Protocolo Padrão de Técnicas Histológicas Animal LAMEB 2017 1

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UNIVERSIDADE FEDERAL DE SANTA CATARINA 
CENTRO DE CIÊNCIAS BIOLÓGICAS - CCB 
LABORATÓRIO MULTIUSUÁRIO DE ESTUDOS EM BIOLOGIA 
REVISADO EM 26/07/2017 
 
Protocolo padrão de técnicas histológicas animal 
Para microscopia de luz 
 
 
GERAL: 
 1 - Coleta e Dissecação 
 2 - Fixação 
 3 - Processamento (desidratação, diafanização e inclusão em parafina) 
 4 - Emblocamento 
 5 - Microtomia 
 6 - Coloração 
 7 - Montagem das Lâminas com Resina 
 
 
 PASSO A PASSO: 
 
1) COLETA E DISSECAÇÃO 
 
 Se o órgão for muito grande deve-se fazer a macrotomia deste antes; 
 Colocar as secções em cassetes e identifica-los a lápis. 
 
 
2) FIXAÇÃO 
 
 Esta etapa consiste na utilização de substâncias que interrompam o metabolismo celular, 
estabilizando as estruturas e os componentes bioquímicos intra e extracelulares, mantendo 
assim a arquitetura normal do tecido. Além disso, os fixadores também fornecem maior 
resistência ao tecido para suportar as demais etapas; 
 Dependendo do tipo de análise deve-se optar por um fixador específico, por exemplo, 
para análise em microscopia de fluorescência, é muito utilizado o paraformaldeído 
tamponado. Neste caso não se deve utilizar o glutaraldeído, pois este gera autofluorescência. 
Para microscopia de luz branca o glutaraldeído é um ótimo fixador, mas pode-se utilizar 
também o paraformaldeído. A formalina tamponada também é utilizada para microscopia de 
luz branca, mas para uma análise histológica mais geral, não é indicada para análises mais 
detalhadas; 
 O volume do fixador deve ser em torno de 20x o volume das amostras. 
 
FIXADORES: 
 
 PARAFORMALDEÍDO 4% TAMPONADO – PH 7,2: 
 
PFA (Paraformaldeído) .............................................. 12 g 
Água destilada ........................................................... 150 mL 
PBS 0,2M ................................................................... 150 mL 
Hidróxido de Sódio ..................................................... 2 pedrinhas ou 3 gotas (1N) 
 
 
 
Preparo: 
 Aquecer a água destilada até 70°C, no misturador, colocar o imã (bailarina) e liga-lo, 
acrescentando aos poucos o PFA; 
 Jogar duas pedrinhas ou mais de hidróxido de sódio ou de 3 a 5 gotas de hidróxido de 
sódio 1N até a mistura ficar clara e homogênea (transparente); 
 Por último, acrescentar a solução de PB 0,2M; 
 Medir o pH (pH ~ 7,2) e filtrar a solução. 
 
Observações: 
 O material deve permanecer no fixador de 12-24h; 
 Lavar 3x em tampão fosfato de sódio 0,1M, pH 7,2 (30 minutos) e em seguida em H2O 
destilada por 1 hora antes de iniciar a desidratação. 
 
 
 FORMALINA NEUTRA TAMPONADA – PH 7,2: 
 
 Formol 37% ................................................................. 100 ml 
 Água destilada ............................................................. 900 ml 
 Fosfato de Sódio Monobásico (1H2O) ......................... 4,0 gramas 
 Fosfato de Sódio Dibásico (7H2O) .............................. 12,2 gramas 
 
ou 
 
 Formol 37% ............................................................... 100 ml 
 Água destilada ............................................................ 900 ml 
 Fosfato de Sódio Monobásico (Anidro) ...................... 4,0 gramas 
 Fosfato de Sódio Dibásico (Anidro) ............................ 6,5 gramas 
 
Observações: 
 O material deve permanecer no fixador por aproximadamente 24h; 
 Lavar 3x em tampão fosfato de sódio 0,1M, pH 7,2 (30 minutos) e em seguida em H2O 
destilada por 1 hora antes de iniciar a desidratação. 
 
