1 e IF-3 de bactérias ligando-se a subunidade 40S na etapa ➊, bloqueando a ligação do tRNA ao sitio A e o acoplamento prematuro da subunidade maior com a subunidade menor do ribossomo respectivamente. O fator eIF1 liga-se ao sitio E. O tRNA iniciador carregado liga-se ao eIF2, o qual também esta ligado a um GTP.
 Na etapa ➋, esse complexo ternário liga-se a subunidade ribossomal 40S, junto com outras duas proteínas envolvidas em etapas posteriores, eIF5 (que não esta mostrada na Figura 27-27) e eIF5B. Esses componente formam o complexo de preiniciação 43S. O mRNA liga- -se ao complexo eIF4F o qual, na etapa ➌, e o intermediário na sua associação com o complexo de preiniciação 43S. O complexo eIF4F e formado pelo eIF4E (ligando o quepe 5’), eIF4A (com atividade ATPase e RNA-helicase) e eIF4G (uma proteína ligadora). A proteína eIF4G liga-se ao eIF3 e ao eIF4E, estabelecendo a primeira ligação entre o complexo de preiniciação 43S e o mRNA. O eIF4G também se liga a proteína ligadora da cauda poli-A (PABP, de poly(a) binding protein) na extremidade 39 do mRNA, circularizando o mRNA (Figura 27-28) e facilitando a regulação traducional da expressão gênica. A ligação do mRNA e dos fatores a ele associados cria o complexo 48S. Esse complexo escaneia o mRNA, iniciando no quepe 5’ ate que seja encontrado um códon AUG. Esse processo de escaneamento ou varredura (etapa ➍ da Figura 27-27) e facilitado pela atividade de RNA-helicase do eIF4A e por um outro fator (eIF4B, que não aparece na Figura 27-27), cuja atividade molecular exata ainda não e conhecida.
Uma vez encontrado o local onde esta o AUG iniciador, ocorre associação da subunidade ribossomal 60S com o complexo na etapa ➎ e liberação de muitos fatores de iniciação. Isso requer ação do eIF5 e do eIF5B. A proteína eIF5 promove a atividade GTPase do eIF2, produzindo um complexo eIF2-GDP com afinidade reduzida pelo tRNA iniciador.
A proteína eIF5B e homologa a IF-2 de bactérias. Ela hidrolisa o GTP que esta ligado a ela e dispara a dissociação do eIF2-GDP de outros fatores de iniciação, e em seguida ocorre a associação da subunidade 60S. Assim se completa a formação do complexo de iniciação. Os papeis dos vários fatores de iniciação de bactérias e de eucariotos no processo como um todo estão resumidos na Tabela 27-8. O mecanismo pelo qual essas proteínas agem constitui uma importante área de pesquisa.
Estágio 3: As ligações peptídicas são formadas no estágio de alongamento
A terceira etapa da síntese proteica e o alongamento. Outra vez, primeiramente serão analisadas as células bacterianas. O alongamento requer (1) o complexo de iniciação descrito anteriormente, (2) aminoacil-tRNA, (3) um conjunto de três proteínas citosolicas solúveis chamadas de fatores de alongamento (EF-Tu, EF-Ts e EF-G nas bactérias) e (4) GTP. As células realizam três etapas para adicionar cada residuo de aminoácido, e essas etapas são repetidas enquanto houverem resíduos a ser adicionados.
Etapa 1 do alongamento: Ligação de um aminoacil-tRNA Na primeira etapa do ciclo de alongamento (Figura 27-29), o aminoacil-tRNA apropriado que entra se liga a um complexo que consiste em EF-Tu ligado a GTP. O complexo aminoacil-tRNA–EF-Tu–GTP resultante se liga ao sitio A do complexo de iniciação 70S. O GTP e hidrolisado, e um complexo EF-Tu–GDP e liberado do ribossomo 70S. O complexo EF-Tu–GTP e regenerado durante um processo envolvendo EF-Ts e GTP.
Etapa 2 do alongamento: Formação da ligação peptídica Uma ligação peptídica e agora formada entre os dois aminoácidos ligados, por meio dos seus tRNAs, aos sítios A e P no ribossomo. Isso ocorre por meio da transferência do grupo N-formilmetionil do tRNA iniciador para o grupo amino do segundo aminoácido, agora no sitio A (Figura 27-30). O grupo α-amino do aminoácido no sitio A age como um nucleofilo, deslocando o tRNA do sitio P para formar a ligação peptídica. Essa reação produz um dipeptidil-tRNA no sitio A, e o tRNAfMet “não carregado” (desacilado) permanece ligado ao sitio P. Os tRNA mudam entao para um estado hibrido de ligação, com elementos de cada um deles estendendo- se sobre dois sítios diferentes no ribossomo, como mostrado na Figura 27-30. A atividade enzimática que catalisa a formação da ligação peptídica tem sido historicamente chamada de peptidiltransferase e era considerada intrínseca a uma ou mais proteínas da subunidade maior do ribossomo. Agora se sabe que essa reação e catalisada pelo rRNA 23S, contribuindo para o conhecido repertorio catalítico das ribozimas. Essa descoberta apresenta implicações interessantes para a evolução da vida (ver Quadro 27-2).
Etapa 3 do alongamento: Translocação Na etapa final do ciclo de alongamento, a translocação, o ribossomo se move um códon em direção à extremidade 3’ do mRNA (Figura 27-31a). Esse movimento move o anticódon do dipeptidil-tRNA, o qual ainda esta preso ao segundo códon do mRNA, do sitio A para o sitio P, e move o tRNA desacilado do sitio P para o sitio E, a partir do qual o tRNA e liberado para o citosol.
O terceiro códon do mRNA se encontra agora no sitio A e o segundo códon no sitio P. O movimento do ribossomo ao longo do mRNA requer o fator EF-G (também conhecido como translocase) e a energia fornecida pela hidrolise de outra molécula de GTP. Uma mudança na conformação tridimensional de todo o ribossomo resulta no movimento desse ao longo do mRNA. Como a estrutura do EF-G se assemelha a estrutura do complexo EF-Tu–tRNA (Figura 27-31b), o EF-G e capaz de se ligar ao sitio A e, presumivelmente, deslocar o peptidil-tRNA.
Após a translocação o, o ribossomo, com o dipeptidil- -tRNA e o mRNA ligados, esta pronto para um novo ciclo de alongamento e para a ligação de um terceiro residuo de aminoácido. Esse processo ocorre da mesma forma que a adição do segundo residuo (como mostrado nas Figuras 27- 29 27-30 e 27-31). Para cada residuo de aminoácido corretamente adicionado ao polipeptídio nascente, dois GTPs são hidrolisados a GDP e Pi, à medida que o ribossomo se move códon a códon ao longo do mRNAem direção à extremidade 3’.
O polipeptídio permanece ligado ao tRNA do ultimo (mais recentemente) aminoácido inserido. Essa associação mantém a conexão funcional entre a informação contida no mRNA e a produção do polipeptídio decodificado. Ao mesmo tempo, a ligação ester entre esse tRNA e a extremidade carboxil do polipeptídio nascente ativa o grupo carboxiterminal para o ataque nucleofilico pelo aminoácido que chega para formar uma nova ligação peptídica (Figura 27-30). À medida que a ligação ester existente entre o polipeptídio e o tRNA e quebrada durante a formação da ligação peptídica, a ligação entre o polipeptídio e a informação contida no mRNA persiste, pois cada novo aminoácido adicionado permanece preso ao seu tRNA.
O ciclo de alongamento em eucariotos e bastante semelhante ao que ocorre em bactérias. Três fatores de alongamento eucarióticos (eEF1α, eEF1βg e eEF2) tem funções análogas aquelas dos fatores de alongamento bacterianos (EF-Tu, EF-Ts e EF-G, respectivamente). Os ribossomos eucarióticos não tem um sitio E; os tRNAs não carregados são expulsos diretamente do sitio P.
Edição no ribossomo A atividade GTPasica do EF-Tu durante a primeira etapa do alongamento em células bacterianas (Figura 27-29) contribui de maneira importante para a velocidade e a fidelidade de todo o processo biossintético. Tanto o complexo EF-Tu–GTP como o EF-Tu–GDP existem por poucos milissegundos antes de se dissociarem. Esses períodos de tempo constituem oportunidades para que ocorra uma leitura para edição das interações codon-anticodon. Os aminoacil-tRNA incorretos normalmente se dissociam do sitio A em um desses momentos. Se o análogo de GTP guanosina 5’-O-(3-tiotrifosfato) (GTPγS) for utilizado no lugar do GTP, a hidrolise se torna mais lenta, melhorando a fidelidade (aumentando os intervalos de edição), mas reduzindo a velocidade da síntese proteica.
Maior fidelidade diminui a velocidade, enquanto aumentos na velocidade provavelmente comprometeriam a fidelidade.
Estágio 4: A terminação da síntese de polipeptídeos requer um sinal especial 
O alongamento continua ate que o ribossomo adicione o ultimo aminoácido codificado pelo mRNA. A terminação, quarto estagio da síntese de polipeptídios, e sinalizada pela presença de um dos três códons de parada no mRNA (UAA, UAG, UGA), imediatamente após o ultimo aminoácido codificado. Mutações no anticódon do tRNA que permitem que um aminoácido seja inserido em um códon de parada são geralmente deletérias para a célula (Quadro 27-4). Em bactérias, uma vez que um códon de parada tenha ocupado o sitio A do ribossomo, três fatores de terminação, ou fatores de liberação – as proteínas RF-1, RF-2 e RF-3 –, contribuem para (1) hidrolise da ligação peptidil-tRNA terminal; (2) liberação do polipeptídio e do ultimo tRNA, agora não carregado, do sitio P, e (3) dissociação do ribossomo 70S em suas subunidades 30S e 50S, prontas para começar um novo ciclo de síntese de polipeptídio (Figura 27-32). O RF-1 reconhece os códons de parada UAG e UAA, e o RF-2 reconhece UGA e UAA. O RF-1 ou o RF-2 (dependendo do códon presente) se liga a um códon de parada e induz a peptidil-transferase a transferir o polipeptídio nascente para uma molécula de água em vez de para outro aminoácido. Os fatores de liberação tem domínios que parecem assemelhar-se a estrutura do tRNA, como mostrado para o fator de alongamento EF-G na Figura 27-31b. A função especifica do RF-3 ainda não foi definitivamente estabelecida, mas acredita-se que ele libera a subunidade ribossomal. Em eucariotos, um único fator de liberação, o eRF, reconhece todos os três códons de parada. A reciclagem do ribossomo leva a dissociação dos componentes envolvidos na traducao. Os fatores de liberação se dissociam do complexo resultante da parada (contendo um tRNA não carregado no sitio P) e são substituídos pelo EF-G
e por uma proteína denominada fator de reciclagem do ribossomo (RRF, de ribosome recycling factor; Mr 20.300). A hidrolise do GTP pelo EF-G leva a dissociação da subunidade 50S, que se separa do complexo 30S tRNA–mRNA. O EF-G e o RRF são substituídos por IF-3, o qual promove a dissociação do tRNA. O mRNA e entao liberado. O complexo formado entre o IF-3 e a subunidade 30S este então pronto para iniciar outro ciclo de síntese proteica (Figura 27-25).
Custo energético da fidelidade na síntese proteica
Traducao rápida de uma única mensagem pelos polissomos 
Grandes conjuntos de 10 a 100 ribossomos muito ativos na síntese proteica podem ser isolados de células eucarióticas e bacterianas. Micrografias eletrônicas mostram a presença de uma fibra entre ribossomos adjacentes em um conjunto, o qual e chamado de polissomo (Figura 27-33a). A fita conectora e uma única molécula de mRNA que esta sendo traduzida simultaneamente por ribossomos muito próximos uns dos outros, permitindo um uso altamente eficiente do mRNA.
Em bactérias, a transcrição e a traducao são processos estreitamente acoplados. Os RNAs mensageiros são sintetizados e traduzidos na mesma direção 5’→3’. Os ribossomos começam a traduzir a extremidade 5’ do mRNA antes que a transcrição tenha sido completada (Figura 27-33b). A situação e um tanto diferente em células eucarióticas, nas quais os mRNAs recém-sintetizados precisam deixar o núcleo antes que possam ser traduzidos.
Estágio 5: As cadeias polipeptídicas recém-sintetizadas sofrem enovelamento e processamento
Na etapa final da síntese proteica, a cadeia polipeptídica nascente e dobrada e processada, adquirindo sua forma biologicamente ativa. Durante ou após a sua síntese, o polipeptídio assume, progressivamente, sua conformação nativa, com a formação de interações/ligações apropriadas, como ligações de hidrogênio, interações hidrofóbicas, iônicas e de van der Waals. Dessa forma, a informação genética linear, ou unidimensional, contida no mRNA e convertida na estrutura tridimensional da proteína. Algumas proteínas recém-sintetizadas, sejam elas de bactérias, arqueias ou eucariotos, não adquirem sua conformação final biologicamente ativa ate que sejam alteradas por uma ou mais reações de processamento, denominadas modificações pós-traducionais.
Modificacoes aminoterminais e carboxiterminais O primeiro residuo inserido em todos os polipeptideos e a N-formilmetionina (em bactérias) ou metionina (em eucariotos). Entretanto, o grupo formil, o residuo Met aminoterminal e, frequentemente, resíduos adicionais da regiao aminoterminal (e, em alguns casos, da extremidade carboxil) podem ser removidos enzimaticamente para a formação da proteína funcional final. Em ate 50% das proteínas eucarióticas, o grupamento amino do residuo aminoterminal e N-acetilado após a traducao. Às vezes, resíduos carboxiterminais são também modificados.
Perda das sequencias sinalizadoras Como será visto na Seção 27.3, 15 a 30 resíduos da extremidade aminoterminal de algumas proteínas tem papel no endereçamento da proteína para seu destino final na célula. Essas sequências sinalizadoras são removidas no final por peptidases especificas.
A síntese proteica é inibida por muitos antibióticos e toxinas
A puromicina, produzida pelo fungo Streptomyces alboniger, e um dos mais bem conhecidos antibióticos inibidores da síntese proteica. tetraciclinas inibem a síntese proteica em bactérias por meio do bloqueio do sitio A do ribossomo, impedindo.
a ligação do aminoacil-tRNA. O cloranfenicol inibe a síntese proteica realizada nos ribossomos das bactérias. Cicloeximida bloqueia a peptidil-transferase dos ribossomos
80S de eucariotos, mas não aquela dos ribossomos 70S das bactérias (nem das mitocôndrias nem dos cloroplastos). A estreptomicina, um trissacarideo básico, causa uma leitura errada do código genético (em bactérias) em concentrações relativamente baixas e inibe a iniciação em concentrações mais altas.
RESUMO 27.2 A síntese proteica
c A síntese proteica ocorre nos ribossomos, que consistem em proteínas e rRNA. As bactérias tem ribossomos 70S, com uma subunidade maior (50S) e uma menor (30S). Os ribossomos eucarióticos são significativamentemaiores (80S) e contem mais proteínas.
c Os RNAs transportadores contem entre 73 e 93 resíduos nucleotídeos, alguns dos quais tem bases modificadas. Cada tRNA tem o braço aminoacila com a sequencia terminal CCA (3’) – a qual um aminoácido e esterificado –, o braço do anticódon, o braço TΨC e o braço D; alguns tRNAs tem um quinto braço. O anticódon e responsável pela especificidade da interação entre o aminoacil-tRNA e o códon complementar do mRNA.
c O crescimento da cadeia dos polipeptideos nos ribossomos inicia com o aminoácido aminoterminal e ocorre por adições sucessivas de novos resíduos a extremidade carboxil.
c A síntese proteica acontece em cinco estágios.
1. Os aminoacidos são ativados no citosol por aminoacil- tRNA-sintetases especificas. Essas enzimas catalisa a formação de aminoacil-tRNA, com a clivagem simultânea de ATP, gerando AMP e PPi. A fidelidade da síntese proteica depende da precisão dessa reação, e algumas dessas enzimas realizam etapas de edição em sítios ativos separados.
2. Em bactérias, o aminoacil-tRNA iniciador de todas as proteínas e o N-formilmetionil-tRNAfMet. A iniciação da síntese proteica envolve a formação de um complexo entre a subunidade 30S do ribossomo, o mRNA, GTP, fMet-tRNAfMet, três fatores de iniciação e a subunidade 50S; o GTP e hidrolisado a GDP e Pi.
3. Nos estágios de alongamento, GTP e fatores de alongamento são necessários para a ligação do novo aminoacil-tRNA que chega ao sitio A do ribossomo. Na primeira reação de transferência peptídica, o residuo fMet e transferido para o grupo amino do novo aminoacil- tRNA. O movimento do ribossomo ao longo do mRNA transloca entao o dipeptidil-tRNA do sitio A para o sitio P, um processo que requer hidrolise de GTP. O tRNA desacilado se dissocia do sitio E do ribossomo.
4. Após muitos ciclos de alongamento, a síntese do polipeptideo e finalizada com o auxilio dos fatores de liberação. Pelo menos quatro equivalentes fosfatados de alta energia (do ATP ou do GTP) são necessários para a formação de cada ligação peptídica, investimento energético necessário para garantir a fidelidade da traducao.
5. Os polipeptideos dobram-se nas suas formas ativas tridimensionais. Muitas proteínas são ainda processadas por reações de modificação pos-traducional. c Muitos antibióticos e toxinas bem estudados inibem alguns aspectos da síntese proteica.
27.3 Endereçamento e degradação das proteínas ler 1169
RESUMO 27.3 Endereçamento e degradação das proteínas
c Após serem sintetizadas, muitas proteínas são direcionadas para locais específicos na célula. Um dos mecanismos de endereçamento envolve uma sequencia peptídica sinalizadora, geralmente encontrada na extremidade amino de uma proteína recém-sintetizada. 
c Nas células eucarióticas, uma classe de sequencias sinal e reconhecida pela partícula de reconhecimento de sinal (SRP), a qual se liga a sequencia sinal logo que essa aparece no ribossomo e transfere todo o ribossomo e o polipeptideo incompleto para o RE. Os polipeptideos contendo essas sequencias sinal são transportados para dentro do lúmen do RE à medida que vão sendo sintetizados; no lúmen, eles podem ser modificados e transportados para o aparelho de Golgi, para depois serem selecionados e enviados para os lisossomos, para a membrana plasmática ou para vesículas de transporte.
c As proteínas direcionadas para mitocôndrias e cloroplastos nas células eucarióticas e aquelas destinadas para exportação nas bactérias também fazem uso de uma sequencia sinal aminoterminal.
c As proteínas direcionadas para o núcleo tem uma sequencia sinal interna que, diferentemente de outras sequencias sinal, não e clivada após o endereçamento adequado da proteína.
c Algumas células eucarióticas importam proteínas por meio de endocitose mediada por receptor.
c Todas as células no final degradam proteínas utilizando sistemas proteolíticos especializados. As proteínas defeituosas e aquelas destinadas a uma rápida renovação são geralmente degradadas por um sistema dependente de ATP. Nas células eucarióticas, as proteínas são, primeiramente, marcadas pela ligação a ubiquitina, uma proteína altamente conservada. A proteólise dependente de ubiquitina e realizada pelos proteassomos – também altamente conservados – e e crucial para a regulação
Regulação da Expressão Gênica
A especialização da função celular afeta drasticamente a necessidade de vários produtos gênicos; um exemplo é a concentração excepcionalmente elevada de uma única proteína – hemoglobina – em eritrócitos. Dado o alto custo da síntese proteica, a regulação da expressão gênica é essencial para otimizar a utilização da energia disponível.
A concentração celular de uma proteína é determinada pelo equilíbrio delicado de ao menos sete processos, cada um tendo vários pontos de regulação potenciais:
1. Síntese do transcrito de RNA primário (transcrição)
2. Modificação pós-transcricional do mRNA
3. Degradação do RNA mensageiro
4. Síntese proteica (tradução)
5. Modificação pós-traducional de proteínas
6. Direcionamento e transporte de proteínas
7. Degradação de proteínas
O controle da iniciação da transcrição permite a regulação sincronizada de múltiplos genes codificando produtos com atividades interdependentes. Por exemplo, quando seu DNA está muito danificado, as células bacterianas precisam de um aumento coordenado nos níveis das muitas enzimas de reparo de DNA. 
28.1 Princípios da regulação gênica
Genes para produtos necessários em todos os momentos, como os das enzimas das vias metabólicas centrais, são expressos em nível mais ou menos constante em praticamente todas as células de uma espécie ou organismo. Muitas vezes, esses genes são chamados de genes constitutivos (housekeeping genes). A expressão invariável de um gene é chamada de expressão do gene constitutivo. 
Para outros produtos gênicos, os níveis celulares aumentam e diminuem em resposta a sinais moleculares; isso é a expressão gênica regulada. Produtos gênicos que aumentam de concentração sob circunstâncias moleculares específicas são chamados de induzíveis; o processo de aumentar sua expressão é a indução. A expressão de muitos dos genes codificadores de enzimas de reparo de DNA, por exemplo, é induzida por um sistema de proteínas reguladoras que responde aos altos níveis de dano ao DNA. Ao contrário, produtos gênicos que diminuam em concentração em resposta a um sinal molecular são denominados repressíveis, e o processo chamado de repressão. Por exemplo, em bactérias, amplas fontes de triptofano levam à repressão dos genes para as enzimas que catalisam a biossíntese do triptofano.
A RNA-polimerase se liga ao DNA nos promotores
A RNA-polimerase se liga ao DNA e inicia a transcrição nos promotores, sítios geralmente encontrados perto de pontos em que a síntese de RNA começa no molde de RNA. A regulação da iniciação da transcrição frequentemente envolve alterações em como a RNA-polimerase interage com um promotor. As sequências de nucleotídeos de promotores variam consideravelmente, afetando a afinidade de ligação das RNA-polimerases e, portanto, a frequência de iniciação da transcrição. 
Mutações que resultem em uma mudança que se afaste da sequência consenso geralmente diminuem a função do promotor; ao contrário, mutações na direção do consenso geralmente estimulam a função do promotor. 
CONVENCAOCHAVE: Por convenção, as sequências de DNA são apresentadas conforme existem na fita não molde, com a terminação 5’ à esquerda. Os nucleotídeos são numerados a partir do sítio de início da transcrição, com números positivos à direita (na direção da transcrição) e números negativos à esquerda. N indica qualquer nucleotídeo. ■
Embora os genes constitutivos sejam expressos constitutivamente, as concentrações celulares das proteínas que eles codificam variam amplamente.