 
 GLUTARALDEÍDO 2,5% TAMPONADO – PH 7,2: 
Glutaraldeído 25% .................................................................. 5mL 
Tampão Fosfato de Sódio 0,1M ............................................. 45mL 
 
Observações: 
 O material deve permanecer no fixador de 4-24h; 
 O Glutaraldeído não deve ser usado para testes de imunofluorescência; 
 Lavar 3x em tampão fosfato de sódio 0,1M, pH 7,2 (30 minutos) e em seguida em H2O 
destilada por 1 hora antes de iniciar a desidratação. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Solução Tampão Fosfato de Sódio (PBS - 0,2M) 
 
Água destilada .......................................................... 1 L 
Fosfato de Sódio dibásico anidro .............................. 11g 
Fosfato de Sódio monobásico monohidratado ...........2,75g 
 
Solução Tampão Fosfato de Sódio (PBS - 0,1M) 
 
Água destilada ........................................................... 1 L 
Tampão PBS 0,2M .................................................... 1 L 
 
3) PROCESSAMENTO 
 Esta etapa consiste na impregnação do tecido por uma substância de consistência firme que 
permita, posteriormente, a realização de secções finas (5 a 10 m); 
 Devido ao preço, fácil manuseio e bons resultados, a parafina é a mais utilizada neste 
procedimento; 
 Como a parafina não é miscível em água, a primeira etapa da inclusão compreende a 
desidratação das amostras, quando ocorre então a retirada da água dos tecidos através da 
substituição por álcool etílico; 
 A diafanização é a etapa seguinte, com a substituição do álcool, agora presente nos tecidos, 
por xilol, solvente que é ao mesmo tempo miscível em álcool e parafina; 
 Finalmente, na impregnação, última etapa, o xilol é substituído por parafina fundida a 60°. 
 
 
 1ª DESIDRATAÇÃO 
 
Sequência: 
 Álcool etílico 30 % ________________________ 1 hora 
 Álcool etílico 50 % ________________________ 1 hora 
 Álcool etílico 70 % ________________________ 1 hora 
 Álcool etílico 80 % ________________________ 1 hora 
 Álcool etílico 90 % ________________________ 1 hora 
 Álcool etílico 100 % I ______________________ 1 hora 
 Álcool etílico 100 % II _____________________ 1 hora 
 
Observação: 
 A amostra pode ser conservada no álcool 70% por alguns dias. 
 
 
 2º DIAFANIZAÇÃO 
 
Seqüência: 
 1º Xilol I (50% de Álcool100% e 50% de Xilol) ________ 40 minutos 
 2º Xilol II (Puro) ________________________________ 40 minutos 
 
 
Conseqüências: 
 O tecido torna-se transparente. Retira a gordura dos tecidos. 
 
Observações: 
 A ausência de turvação indica boa desidratação. 
 Os tecidos não podem ficar muito tempo no Xilol. 
 O Xilol é hidrofóbico, por isso os órgãos inicialmente ficam mergulhados no álcool. 
 Usa-se o Xilol para retirar o álcool, pois este não é miscível em parafina. 
 
 
 3º INCLUSÃO NA PARAFINA 
 
 Parafina I ___________________________ 3 horas 
 Parafina II ___________________________ 3 horas 
 Parafina III __________________________ 3 horas 
 
Importante: 
 A partir da etapa do álcool 70%, O LAMEB 
disponibiliza, aos usuários cadastrados, o Processador de 
Amostras Leica TP1020. 
 
 
 
4) EMBOCAMENTO 
 
 Colocar a parafina no molde de metal e então posicionar a amostra de acordo com o 
corte que se pretende realizar (longitudinal, transversal...); 
 Após os blocos estarem duros, esperar pelo menos 24 horas para iniciar o 
seccionamento. O ideal é colocar os blocos na geladeira antes de utilizá-los no micrótomo. 
 