As sequências dos promotores eucarióticos é mais variável do que a dos seus correspondentes bacterianos. As três RNA-polimerases eucarióticas geralmente precisam de uma série de fatores de transcrição gerais para se ligar a um promotor.Contudo, como na expressão gênica bacteriana, o nível basal de transcrição é determinado pelo efeito das sequências promotoras no funcionamento da RNA-polimerase e seus fatores de transcrição apropriados.
A iniciação da transcrição é regulada por proteínas que se ligam aos promotores ou que estão próximas deles
Pelo menos três tipos de proteínas regulam a iniciação da transcrição pela RNA-polimerase: fatores de especificidade alteram a especificidade da RNA-polimerase para um determinado promotor ou conjuntos de promotores repressores impedem o acesso da RNA-polimerase ao promotor, e os ativadores estimulam a interação RNA-polimerase-promotor.
A regulação pela proteína repressora que bloqueia a transcrição é chamada de regulação negativa. A ligação do repressor ao DNA é regulada por um sinal molecular (ou efetor), geralmente uma molécula pequena o ou uma proteína, que se liga ao repressor e provoca uma mudança conformacional.
Alguns ativadores são geralmente ligados ao DNA, estimulando a transcrição até que a dissociação do ativador seja disparada pela ligação de uma molécula sinalizadora. Em outros casos, o ativador se liga ao DNA apenas após a interação com uma molécula sinalizadora. Moléculas sinalizadoras podem, portanto aumentar ou diminuir a transcrição, dependendo de como elas afetam o ativador. A regulação positiva é particularmente comum em eucariotos, como será visto.
Em eucariotos, a distância entre os sítios de ligação de ativadores ou repressores e promotores é superada fazendo alças (looping) no DNA entre eles (Figura 28-5). O processo de looping é facilitado em alguns casos por proteínas chamadas reguladores arquitetônicos que se ligam a sítios de intervenção e facilitam o looping do DNA. A maioria dos sistemas eucarióticos envolve ativadores de proteínas. A interação atual entre ativadores e a RNA-polimerase no promotor é frequentemente mediada por proteínas intermediárias chamadas coativadores. Em alguns casos, repressores proteicos podem tomar o lugar de coativadores, ligando- se aos ativadores e impedindo a interação ativadora.
Muitos genes bacterianos são reunidos e regulados em óperons
As bactérias têm um mecanismo geral simples para coordenar a regulação de genes que codificam produtos que participam em um conjunto de processos relacionados: esses genes estão reunidos no cromossomo e são transcritos juntos. Muitos mRNA bacterianos são policistrônicos – múltiplos genes em um único transcrito – e o único promotor que inicia a transcrição do grupo de genes é o local de regulação para a expressão de todos os genes no grupo. O grupo de genes e o promotor, acrescido de sequências adicionais que funcionam juntas na regulação, são chamados de óperons. Óperons que incluem dois a seis genes transcritos como uma unidade são comuns; alguns óperons contêm 20 ou mais genes. Os termos “óperon” e “operador” foram introduzidos pela primeira vez nesse artigo. Com o modelo óperon, a regulação gênica poderia, pela primeira vez, ser considerada em termos moleculares.
O óperon lac está sujeito à regulação negativa
O óperon da lactose (lac) inclui os genes para β-galactosidase (Z), galactosídeo-permease (Y), e iogalactosídeo- transacetilase (A). A última dessas enzimas parece modificar os galactosídeos tóxicos para facilitar sua remoção da célula.
O estudo dos mutantes lac óperon revelou alguns detalhes das atividades do sistema regulatório óperon. Na ausência de lactose, os genes lac óperon são reprimidos.
Para reprimir o óperon, o repressor Lac parece se ligar tanto ao operador principal quanto a um de dois sítios secundários, com o DNA interveniente removido por looping (Figura 28-8b, c). Qualquer uma das duas ligações bloqueia a iniciação da transcrição.
Proteínas regulatórias têm domínios separados de ligação de DNA
As proteínas regulatórias geralmente se ligam a sequências de DNA específicas. Sua afinidade por essas sequências-alvo é de aproximadamente 104 a 106 vezes maior que sua afinidade por qualquer outra sequência de DNA. A maioria das proteínas regulatórias apresenta distintos domínios de ligação de DNA contendo subestruturas que interagem estreita e especificamente com o DNA. 
Para se ligarem especificamente a sequências de DNA, as proteínas regulatórias devem reconhecer características da superfície do DNA.
Vários motivos de ligação do DNA foram descritos, mas aqui serão focalizados dois que desempenham papéis de destaque na ligação do DNA por proteínas regulatórias: a hélice-volta-hélice e o dedo de zinco. Também será abordado um tipo de domínio de ligação do DNA – o homeodomínio – encontrado em algumas proteínas de eucariotos.
Helice-volta-helice Esse motivo de ligação do DNA é crucial para a interação de muitas proteínas regulatórias bacterianas com o DNA, e motivos semelhantes ocorrem em algumas proteínas regulatórias de eucariotos. O motivo hélice-volta-hélice compreende cerca de 20 aminoácidos em dois segmentos curtos α helicoidais, cada um com sete a nove resíduos de aminoácidos de comprimento, separados por uma volta β (Figura 28-11). Essa estrutura geralmente não é estável por si só; ela é simplesmente a porção reativa de um domínio de ligação do DNA um pouco maior. Um dos dois segmentos helicoidais é chamado de hélice de reconhecimento, pois geralmente contém muitos dos aminoácidos que interagem com o DNA de um modo específico da sequência. Essa hélice α é empilhada em outros segmentos da estrutura proteica de modo a se projetar a partir da superfície da proteína. Quando ligada ao DNA, a hélice de reconhecimento é posicionada no sulco principal ou próxima a ele. O repressor Lac apresenta seu motivo de ligação do DNA.
Dedo de zinco Em um dedo de zinco, cerca de 30 resíduos de aminoácidos formam uma alça alongada unida na base por um único íon Zn21, coordenado a quatro dos resíduos (quatro Cys, ou dois Cys e dois His). Por si só, o zinco não interage com o DNA; em vez disso, a coordenação do zinco com os resíduos de aminoácidos estabiliza esse pequeno motivo estrutural. Várias cadeias laterais hidrofóbicas no núcleo da estrutura também fornecem estabilidade. A Figura 28-12 mostra a interação entre o DNA e três dedos de zinco de um único polipeptídeo da proteína regulatória do camundongo Zif268.
Muitas proteínas de ligação de DNA de eucariotos contêm dedos de zinco. Em geral, a interação de um único dedo de zinco com o DNA é fraca, e muitas proteínas de ligação do DNA, como a Zif268, apresentam múltiplos dedos de zinco que estimulam substancialmente a ligação ao interagir simultaneamente com o DNA. Uma proteína de ligação do DNA da rã Xenopus tem 37 dedos de zinco. Há poucos exemplos conhecidos do motivo dedo de zinco em proteínas bacterianas.
Os dedos de zinco também funcionam como motivos de ligação do DNA – por exemplo, em certas proteínas que ligam o mRNA de eucariotos e atuam como repressores da tradução.
Homeodominio Outro tipo de domínio de ligação do DNA foi identificado em algumas proteínas que funcionam como reguladores de transcrição, especialmente durante o desenvolvimento de eucariotos. Esse domínio de aminoácidos chamado de homeodomínio porque foi descoberto em genes homeóticos (genes que regulam o desenvolvimento de padrões corporais) – é altamente conservado e foi agora identificado em proteínas de uma grande variedade de organismos, incluindo humanos (Figura 28-13). O segmento de ligação de DNA do domínio está relacionado ao motivo hélice-volta-hélice. A sequência de DNA que codifica esse domínio é conhecida como homeobox. 
Proteínas regulatórias também têm domínios de interação proteína-proteína.
Como os motivos de ligação do DNA, os motivos estruturais que controlam as interações proteína-proteína tendem a pertencer a algumas categorias comuns.Dois exemplos importantes são o zíper de leucina e hélice-alça-hélice básica. Motivos estruturais como esses são a base para classificar algumas proteínas regulatórias em famílias estruturais.
Ziper de leucina Uma característica marcante dessas hélices a é a ocorrência de resíduos Leua cada sétima posição, formando uma linha reta ao longo da superfície hidrofóbica.
Helice-alca-helice básica Essas proteínas compartilham uma região conservada de cerca de 50 resíduos de aminoácidos, importante tanto na ligação de DNA quanto na dimerização de proteínas. Essa região forma duas a hélices anfipáticas ligadas por uma alça de comprimento variável, a hélice-alça-hélice (distinta do motivo hélice-volta-hélice associado à ligação do DNA). Os motivos hélice-alça-hélice de dois polipeptídeos interagem para formar dímeros. Nessas proteínas, a ligação do DNA é mediada por uma sequência adjacente curta de aminoácidos rica em resíduos básicos, semelhante à região de ligação de DNA separada nas proteínas que contêm zíperes de leucina.
Interacoes proteina-proteina em proteinas regulatorias de eucariotos
Em eucariotos, a maioria dos genes é regulada por ativadores, e a maioria deles é monocistrônica. Se um ativador diferente fosse necessário para cada gene, o número de ativadores (e de genes que os codificam) teria de ser equivalente ao número de genes regulados. A regulação apropriada de diferentes genes é feita utilizando diferentes combinações de um repertório limitado de fatores de transcrição em cada gene, fenômeno chamado de controle combinatorial. 
RESUMO 28.1 Princípios da regulação gênica
A expressão dos genes é regulada por processos que afetam as taxas em que os produtos gênicos são sintetizados e degradados. A maior parte dessa regulação ocorre no nível da iniciação da transcrição, mediada por proteínas regulatórias que ou reprimem a transcrição (regulação negativa) ou ativam a transcrição (regulação positiva) em promotores específicos.
Em bactérias, os genes que codificam produtos com funções interdependentes são frequentemente agrupados em um óperon, unidade única de transcrição. A transcrição dos genes geralmente é bloqueada pela ligação de uma proteína repressora específica em um sítio de DNA chamado de operador. A dissociação do repressor do operador é mediada por uma molécula específica pequena, um indutor. Esses princípios foram primeiro elucidados em estudos do óperon da lactose (lac). O repressor Lac se dissocia do operador lac quando o repressor se liga ao seu indutor, a alolactose.
As proteínas regulatórias são proteínas de regulação do DNA que reconhecem sequências de DNA específicas; a maioria tem domínios de ligação do DNA distintos. No interior desses domínios, os motivos estruturais comuns que se ligam ao DNA são a hélice-volta-hélice, o dedo de zinco e o homeodomínio.
Proteínas regulatórias também contêm domínios para interações proteína-proteína, incluindo o zíper de leucina e a hélice-alça-hélice, que estão envolvidos na dimerização, e outros motivos envolvidos na ativação da transcrição. A mistura e a combinação de variantes de famílias de proteínas em fatores de transcrição diméricos fornecem uma regulação de resposta mais eficiente por meio do controle combinatório.
28.2 Regulacao da expressao genica em bacterias
Primeiramente, serão examinados os óperons da lactose e triptofano; cada sistema apresenta proteínas regulatórias, mas os mecanismos gerais de regulação são muito diferentes.
O óperon lac sofre regulação positiva
As interações operador-repressor-indutor descritas inicialmente para o óperon lac fornecem um modelo intuitivamente satisfatório para um interruptor ligado/ desligado na regulação da expressão gênica. O ambiente de uma bactéria é complexo demais para que seus genes sejam controlados por um sinal. Outros fatores além da lactose afetam a expressão dos genes lac, tais como a disponibilidade de glicose.Um mecanismo regulatório conhecido como repressão de catabólitos restringe a expressão dos genes necessários para o catabolismo de lactose, arabinose e outros açúcares na presença de glicose, mesmo quando esses açúcares secundários também estão presentes. O efeito da glicose é mediado pelo cAMP, como coativador, e uma proteína ativadora conhecida como proteína receptora de cAMP, ou CRP (a proteína às vezes é chamada de CAP, ou seja, proteína ativadora de genes para catabólitos). A CRP é um homodímero (subunidade Mr 22.000) com sítios de ligação para o DNA e o cAMP. A ligação é mediada por um motivo hélice-volta-hélice no domínio de ligação de DNA da proteína (Figura 28-16). Quando a glicose está ausente, a CRP-cAMP se liga a um sítio próximo do promotor lac (Figura 28-17) e estimula a transcrição de RNA em 50 vezes. A CRP-cAMP é, portanto, um elemento regulatório positivo que responde aos níveis de glicose, enquanto o repressor Lac é um elemento regulatório negativo que responde à lactose. Os dois atuam em conjunto. 
CRP--cAMP tem pouco efeito no óperon lac quando o repressor Lac está bloqueando a transcrição, e a dissociação do repressor do operador lac, tem pouco efeito na transcrição do óperon lac, a menos que o CRP-cAMP esteja presente para facilitar a transcrição; quando a CRP não está ligado, o promotor do lac do tipo selvagem é um promotor relativamente fraco (Figura 28-17a, c). O complexo aberto de RNA-polimerase e promotor (ver Figura 26-6) não se forma prontamente, a menos que a CRP-cAMP esteja presente. A CRP interage diretamente com a RNA-polimerase (na região mostrada na Figura 28-16) por meio da subunidade a da polimerase.
O efeito da glicose na CRP é mediado pela interação com a cAMP (Figura 28-17). A CRP se liga ao DNA mais avidamente quando as concentrações de cAMP estão altas. Na presença de glicose, a síntese de cAMP é inibida e o efluxo de cAMP da célula é estimulado. À medida que ela declina [a cAMP], a CRP a ligação ao DNA diminui, reduzindo a expressão do óperon lac. Portanto, forte indução do óperon lac precisa tanto de lactose (para inativar o repressor lac) quanto de baixa concentração de glicose (para disparar um aumento na cAMP e maior ligação de cAMP à CRP). 
Uma rede de óperons com um regulador comum é chamada de regulon. Esse arranjo, que permite mudanças coordenadas nas funções celulares que precisam da ação de centenas de genes é um tema central na expressão regulada de redes dispersas de genes em eucariotos.
Muitos genes para as enzimas da biossíntese de aminoácidos são regulados pela atenuação da transcrição
Os genes para as enzimas necessárias para sintetizar um determinado aminoácido estão geralmente agrupados em um óperon e são expressos sempre que as reservas existentes de aminoácidos sejam inadequadas para as necessidades celulares. Quando os aminoácidos são abundantes, as enzimas de biossíntese não são necessárias e o óperon é reprimido. O óperon do triptofano (trp) de E. coli (Figura 28-18) inclui cinco genes para as enzimas necessárias para converter corismato em triptofano. duas das enzimas catalisam mais de uma etapa na via. O mRNA do óperon trp tem meia-vida de apenas cerca de 3 minutos, permitindo que a célula responda rapidamente às variações de necessidade desse aminoácido. O repressor Trp é um homodímero.
Quando o triptofano é abundante, ele se liga ao repressor de Trp, provocando uma mudança conformacional que permite ao repressor se ligar ao operador trp e inibir a expressão do óperon trp. O sítio do operador trp se sobrepõe ao promotor, de modo que a ligação do repressor bloqueia a ligação da RNA-polimerase.
Concentrações celulares diferentes de triptofano podem variar a velocidade de síntese das enzimas de biossíntese em uma faixa de 700 vezes. Uma vez que a repressão seja suspensa e a transcrição se inicie, a velocidade de transcrição é ajustada às necessidades celulares de triptofano por um segundo processo regulatório, chamado de atenuação da transcrição, em que a transcrição é iniciada normalmente, mas é abruptamente interrompida antes que os genes do óperon sejam transcritos. A frequência com que a transcrição é atenuada é regulada pela disponibilidade de triptofano e depende da associação muito estreita entre transcrição e tradução em bactérias.
O mecanismo de atenuação do óperon trp emprega sinais codificados em quatro sequências no interior de uma região líderde 162 nucleotídeos na extremidade 5’ do mRNA, antecedendo o códon de iniciação do primeiro gene. No interior do líder se encontra uma região conhecida como atenuadora. Essas sequências pareiam para formar uma estrutura em grampo rica em G≡C seguida de perto por uma série de resíduos de U. A estrutura atenuadora atua como terminador da transcrição. A sequência é um complemento alternativo à sequência 3 (Figura 28- 19c). Se as sequências 2 e 3 pareiam, a estrutura atenuadora não pode se formar e a transcrição continua para os genes da biossíntese de trp; a alça formada pelas sequências pareadoras 2 e 3 não obstruem a transcrição.
A sequência regulatória 1 é crucial para um mecanismo sensível ao triptofano que determina se a sequência 3 pareia com a sequência 2 (permitindo que a transcrição continue) ou com a sequência 4 (atenuando a transcrição). A formação da estrutura atenuadora em grampo depende de eventos que ocorrem durante a tradução da seqüência regulatória 1, que codifica um peptídeo líder (assim chamado porque ele é codificado pela região líder do mRNA) de 14 aminoácidos, dois dos quais são resíduos de Trp. O peptídeo lider é traduzido imediatamente depois que ele é transcrito, por um ribossomo que acompanha de perto a RNA-polimerase à medida que a transcrição prossegue.
Quando as concentrações de triptofano são altas, as concentrações de tRNA de triptofano com carga também são altas. Isso permite que a tradução prossiga rapidamente após os dois códons Trp da sequência 1 e para a seqüência 2, antes da sequência 3 ser sintetizada pela RNA-polimerase.
Nessa situação, a sequência 2 é coberta pelo ribossomo e indisponível para pareamento com a sequência 3 quando a mesma é sintetizada; a estrutura atenuadora (sequência 3 e 4) se forma e a transcrição é interrompida (Figura 28-19b, acima). Quando as concentrações de triptofano são baixas, no entanto, o ribossomo para nos dois códons Trp na seqüência 1, pois o tRNATrp com carga está menos disponível. A sequência 2 permanece livre enquanto a sequência 3 é sintetizada, permitindo que essas duas sequências pareiem e que a transcrição prossiga. Desse modo, a proporção de transcritos que é atenuada diminui à medida que a concentração de triptofano diminui.
A indução da resposta SOS requer a destruição das proteínas repressoras
Dano extenso ao DNA no cromossomo bacteriano dispara a
indução de muitos genes localizados a distância. Essa resposta, chamada de resposta SOS. As proteínas regulatórias chave são a proteína RecA e o repressor LexA. 
Repressor LexA(Mr 22.700) inibe a transcrição de todos os genes SOS (Figura 28-20), e a redução da resposta SOS requer a remoção de LexA. Isso não é uma simples. repressor LexA é inativado quando ele catalisa sua própria clivagem em uma ligação peptídica específica Ala-Gly, produzindo dois fragmentos proteicos aproximadamente iguais. No pH fisiológico, essa reação de autoclivagem precisa da proteína RecA. Ela não é uma protease no sentido clássico, mas uma interação com LexA facilita a reação de autoclivagem do repressor. Essa função da RecA é às vezes chamada de atividade de coprotease.
	A protease RecA fornece a ligação funcional entre o sinal biológico (dano do DNA) e indução dos genes SOS. Danos intensos do DNA levam a numerosos intervalos em uma das fitas do DNA. Por fim, a ligação de RecA nos intervalos ativa sua atividade de coprotease, levando à clivagem do repressor de LexA e à indução SOS. Durante a indução da resposta SOS em uma célula danificada gravemente, a RecA também quebra e, portanto, inativa os repressores que, caso contrário, permitem a propagação de certos vírus em um estado lisogênico dormente no interior do hospedeiro bacteriano.
A síntese de proteínas ribossomais é coordenada com a síntese de rRNA.
uma crescente demanda celular por síntese proteica é contemplada pelo aumento do número de ribossomos em vez de alterações na atividade de ribossomos individuais. Os óperons de r-proteínas são regulados principalmente por um mecanismo de feedback da tradução. Uma r-proteína codificada por cada óperon também funciona como um repressor de tradução, que se liga ao mRNA transcrito daquele óperon e bloqueia a tradução de todos os genes que o mensageiro codifica. Em geral, a r-proteína que desempenha o papel de repressora também se liga diretamente a um rRNA. Cada r-proteína repressora da tradução se liga com maior afinidade ao rRNA apropriado do que ao seu mRNA, de modo que o mRNA é ligado e a tradução reprimida apenas quando o nível da r-proteína excede aquele do rRNA. Isso garante que a tradução dos mRNA que codificam as r-proteínas seja reprimida apenas quando a síntese dessas r-proteínas excede aquela necessária para fazer ribossomos funcionais. Desse modo, a velocidade da síntese de r-proteína é mantida em equilíbrio com a disponibilidade de rRNA.
O sítio de ligação do mRNA para o repressor da tradução está próximo do sítio de início da tradução de um dos genes no óperon, geralmente o primeiro gene. Em outros óperons isso afetaria apenas aquele gene, porque nos mRNA policistrônicos bacterianos a maioria dos genes tem sinais de tradução independentes.
A regulação coordenada pelas concentrações de aminoácidos é conhecida como resposta estringente Quando as concentrações de aminoácidos são baixas, a síntese de rRNA é interrompida. A falta de aminoácidos leva à ligação de tRNA não carregados ao sítio ribossomal A; isso dispara uma sequência de eventos que se inicia com a ligação de uma enzima chamada fator estringente (proteína RelA) ao ribossomo. Quando ligado ao ribossomo, o fator estringente catalisa a formação do nucleotídeo raro guanosina tetrafosfato (ppGpp; ver Figura 8-39); ele adiciona pirofosfato à posição 3’ do GTP, na reação GTP + ATP → pppGpp + AMP, e então uma fosfo-hidrolase remove um fosfato para formar ppGpp. O aumento abrupto nos níveis de ppGpp em resposta à falta de aminoácidos resulta em uma grande redução na síntese de rRNA, mediada pelo menos em parte pela ligação de ppGpp à RNA-polimerase.
O funcionamento de alguns mRNA é regulado por pequenos RNA em cis ou em trans
Uma molécula de RNA separada pode se ligar ao mRNA “em trans” e afetar sua atividade. Alternativamente, uma porção do próprio mRNA pode regular seu próprio funcionamento. Quando parte de uma molécula afeta o funcionamento de outra parte da mesma molécula, se fala que ela atua “em cis”. 