 
Importante: 
 Para esta etapa, o LAMEB 
disponibiliza, aos usuários cadastrados, o 
Emblocador de Amostras Leica 
EG1150H. 
 
 
05) MICROTOMIA 
 
 Fazer os cortes de 5 a 10 micrômetros 
utilizando um micrótomo rotativo; 
 Pegar a fita e colocar em água aquecida com gelatina a aproximadamente 45 °C, pegar o 
corte com a lâmina. 
 
Solução para distender o corte no banho-maria 
 
 Gelatina em pó incolor _________________ 4 gramas 
 Água aquecida (55ºC) ____________________ 2 litros 
 
 
Observação: 
 Antes da coloração, colocar previamente as lâminas em 
estufa entre 40 °C e 55 °C, ideal 50°C, ou placa aquecida 
para derretimento da parafina, poraproximadamente 1 
hora. Isto ajuda a fixar o corte na lâmina. 
 
 
Importante: 
 Para esta etapa, o LAMEB disponibiliza, aos 
usuários cadastrados, o Micrótomo Rotativo Leica 
RM2255. 
 
 
http://lameb.ccb.ufsc.br/protocolos-processador-de-amostras-leica-tp1020/
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06) COLORAÇÃO 
 
 Nesta etapa ocorre a desparafinização (retirada da parafina) dos cortes na lâmina, em seguida é 
realizada a hidratação para então ocorrer a coloração do tecido. 
 
 
 COLORAÇÃO H.E. (HEMATOXILINA E EOSINA) 
 
 
Sequência: 
 1º - Xilol Puro I (desparafinização) __________________________ 10 minutos 
 2º - Xilol Puro II (desparafinização) __________________________ 10 minutos 
 3º - Álcool 100 % I (hidratação) _____________________________ 5 minutos 
 4º - Álcool 100% II (hidratação) _____________________________ 5 minutos 
 5º - Álcool 90% (hidratação) ________________________________ 5 minutos 
 6º - Álcool 80% (hidratação) ________________________________ 5 minutos 
 7º - Álcool 70% (hidratação) ________________________________ 5 minutos 
 8º - Álcool 50% (hidratação) ________________________________ 5 minutos 
 9º - Água (hidratação) _____________________________________ 10 minutos 
 10º - Hematoxilina de Meyer (coloração) _______________________ 3 minutos 
 11º - Água Corrente (lavagem) ______________________________ 10 minutos 
 12º - Eosina amarelada (coloração) ___________________________ de 8 a 20 minutos 
 13º - Água Corrente (lavagem) ______________________________ 1 minuto 
 14º - Álcool 70% (desidratação) _____________________________ 2 minutos 
 15º - Álcool absoluto I (desidratação) _________________________ 3 minutos 
 16º - Álcool Absoluto II (desidratação) ________________________ 3 minutos 
 17º - Xilol I (50% de Álcool100% e 50% de Xilol) _______________ 5 minutos 
 18º - Xilol II Puro (Fixação do corante e conservação do material) __ 10 minutos 
 
Observação: 
 Na última etapa (Xilol II) pode ficar mais que 10 
minutos. 
 
 
Importante: 
 Para esta etapa, o LAMEB disponibiliza, aos 
usuários cadastrados, o Sistema de Coloração de 
Lâminas Leica AutoStainer XL. 
 
 
 
07) MONTAGEM DA LÂMINA COM LAMÍNULA 
 
Sequência: 
 1º - Pingar 2 gotas de resina líquida (Entelan, 
Permount, Bálsamo do Canadá...); 
 2º - Colocar a lamínula sobre a lâmina; 
 3º - Pressionar levemente para tirar as bolhas; 
 4º - Levar as lâminas até a estufa para secagem ou 
deixar secando ao ar livre; 
 5º - etiquetar as lâminas. 
 
Importante: 
 Para esta etapa, o LAMEB disponibiliza, aos usuários 
cadastrados, o Aplicador de Lamínulas Leica CV5030. 
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