A regulação em cis envolve uma classe de estruturas de RNA conhecidas como riboswitches. Como descrito no Quadro 26-3, aptâmeros são moléculas de RNA, geradas in vitro, capazes de ligação específica a um tipo particular de ligante. Como se pode esperar, tais domínios de RNA ligadores de ligantes também estão presentes na natureza – em riboswitches – em um número significativo de mRNA bacterianos (e mesmo em alguns mRNA eucarióticos). Esses aptâmeros naturais são domínios estruturados encontrados em regiões não traduzidas nas extremidades 5’ de certos mRNA bacterianos. A ligação de um riboswitch de mRNA ao seu ligante apropriado resulta em uma mudança conformacional no mRNA, e a transcrição é inibida pela estabilização de uma estrutura prematura de terminação da transcrição, ou a tradução é inibida (em cis) pela oclusão do sítio de ligação de ribossomos (Figura 28-24). Na maioria dos casos, o riboswitch atua em um tipo de alça de feedback. A maioria dos genes regulados desse modo está envolvida na síntese ou transporte do ligante que é ligado pelo riboswitch; assim, quando o ligante está presente em altas concentrações, o riboswitch inibe a expressão dos genes necessários para reabastecer esse ligante. 
	Cada riboswitch se liga a apenas um ligante. O riboswitch do TPP bacteriano inibe a tradução em algumas espécies e induz a terminação prematura da transcrição em outras (Figura 28-24). O riboswitch de TPP eucariótico é encontrado nos íntrons de certos genes e modula o splicing alternativo daqueles genes (ver Figura 26-21). Ainda não está claro como são os riboswitches
Alguns genes são regulados porrecombinação genética
Agora será abordado outro modo de regulação gênica bacteriana, no nível de rearranjo-recombinação de DNA.
A Salmonella typhimurium, que habita o intestino de mamíferos, se move girando o flagelo na sua superfície celular. As várias cópias da proteína flagelina (Mr 53.000) que compõem o flagelo são alvo de destaque dos sistemas imunes de mamíferos. Porém, as células de Salmonella têm um mecanismo que evita a resposta imune: elas alternam entre duas proteínas flagelinas distintas (FljB e FliC) aproximadamente uma vez a cada 1.000 gerações, usando um processo chamado variação de fase.
	A troca é realizada pela inversão periódica de um segmento de DNA contendo o promotor para um gene da flagelina. A inversão é uma reação de recombinação sítio-específica (ver Figura 25-37) mediada pela recombinase Hin em sequências específicas de 14 pb (sequências hix) em cada extremidade do segmento de DNA. Quando o segmento de DNA está em uma orientação, o gene para a flagelina FljB eo gene que codifica um repressor (FljA) são expressos o repressor desliga a
expressão do gene para a flagelina FliC. Quando o segmento de DNA é invertido (Figura 28-26b), os genes fljA e fljB não são mais transcritos e o gene fliC é induzido à medida que o repressor começa a se esgotar. A recombinase Hin, codificada pelo gene hin no segmento de DNA que sofre inversão, é expressa quando o segmento de DNA está em qualquer orientação, de modo que a célula pode sempre trocar de um estado para outro.
	 Esse tipo de mecanismo regulatório tem a vantagem de ser absoluto: a expressão gênica é impossível quando o gene está fisicamente separado do seu promotor (observe a posição do promotor fljB na Figura 28-26b). Um interruptor ligado/desligado absoluto pode ser importante nesse sistema (embora ele afete apenas um dos dois genes de flagelinas), porque um flagelo com apenas uma cópia da flagelina errada pode ser vulnerável para abrigar anticorpos contra aquela proteína. O sistema Salmonella não é de maneira nenhuma único. Sistemas regulatórios semelhantes ocorrem em algumas outras bactérias e em alguns bacteriófagos, e sistemas de recombinação com funções semelhantes foram encontrados em eucariotos (Tabela 28-1). A regulação gênica por rearranjos de DNA que move genes e/ou promotores é particularmente comum em patógenos que se beneficiam pela alteração de seu leque de hospedeiros ou alterando suas proteínas de superfície, suplantando os sistemas imunes dos hospedeiros.
RESUMO 28.2 Regulação da expressão gênica em bactérias
c Além da repressão do repressor Lac, o óperon lac de E. coli sofre regulação positiva pela proteína receptora de cAMP (CRP). Quando a glicose é baixa, a cAMP é alta e a CRP-cAMP se liga a um sítio específico no DNA, estimulando a transcrição do óperon lac e produção de enzimas metabolizadoras de lactose. A presença de glicose deprime a cAMP, diminuindo a expressão do lac e de outros genes envolvidos no metabolismo de açúcares secundários. Um grupo de óperons regulados coordenadamente é chamado de regulon.
c Óperons que produzem as enzimas da síntese de aminoácidos têm um circuito regulatório chamado atenuação, que usa um sítio de terminação de transcrição (o atenuador) no mRNA. A formação do atenuador é modulada por um mecanismo que acopla transcrição e tradução enquanto responde a pequenas alterações na concentração de aminoácidos.
c No sistema SOS, múltiplos genes não ligados reprimidos por um único repressor são induzidos simultaneamente quando o dano no DNA dispara a proteólise autocatalítica do repressor facilitada pela proteína RecA. c Na síntese de proteínas ribossomais, uma proteína em cada óperon de r-proteína atua como repressor da tradução. O mRNA é ligado pelo repressor e a tradução é bloqueada apenas quando a r-proteína está presente com excesso de rRNA disponível.
c A regulação pós-transcrição de alguns mRNA é mediada por pequenos RNA que atuam em trans ou por riboswitches, parte da própria estrutura do mRNA, que atua em cis.
c Alguns genes são regulados por processos de recombinação genética que movem os promotores em relação aos genes sendo regulados. A regulação também pode ocorrer no nível da tradução.
28.3 Regulacao da expressao genica em eucariotos
É possível definir um estado fundamental de transcrição como a atividade inerente de promotores e da maquinaria de transcrição in vivo na ausência de sequências regulatórias. Em bactérias, a RNA-polimerase geralmente tem acesso a todos os promotores e pode se ligar e iniciar a transcrição com algum nível de eficiência na ausência de ativadores ou repressores; o estado fundamental de transcrição é, portanto, não restritivo. Em eucariotos, no entanto, promotores fortes são geralmente inativos in vivo na ausência de proteínas regulatórias; isto é, o estado fundamental de transcrição é restritivo. Essa diferença fundamental origina pelo menos quatro características importantes que distinguem a regulação da expressão gênica em eucariotos daquela em bactérias.
Primeiro, o acesso a promotores eucarióticos é restrito pela estrutura da cromatina, e a ativação da transcrição é associada com várias mudanças na estrutura da cromatina na região transcrita. Segundo, embora as células eucarióticas tenham tanto mecanismos regulatórios positivos quanto negativos, os mecanismos positivos predominam em todos os sistemas caracterizados até agora. Assim, uma vez que o estado fundamental de transcrição é restritivo, praticamente todo gene de eucariotos precisa de ativação para ser transcrito. Terceiro, células eucarióticas têm proteínas regulatórias multiméricas maiores e mais complexas do que as de bactérias. Finalmente, a transcrição no núcleo eucariótico é separada da tradução no citoplasma tanto no tempo como no espaço.
A cromatina ativa na transcrição é estruturalmente distinta da cromatina inativa
Os efeitos da estrutura do cromossomo na regulação gênica em eucariotos não possui um paralelo claro em bactérias. No ciclo da célula eucariótica, os cromossomos da interfase parecem, à primeira vista, dispersos e amorfos (ver Figura 24- 24). No entanto, várias formas de cromatina podem ser encontradas ao longo desses cromossomos. Cerca de 10% da cromatina em uma típica célula eucariótica estão em forma mais condensada do que o resto da cromatina. Essa forma, heterocromatina, é inativa na transcrição. A heterocromatina é geralmente associada a estruturas cromossômicas particulares – os centrômeros, por exemplo. A cromatina restante, menos condensada, é chamada de eucromatina.
A transcrição de um gene de eucariotos é fortemente reprimida quando o seu DNA está condensado no interior. da heterocromatina. Parte da eucromatina, mas não toda, é ativa na transcrição. As regiões dos cromossomos ativas na transcrição são distintas da heterocromatina por pelo menos três maneiras: o posicionamento dos nucleossomos, a presença de variantes de histonas e a modificação covalente dos nucleossomos. Essas mudanças estruturais na cromatina associadas à transcrição são coletivamente chamadas de remodelação da cromatina. A remodelação envolve enzimas que promovem essas alterações (Tabela 28-2).
Cinco famílias conhecidas de complexos enzimáticos reposicionam ativamente ou deslocam os nucleossomos, hidrolisando o ATP no processo. Três desses são particularmente importantes na ativação da transcriçãoO SWI/SNF, encontrado em todas as células eucarióticas, contém pelo menos seis polipeptídeos nucleares
que juntos remodelam a cromatina de modo que os nucleossomos se tornam mais irregularmente espaçados. Também estimulam a ligação do fator de transcrição. O complexo inclui um componente chamado de bromodomínio perto da terminação carboxila da subunidade ATPase ativa, que interage com as caudas de histonas acetiladas. O SWI/ SNF não é necessário para a transcrição de todos os genes. NURF, membro da família ISW1, remodela a cromatina de formas que complementam e se sobrepõem à atividade da SWI/SNF. Esses dois complexos enzimáticos são cruciais na
preparaçãode uma região da cromatina para a transcrição ativa. A terceira família de proteínas importante apresenta um papel um pouco diferente. A cromatina ativa na transcriçãotende a ser deficiente em histona H1, que se liga ao DNA de ligação entre as partículas do nucleossomo. Essas regiões de cromatina também são enriquecidas das variantes de histonas H3.3 e H2AZ (ver Quadro 24-2). Alterações no conteúdo de histonas são novamente mediadas por enzimas especializadas e complexos proteicos. A deposição de H2AZ envolve membros dessa terceira família de enzimas remodeladoras dependentes de ATP, chamadas de SWR1.
A modificação covalente de histonas é alterada drasticamente no interior da cromatina ativa na transcrição. As histonas nucleares das partículas dos nucleossomos (H2A, H2B, H3, H4)
A acetilação e metilação de histonas figura com destaque nos processos que ativam a cromatina para transcrição. Essas metilações facilitam a ligação das acetiltransferases de histona (HATs), enzimas que acetilam resíduos específicos de Lys. 
Onde a cromatina está sendo ativada para transcrição, as histonas nucleossomais são acetiladas adicionalmente por HAT nucleares (tipo A). A acetilação de resíduos Lys específicos é crucial para a interação de nucleossomos com outras proteínas. Quando
a transcrição de um gene não é mais necessária, o grau de acetilação de nucleossomos naquela vizinhança é reduzido pela atividade das desacetilases de histonas (HDAC), como parte de um processo geral de silenciamento de genes que restaura a cromatina a um estado transcricionalmente inativo. Além da remoção de certos grupos acetil, nova
modificação covalente de histonas marca a cromatina como transcricionalmente inativa.
O efeito final da remodelação da cromatina no contexto da transcrição é o de tornar um segmento de cromossomo mais acessível e “marcá-lo” (modificar quimicamente) para facilitar a ligação e atividade dos fatores de transcrição que regulam a expressão do gene ou genes naquela região.
A maioria dos promotores eucarióticos é regulada positivamente
Uma razão importante para o aparente predomínio da regulação positiva parece óbvia: o armazenamento do DNA no interior da cromatina efetivamente torna a maioria dos promotores inacessíveis, de modo que os genes são silenciosos na ausência de outra regulação. A estrutura de cromatina afeta o acesso a alguns promotores mais do que outros, mas repressores que se ligam ao DNA de modo a impedir o acesso da RNA-polimerase (regulação negativa) seriam, com frequência, simplesmente redundantes.
Um controle combinatorial, portanto, se torna importante em um genoma grande (Figura 28- 27). A especificidade pela ativação da transcrição pode ser melhorada se cada uma de várias proteínas regulatórias positivas ligar sequências de DNA específicas para ativar um gene. A necessidade de ligação de várias proteínas regulatórias positivas a sequências específicas de DNA reduz enormemente a probabilidade de ocorrência aleatória de uma justaposição funcional de todos os sítios de ligação necessários. Além disso, o número real de proteínas regulatórias que deve ser codificado por um genoma para regular todos os seus genes pode ser reduzido.
Em princípio, uma estratégia combinatória semelhante poderia ser usada por múltiplos elementos regulatórios negativos, mas isso nos leva à segunda razão para o uso da regulação positiva: ela é simplesmente mais eficiente. Se os ,25.000 genes no genoma humano fossem regulados negativamente, cada célula teria de sintetizar, em todos os momentos, todos os diferentes repressores em concentrações suficientes para permitir a ligação específica a cada gene “indesejado”. Em uma regulação positiva, a maioria dos genes é geralmente inativa (isto é, as RNA-polimerases não se ligam aos promotores) e a célula sintetiza apenas as proteínas ativadoras necessárias para promover a transcrição de um subconjunto de genes necessário na célula naquele momento. 
Ativadores de ligação de DNA e coativadores facilitam a montagem dos fatores gerais de transcrição
Continuando o estudo da regulação da expressão gênica em eucariotos, serão abordadas as interações entre promotores e RNA-polimerase II (Pol II), a enzima responsável pela síntese de mRNAs de eucariotos. Embora muitos (mas não todos) promotores de Pol II incluam a TATA box e sequências Inr (iniciadoras), com seu espaçamento padrão (ver Figura 26-8), eles variam enormemente tanto no número quanto na localização de sequências adicionais necessárias para a regulação da transcrição.
Sequências regulatórias adicionais, geralmente ligadas por ativadores de transcrição, são geralmente chamadas de potenciadores (enhancers) em eucariotos superiores e sequências ativadoras a montante (UAS) em leveduras. Um típico potenciador pode ser encontrado a centenas ou mesmo milhares de pares de bases a montante do início do sítio de transcrição, ou até mesmo a jusante dele, no interior do próprio gene. Quando ligado pelas proteínas regulatórias apropriadas, um potenciador aumenta a transcrição nos promotores vizinhos independente de sua orientação no DNA. 
A ligação bem-sucedida da holoenzima da RNA-polimerase II ativa a um dos seus promotores geralmente requer a ação combinada de proteínas, entre os cinco tipos que foram descritos até agora: (1) ativadores de transcrição, que se ligam a potenciadores ou UAS e facilitam a transcrição; (2) reguladores da arquitetura, que facilitam o looping do DNA; (3) modificação da cromatina e proteínas remodeladoras, descrita anteriormente; (4) coativadores; e (5) fatores de transcrição basais (ver Figura 26-9, Tabela 26-2), necessária na maior parte dos promotores da Pol
II (Figura 28-28). Os coativadores atuam indiretamente – não se ligando ao DNA – e são necessários para a comunicação essencial entre os ativadores e o complexo composto da Pol II e dos fatores de transcrição basal (ou geral). Além disso, várias proteínas repressoras interferem com a comunicação entre a RNA-polimerase e os ativadores, resultando na repressão da transcrição (Figura 28-28b). Aqui serão focalizados os complexos de proteínas mostrados na Figura 28-28 e como eles interagem para ativar a transcrição.
Ativadores da transcricao As necessidades para ativadores variam muito de um promotor para outro. Alguns poucos ativadores são conhecidos por facilitar a transcrição em centenas de promotores, enquanto outros são específicos de alguns poucos promotores. Muitos ativadores são sensíveis à ligação de moléculas sinalizadoras, fornecendo a capacidade de ativar ou desativar a transcrição em resposta a um ambiente celular em mudança. Alguns potenciadores ligados por ativadores estão muito distantes da TATA box do promotor.
Reguladores de arquitetura
A resposta na maioria dos casos parece ser que, como indicado anteriormente, o DNA interveniente faz uma alça de modo que vários complexos de proteínas podem interagir diretamente. A formação da alça é estimulada por reguladores de arquitetura abundantes na cromatina, que se ligam ao DNA com especificidade limitada. Com mais
destaque, as proteínas do grupo de alta mobilidade (HMG) (Figura 28-28c; “alta mobilidade” se refere à sua mobilidade eletroforética nos géis de poliacrilamida) desempenham um papel estrutural importante na remodelação da cromatina e na ativação da transcrição.
Complexos de proteinas coativadoras
Alguns dos principais complexos proteicos de proteínas reguladoras que interagem com a Pol II foram definidos tanto geneticamente quanto bioquimicamente. Esses complexos coativadores atuam como intermediários entre os ativadores da transcrição e o complexo Pol II. Um coativador eucariótico principal, consistindo em
20 a 30 ou mais polipeptídeos em um complexo proteico, é chamado de Mediador
Mediador e inibir a iniciação da transcrição. O Mediador se liga fortemente ao domínio da carboxila terminal (CTD) da maior subunidade de Pol II. O complexo Mediador é necessário tanto para a transcrição basal quanto para a regulada em vários dos promotores usados pela PolII, e também estimula a fosforilação de CTD pela TFIIH (fator de transcrição basal).
Proteina ligadora de TATA O primeiro componente a se ligar na montagem de um complexo de pré-iniciação (PIC) na TATA box de um típico promotor Pol II é a proteína ligadora de TATA (TBP). Com frequência, a TBP faz parte de um complexo maior (,15 subunidades) chamado de TFIID. O complexo integral também inclui os fatores de transcrição basal TFIIB, TFIIE, TFIIF, TFIIH; Pol II; e talvez TFIIA. A regulação positiva, levando à transcrição, é imposta pelos ativadores e coativadores.
Muitos ativadores de transcrição têm uma afinidade significativa por seus sítios de ligação mesmo quando os sítios estão dentro da cromatina condensada. Em geral, a ligação dos ativadores é um evento que dispara a ativação seguinte do promotor. A ligação de um ativador pode permitir a ligação de outros, gradualmente deslocando alguns nucleossomos. A remodelação da cromatina ocorre então em estágios, facilitados pelas interações entre ativadores e HAT
ou complexos enzimáticos como SWI/SNF (ou ambos).
Mediador, por sua vez, fornece uma superfície de montagem para a ligação da primeira TBP (ou TFIID), em seguida a TFIIB, e então outros componentes do PIC, incluindo a RNA-polimerase II. O Mediador estabiliza a ligação da Pol II e seus fatores de transcrição associados e facilita muito a formação do PIC. A complexidade nesses circuitos regulatórios é regra em vez de exceção, com múltiplos ativadores ligados ao DNA promovendo a transcrição.
Ativacao reversivel da transcrição
Alguns ativadores podem adotar diferentes conformações, tornando-os capazes de servir como ativadores de transcrição ou como repressores. Por exemplo, alguns receptores de hormônios esteroides (descritos posteriormente) funcionam no núcleo como ativadores de transcrição, estimulando a transcrição de certos genes quando um sinal de um hormônio esteroide particular está presente. Quando o hormônio está ausente, as proteínas receptoras revertem a uma conformação repressora, impedindo a formação de PIC. Em alguns casos essa repressão envolve a interação com diacetilases de histonas e outras proteínas que ajudam a restaurar a cromatina circundante ao seu estado inativo na transcrição. O Mediador, quando inclui as subunidades inibitórias, pode também bloquear a iniciação da transcrição. Esse pode ser um mecanismo regulatório para garantir a montagem ordenada do PIC (ao atrasar a ativação da transcrição até que todos os fatores necessários estejam presentes), ou pode ser um mecanismo que ajude a desativar promotores quando a transcrição não é mais necessária.
Os genes do metabolismo da galactose em leveduras estão sujeitos tanto à regulação positiva quanto negativa
Alguns dos princípios gerais descritos acima podem ser ilustrados por um circuito regulatório eucariótico bem estudado (Figura 28-30). As enzimas necessárias para a importação e metabolismo de galactose em leveduras são codificadas por genes espalhados por vários cromossomos.
Cada um dos genes GAL é transcrito separadamente, e as células de leveduras não têm óperons como aqueles de bactérias. Entretanto, todos os genes GAL apresentam promotores semelhantes e são regulados coordenadamente por um conjunto comum de proteínas. 
A regulação da expressão gênica pela galactose envolve uma ação recíproca entre a Gal4p e duas outras proteínas, Gal80p e Gal3p (Figura 28-30). A Gal80p forma um complexo com a Gal4p, impedindo a Gal4p de funcionar como um ativador dos promotores GAL. Quando a galactose está presente, ela se liga à Gal3p, que então interage com o complexo Gal80p-Gal4p, permitindo que a Gal4p funcione como ativador nos vários promotores de GAL.
Outros complexos proteicos também desempenham papéis na ativação da transcrição dos genes GAL. Esses incluem o complexo SAGA para acetilação de histonas e remodelação da cromatina, o complexo SWI/SNF para remodelação da cromatina e o complexo Mediador. A proteína Gal4 é responsável pelo recrutamento desses fatores adicionais necessários para a ativação da transcrição.
Ativadores da transcrição têm estrutura modular
A interação de duas proteínas regulatórias é frequentemente mediada por domínios contendo zíperes de leucina (Figura 28-14) ou motivos hélice-alça-hélice (Figura 28-15). Aqui são abordados três tipos distintos de domínios estruturais usados na ativação por ativadores de transcrição (Figura 28-31a): Gal4p, Sp1 e CTF1.
A Gal4p contém uma estrutura semelhante a um dedo de zinco no seu domínio de ligação do DNA, perto da terminação amino; esse domínio tem seis resíduos Cys que coordenam Zn21. A proteína funciona como homodímero (com a dimerização mediada pelas interações entre duas espirais espiraladas) e se liga à UASG, sequência palindrômica de DNA de cerca de 17 pb de comprimento. A Gal4p tem um domínio de ativação separado com muitos resíduos de aminoácidos ácidos. Experimentos que substituem uma variedade de diferentes sequências peptídicas pelo domínio de ativação ácido da Gal4p sugerem que a natureza ácida desse domínio seja fundamental para seu funcionamento, embora sua sequência precisa de aminoácidos possa variar consideravelmente.
O domínio de ligação de DNA da proteína Sp1 está próximo da extremidade C-terminal e contém três dedos de zinco. Dois outros domínios na Sp1 funcionam na ativação e são notáveis pelo fato de 25% dos seus resíduos de aminoácidos serem Gln. Uma ampla variedade de outras proteínas ativadoras também apresenta esses domínios ricos em glutamina.
O CTF1 (fator de transcrição 1 ligado a CCAAT) pertence a uma família de ativadores de transcrição que se ligam a uma sequência chamada de sítio CCAAT (sua seqüência consenso é TGGN6GCCAA, em que N é qualquer nucleotídeo). O domínio de ligação de DNA do CTF1 contém muitos resíduos de aminoácidos básicos, e a região de ligação é provavelmente disposta como uma hélice a. Essa proteína não apresenta nem um motivo hélice-volta-hélice nem um motivo dedo de zinco; seu mecanismo de ligação de DNA ainda não é claro. O CTF1 tem um domínio de ativação rico em prolina, com a Pro sendo responsável por mais de 20% dos resíduos de aminoácidos
A ativação distinta e os domínios de ligação do DNA das proteínas regulatórias muitas vezes atuam de modo completamente independente, como foi demonstrado em experimentos de “troca de domínios”. 
A expressão gênica eucariótica pode ser regulada por sinais intercelulares e intracelulares
Os efeitos de hormônios esteroides (e dos hormônios da tireoide e retinoide, que têm modo de ação semelhante) fornecem exemplos adicionais bem conhecidos de modulação de proteínas regulatórias de eucariotos pela interação direta com sinais moleculares (ver Figura 12-30). Ao contrário de outros tipos de hormônios, os hormônios esteroides não precisam se ligar a receptores de membrana plasmática. Em vez disso, eles interagem com receptores intracelulares que são eles próprios ativadores de transcrição. Hormônios esteroides (p. ex., estrogênio, progesterona e cortisol) hidrofóbicos demais para se dissolverem prontamente no sangue são transportados por proteínas carreadoras específicas do seu ponto de liberação a seus tecido-alvo. Neles, o hormônio passa através da membrana plasmática por difusão simples. Uma vez no interior da célula, os hormônios interagem com um de dois tipos de receptor nuclear de ligação de esteroides (Figura 28-32). Em ambos os casos, o complexo hormônio-receptor atua ligando-se a sequências de DNA altamente específicas chamadas de elementos de resposta hormonal (HRE), alterando desse modo a expressão gênica.
As sequências de DNA (HRE) às quais os complexos receptores de hormônios se ligam são semelhantes em comprimento e arranjo, mas diferem em sequência, para os diversos hormônios esteroides.
O complexo hormônio-receptor se liga ao DNA como um dímero, com os domínios dedo de zinco de cada monômero reconhecendo uma das sequências de seis nucleotídeos. A capacidade de um determinado hormônio agir por meio de um complexo hormônio-receptor para alterara expressão de um gene específico depende da sequência exata do HRE, de sua posição relativa no gene e do número de HRE associados ao gene.
Alguns receptores hormonais, incluindo o receptor de progesterona humano, ativam a transcrição com a ajuda de um coativador raro – ativador de RNA receptor de esteroides (SRA), um RNA de ,700 nucleotídeos. O SRA atua como parte de um complexo de ribonucleoproteína, mas é o componente de RNA que é necessário para a coativação
A regulação pode resultar da fosforilação de fatores de transcrição nuclear
Esse mecanismo geral controla os
efeitos de vários hormônios não esteroides. Por exemplo, a via β adrenérgica que leva a níveis elevados de cAMP citosólico, que atua como mensageiro secundário em eucariotos, bem como em bactérias (ver Figuras 12-4, 28-17), também afeta a transcrição de um conjunto de genes, cada um dos quais localizado perto de uma sequência de DNA específica chamada de elemento de resposta de cAMP (CRE). A subunidade catalítica da proteína-cinase A, liberada quando os níveis de cAMP aumentam (ver Figura 12-6), entra no núcleo e fosforila uma proteína nuclear, a proteína de ligação de CRE (CREB). Quando fosforilada, a CREB se liga aos CRE perto de certos genes e atua como um fator de transcrição, ligando a expressão desses genes.
Muitos mRNA de eucariotos estão sujeitos à repressão da tradução
Ao contrário da estreita associação entre transcrição e tradução em bactérias, os transcritos gerados em um núcleo eucariótico devem ser processados e transportados ao citoplasma antes da tradução. Isso pode impor uma demora significativa no aparecimento de uma proteína. É necessário um rápido aumento na produção de proteínas quando um mRNA reprimido na tradução, já presente no citoplasma, pode ser
ativado para a tradução sem demora. A regulação da tradução pode desempenhar um papel especialmente importante na regulação de determinados genes muito longos de eucariotos (alguns são medidos em milhões de pares de bases), para os quais a transcrição e o processamento do mRNA podem durar muitas horas. Alguns genes são regulados tanto nos estágios de transcrição como nos de tradução, os últimos desempenhando um papel de ajuste fino nos níveis de proteínas celulares. Em algumas células anucleadas, como reticulócitos (eritrócitos imaturos), o controle da transcrição
está inteiramente ausente e o controle da tradução dos mRNA armazenados se torna essencial. Como descrito a seguir, os controles na tradução podem também ter significado espacial durante o desenvolvimento, quando a tradução regulada dos mRNA pré-posicionados cria um gradiente local do produto proteico.
Os eucariotos têm pelo menos quatro mecanismos principais de regulação da tradução.
Fatores de iniciação da tradução estão sujeitos à fosforilação por proteínas-cinases. Em geral, as formas fosforiladas são menos ativas e provocam uma diminuição geral da tradução na célula.
Algumas proteínas se ligam diretamente ao mRNA e atuam como repressores da tradução, muitos dos quais se ligando a sítios específicos na região 3’ não traduzida (3’UTR). Posicionadas dessa forma, essas proteínas interagem com outros fatores de iniciação de transcrição ligados ao mRNA ou com a subunidade ribossomal 40S para impedir a iniciação da tradução (Figura 28-34).
Proteínas de ligação, presentes em eucariotos desde leveduras a mamíferos, interrompem a interação entre eIF4E e eIF4G (ver Figura 27-28). As versões dos mamíferos são conhecidas como 4E-BPs (proteínas de ligação eIF4E). Quando o crescimento celular é lento, essas proteínas limitam a tradução ao se ligarem ao local em eIF4E que normalmente interagem com eIF4G. Quando o crescimento celular é retomado ou aumenta em resposta aos fatores de crescimento ou outros estímulos, as proteínas de ligação são inativadas pela fosforilação de proteínas dependentes de cinase.
A regulação da expressão gênica mediada por RNA, abordada posteriormente, frequentemente ocorre no nível da repressão da tradução. A variedade de mecanismos de regulação da tradução fornece flexibilidade, permitindo a repressão centrada em alguns poucos mRNA ou regulação global de toda a tradução celular.
A maturação dos reticulócitos inclui a destruição do núcleo celular, deixando para trás uma membrana plasmática carregada de hemoglobina. Os RNA mensageiros depositados no citoplasma antes da perda do núcleo permitem a reposição de hemoglobina. Quando os reticulócitos se tornam deficientes em ferro ou grupos heme, a tradução de mRNA de globina é reprimida. Uma proteína-cinase chamada HCR (repressor controlado por hemina) é ativada, catalisando a fosforilação do eIF2.
O silenciamento gênico pós-transcrição é mediado por RNA de interferência
Em eucariotos superiores, incluindo nematódeos, moscas-da-fruta, plantas e mamíferos, uma classe de pequenos RNA chamados de microRNA (miRNA) está envolvida no silenciamento de vários genes. Os RNA funcionam ao interagirem com mRNA, frequentemente na 3’-UTR, resultando ou na degradação do mRNA ou na inibição da tradução. Portanto, o gene que o produz, é silenciado. Essa forma de regulação gênica controla o tempo de desenvolvimento em pelo menos alguns organismos. Ela também é usada como um mecanismo de proteção contra vírus de RNA invasores (particularmente importantes em plantas, que não possuem sistema imune) e para controlar a atividade de transposons. Além disso, pequenas moléculas de RNA podem desempenhar um papel importante (mas ainda indefinido) na formação da heterocromatina.
Muitos miRNA estão presentes apenas transitoriamente durante o desenvolvimento, sendo às vezes chamados de pequenos RNA temporais (stRNA, do inglês small temporal RNA). Eles são transcritos como RNA precursores de cerca de 70 nucleotídeos de comprimento, com sequências complementares internas que formam estruturas em grampo. Os precursores são clivados por endonucleases como Drosha e Dicer para formar duplexes curtos de cerca de 20 a 25 nucleotídeos de comprimento.
Uma fita de miRNA processado é transferida para o mRNA-alvo (ou para o RNA de um vírus ou transposon), levando à inibição da tradução ou degradação do RNA (Figura 28-35). Alguns miRNA se ligam e afetam um único mRNA e, portanto, afetam a expressão de apenas um único gene. Outros interagem com muitos mRNA e assim formam o núcleo mecânico dos regulons que coordenam a expressão de muitos genes.
Se um pesquisador introduz em um organismo uma molécula dupla de RNA correspondendo em sequência a praticamente qualquer mRNA, o Dicer quebra o duplex em segmentos pequenos, chamados de pequenos RNA interferentes (siRNA, do inglês small interfering RNA). Esses se ligam ao mRNA e o silenciam (Figura 28-35b). O processo é conhecido como RNA de interferência (RNAi). Em plantas, praticamente qualquer gene pode ser desligado dessa maneira. Nematódeos ingerem prontamente RNA funcionais inteiros, e simplesmente introduzindo o RNA duplo na dieta do verme se produz uma supressão muito eficiente do gene-alvo. 
A regulação da expressão gênica mediada por RNA assume várias formas em eucariotos
Os RNA de função especial em eucariotos incluem os miRNA, descritos acima; os snRNA, envolvidos no splicing do RNA (ver Figura 26-16); e os snoRNA, envolvidos na modificação do rRNA (ver Figura 26-25). Todos os RNA que não codificam proteínas, incluindo os rRNA e tRNA, recebem a designação geral de ncRNA (RNA não codificadores, do inglês noncoding RNA). Os genomas de mamíferos parecem codificar mais RNAnc do que mRNA codificadores (ver Quadro 26-4). De modo não surpreendente, classes funcionais adicionais de RNAnc ainda estão sendo descobertas.
Muitos dos exemplos encontrados recentemente interagem com proteínas em vez de com RNA, e afetam o funcionamento das proteínas ligadas.
A resposta de choque térmico em células humanas fornece outro exemplo. O fator de choque térmico 1 (HSF1) é uma proteína ativadora que, em células não estressadas, existe em forma de monômero ligado pela chaperona Hsp90. Sob condições
de estresse, o HSF1 é liberadoda Hsp90 e trimeriza. O trímero do HSF1 se liga ao DNA e ativa a transcrição de genes cujos produtos são necessários para lidar com o estresse.
Um ncRNA chamado HSR1 (RNA de choque térmico 1; ,600 nucleotídeos) estimula a trimerização do HSF1 e a ligação do DNA. O HSR1 não atua sozinho; ele funciona em um complexo com o fator de alongamento da tradução eEF1A. 
RNA adicionais afetam a transcrição de várias maneiras. Além do seu papel no splicing (ver Figura 26-16), o snRNA U1 se liga diretamente ao fator de transcrição TFIIH.
O desenvolvimento é controlado por cascatas de proteínas regulatórias
O ciclo de vida da mosca-da-fruta inclui a metamorfose completa durante sua progressão de um embrião paraum adulto. Entre as características mais importantes do embrião estão sua polaridade (as partes anteriores e posteriores do animal são prontamente reconhecidas, bem como suas partes dorsal e ventral) e sua metameria (o corpo do embrião é composto por segmentos repetidos em série, cada um deles com traços característicos). Durante o desenvolvimento, esses segmentos se organizam em cabeça, tórax e abdome. Cada segmento do tórax do adulto tem um conjunto diferente de apêndices. O desenvolvimento desse padrão complexo está sob controle genético e foram descobertos vários genes reguladores de padrões que afetam drasticamente a organização do corpo.
O ovo de Drosophila, junto com 15 células protetoras, é circundado por uma camada de células folicularesÀ medida que a célula ovo se forma (antes da fecundação), os mRNA e proteínas que se originam das células protetoras e foliculares são depositados no interior da célula-ovo, onde alguns deles desempenham um papel crítico no desenvolvimento. Assim que um óvulo fecundado é depositado, seu núcleo se divide e seus núcleos descendentes continuam a se dividir em sincronia a cada 6 a 10 minutos. Membranas plasmáticas não se formam em torno dos núcleos, distribuídos no interior do citoplasma do ovo (formando um sincício). Entre a oitava e nona rodadas da divisão nuclear, os núcleos migram para a camada externa do ovo, formando uma monocamada de núcleos envolvendo o citoplasma comum rico em vitelo; trata-se da sincício blastoderme. Após algumas divisões adicionais, as invaginações de membrana envolvem os núcleos para criar uma camada de células que formam uma blastoderme celular. Nesse estágio, os ciclos mitóticos nas várias células perdem sua sincronia. O destino do desenvolvimento das células é determinado pelos mRNA e proteínas originalmente depositados no ovo pelas células protetoras e foliculares.
As proteínas que, por meio de alterações na concentração local ou atividade, fazem o tecido circundante adotar um formato ou estrutura particular, são algumas vezes chamadas de morfógenos; elas são os produtos de genes reguladores de padrões. Como definido por Christiane Nüsslein-Volhard, Edward B. Lewis e Eric F. Wieschaus,três classes principais de genes reguladores de padrão – genes maternos, de segmentação e homeóticos – funcionam em estágios sucessivos do desenvolvimento para especificar as características básicas do corpo do embrião de Drosophila. Os genes maternos são expressos no óvulo não fertilizado e os mRNA maternos resultantes permanecem dormentes até a fertilização. Eles fornecem a maioria das proteínas necessárias bem no início do desenvolvimento, até que a blastoderme celular esteja formada. Algumas das proteínas codificadas por mRNA maternos dirigem a organização espacial do embrião em desenvolvimento nos estágios iniciais, estabelecendo sua polaridade. Os genes de segmentação, transcritos após a fecundação, orientam a formação do número adequado de segmentos corporais. Pelo menos três classes de genes de segmentação atuam em estágios sucessivos: os genes gap dividem o embrião em desenvolvimento em várias regiões grandes e os genes pair-rule, junto com os genes da polaridade do segmento, definem 14 listras que se tornam os 14 segmentos de um embrião normal. Os genes homeóticos são expressos ainda mais tarde; eles especificam quais órgãos e apêndices irão se desenvolver em segmentos corporais específicos.
O eixo anteroposterior em Drosophila é definido pelo menos em parte pelos produtos dos genes bicoid e nanos. O produto do gene bicoid é um importante morfógeno anterior e o produto do gene nanos é um importante morfógeno posterior. O mRNA do gene bicoid é sintetizado pelas células protetoras e depositado no ovo não fertilizado perto do seu polo anterior. O gene nanos tem um papel análogo, mas o seu mRNA é depositado na extremidade posterior do ovo e o gradiente anteroposterior de proteína atinge seu pico no polo posterior. A proteína Nanos é um repressor da tradução. 
Além dos mRNA bicoid e nanos, depositados assimetricamente no ovo, vários outros mRNA maternos são depositados uniformemente no citoplasma do ovo.
A proteína Hunchback desempenha um papel importante no desenvolvimento da extremidade anterior e também é um regulador da transcrição de vários genes, em alguns casos um regulador positivo, em outros casos, negativo
A Bicoid suprime a tradução de caudal na extremidade anterior e também atua como ativador da transcrição de hunchback na blastoderme celular. Como hunchback é expresso tanto a partir de mRNA quanto de genes no ovo em desenvolvimento, ele é considerado tanto um gene materno quanto um gene de segmentação. O resultado das atividades de. Bicoid é um aumento da concentração de Hunchback na extremidade anterior do ovo. As proteínas Nanos e Pumilio atuam como repressores de tradução de hunchback, suprimindo a síntese de sua proteína próximo da extremidade posterior do ovo.
A perda dos genes Hox em moscas-da-fruta por mutação ou deleção provoca o aparecimento de um apêndice normal ou estrutura corporal em uma posição corporal inadequada. Um exemplo importante é o gene ultrabithorax (ubx). Quando o funcionamento de Ubx é perdido, o primeiro segmento abdominal se desenvolve incorretamente, tendo a estrutura do terceiro segmento torácico. Outras mutações homeóticas conhecidas provocam a formação de um conjunto extra de asas, ou duas patas na posição da cabeça em que antenas são normalmente encontradas.
Células-tronco têm potencial de desenvolvimento que pode ser controlado
Um humano adulto tem muitos tipos de tecidos diferentes. Muitas das células se diferenciam definitivamente e não mais se dividem. Se um órgão funciona defeituosamente em razão de doença ou um membro é perdido em um acidente, os tecidos não são prontamente repostos. A maioria das células não é facilmente reprogramada em virtude dos processos regulatórios em curso ou mesmo devido à perda de parte ou de todo o DNA genômico. Se os seres humanos conseguissem regenerar seus próprios órgãos, membros ou tecido nervoso, a rejeição não seria mais um problema. Curas reais para a falência renal ou distúrbios neurodegenerativos se tornariam realidade.
A chave para a regeneração de tecidos se encontra nas células-tronco – células que retiveram a capacidade de se diferenciar em vários tecidos. Em seres humanos, depois que um óvulo é fecundado, as primeiras divisões celulares criam uma bola de células totipotentes (a mórula), células com a capacidade de se diferenciar individualmente em qualquer tecido ou mesmo em um organismo completo (Figura 28-43). A divisão celular contínua produz uma
bola oca, um blastocisto. As células mais externas do blastocisto acabam formando a placenta. As camadas mais internas formam as camadas germinativas do feto em desenvolvimento – o ectoderma, mesoderma e endoderma. Essas células são pluripotentes: originam células de todas as três camadas germinativas e se diferenciam em muitos tipos de tecidos. Entretanto, não se diferenciam em um organismo completo. Algumas dessas células são unipotentes: desenvolvem-se em apenas um tipo de célula e/ou tecido.
São as células pluripotentes do blastocisto, as células-tronco embrionárias, atualmente usadas na pesquisa de células-tronco embrionárias.
As células-tronco têm duas funções: repor a si mesmas e, aomesmo tempo, fornecer células que podem se diferenciar. Essas tarefas são realizadas de muitas maneiras (Figura 28-44a). Todas ou parte das células-tronco embrionárias podem, em princípio, estar envolvidas na reposição, diferenciação ou ambos.
Outros tipos de células-tronco têm o potencial de serem usados para fins médicos. No organismo adulto, células-tronco adultas, como produtos de diferenciação adicional, têm um potencial mais limitado de desenvolvimento posterior do que as células-tronco embrionárias. Por exemplo, as células-tronco hematopoiéticas da medula óssea podem dar origem a muitos tipos de células sanguíneas e também a células com a capacidade de regenerar ossos. Elas são chamadas de multipotentes. Entretanto, essas células não podem se diferenciar em um fígado, rim ou neurônio. Frequentemente se diz que as células-tronco adultas têm um nicho, microambiente que promove a manutenção da célula-tronco, enquanto ao mesmo tempo permite a diferenciação de algumas células- filhas como substitutas das células no tecido em que atuam (Figura 28-44b). As células-tronco hematopoiéticas na medula óssea ocupam um nicho em que a sinalização de células vizinhas e outras dicas mantêm a linhagem de células- tronco. Ao mesmo tempo, algumas células-filhas se diferenciam para fornecer as células sanguíneas necessárias. Compreender o nicho em que as células-tronco operam, e os sinais que o nicho fornece, é essencial nos esforços para aproveitar o potencial das células-tronco para a regeneração de tecidos.
Todas as células-tronco têm problemas em relação às aplicações médicas no homem. As células-tronco adultas têm uma capacidade limitada de regenerar tecidos, estão presentes geralmente em número pequeno e são difíceis de serem isoladas de um humano adulto. Células-tronco embrionárias têm um potencial de diferenciação muito maior e podem ser mantidas em meio de cultura para gerar grande número de células. Entretanto, seu uso é acompanhado por preocupações éticas relacionadas à necessária destruição de embriões humanos. A identificação de uma fonte de células-tronco abundante e clinicamente útil, que não suscite preocupações, permanece um objetivo central da pesquisa médica. A capacidade de manter células-tronco em cultura (ou seja, mantê-las em estado indiferenciado) e manipulá-las para crescer e se diferenciar em tecidos particulares resulta, em grande parte, da compreensão da biologia do desenvolvimento. A identificação e a manutenção em cultura de células-tronco pluripotentes de blastocistos humanos foram relatadas cultura muito diferentes, otimizadas para permitir a divisão celular indefinidamente sem diferenciação. As células- tronco embrionárias de camundongos crescem em uma camada de gelatina e precisam da presença de um fator de inibição de leucemia (LIF). As células-tronco embrionárias humanas crescem em uma camada de alimentação de fibroblastos embrionários de camundongo e precisam do básico fator de crescimento de fibroblastos (bFGF ou FGF2). O uso de uma camada de alimentação implica que as células de camundongo estejam fornecendo um produto difusível ou algum sinal de superfície, ainda desconhecido, que é necessário para as células-tronco humanas para promover a divisão celular ou impedir a diferenciação.
RESUMO 28.3 Regulação da expressão gênica em eucariotos
Em eucariotos, a regulação positiva é mais comum do que a regulação negativa e a transcrição é acompanhada por grandes alterações na estrutura da cromatina.
Em geral, promotores para a Pol II têm uma TATA box e sequência Inr, bem como múltiplos sítios de ligação para ativadores de transcrição. Esses últimos sítios, algumas vezes localizados centenas ou milhares de pares de bases distantes da TATA box, são chamados de sequências ativadoras a montante em leveduras e potenciadores em eucariotos superiores.
Grandes complexos de proteínas são geralmente necessários para regular a atividade de transcrição. Os efeitos dos ativadores de transcrição na Pol II são mediados pelos complexos de proteínas coativadoras tais como Mediador. As estruturas modulares dos ativadores têm ativação e domínios de ligação do DNA distintos. Outros complexos proteicos, incluindo as histonas acetiltransferases e complexos dependentes de ATP tais como SWI/SNF e NURF, remodelam reversivamente e modificam a estrutura da cromatina.
Hormônios afetam a regulação da expressão gênica em uma de duas maneiras. Os hormônios esteroides interagem diretamente com receptores intracelulares que são proteínas regulatórias de ligação de DNA; a ligação do hormônio tem efeitos positivos ou negativos na transcrição dos genes-alvo do hormônio. Hormônios não esteroides se ligam a receptores na superfície das células, disparando uma via de sinalização que pode levar à fosforilação de uma proteína regulatória, afetando sua atividade.
A regulação mediada por RNA desempenha um importante papel na expressão gênica eucariótica, com a extensão de mecanismos conhecidos aumentando.
O desenvolvimento de um organismo pluricelular apresenta o desafio regulatório mais complexo. O destino das células no embrião inicial é determinado pelos gradientes de proteínas anteroposterior e dorsoventral que atuam como ativadores de transcrição ou repressores de tradução, regulando os genes necessários para o desenvolvimento de estruturas apropriadas a uma parte específica do organismo. Conjuntos de genes regulatórios operam em sucessão temporal e espacial, transformando determinadas áreas de uma célula ovo em estruturas previsíveis no organismo adulto.
 A diferenciação de células-tronco em tecidos funcionais pode ser controlada por sinais e condições extracelulares.