Roteiro TOXICOLOGIA E ANALISES TOXICOLÓGICAS

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Roteiros 
Toxicologia e Análises Toxicológicas
Regras e normativas sobre segurança no laboratório
1. Durante a aula prática, mantenha sempre atenção ao roteiro, tendo-o sempre 
próximo a você. Pode ser efetuada marcação com caneta sob cada item realizado do 
experimento de forma a não se perder durante a execução.
2. Leia sempre o roteiro antes de iniciar a prática e mesmo antes das explicações do 
professor.
3. Observe a localização do material e dos equipamentos de emergência (chuveiro, 
lava-olhos etc.).
4. Não abra qualquer recipiente antes de reconhecer seu conteúdo pelo rótulo.
5. Não pipete líquidos diretamente com a boca, use pipetas adequadas.
6. Não tente identificar um produto químico pelo odor ou pelo sabor.
7. Não deixe de utilizar os equipamentos de proteção.
8. Não adicione água aos ácidos, mas os ácidos à água.
9. Não trabalhe com sandálias, chinelos ou sapatos abertos e com salto no laboratório.
10. Sempre identifique o conteúdo presente nos frascos ou nos tubos utilizados no 
experimento com caneta para vidros. Isso facilita seu descarte adequado por parte dos 
responsáveis pelo laboratório.
11. Mantenha os solventes em recipientes adequados e devidamente tampados, bem 
como materiais inflamáveis longe de fontes de calor (bico de Bunsen).
12. Utilize a capela sempre que manipular reagentes ou solventes que liberem vapores.
13. Conheça as propriedades tóxicas das substâncias químicas antes de empregá-las 
pela primeira vez no laboratório. Caso tenha dúvidas, consulte o professor ou o técnico 
a respeito.
14. Se tiver cabelo longo, prenda-o ao realizar qualquer experiência no laboratório. Não 
se alimente e nem ingira líquidos nos laboratórios.
15. O uso dos EPIs é obrigatório em qualquer laboratório e procedimento a ser 
realizado e é de responsabilidade do discente trazê-los consigo a cada aula prática a ser 
realizada.
Instituto de 
Ciências da Saúde
Disciplina: Toxicologia e Análises Toxicológicas
Título da Aula: Padronização de fármacos por 
cromatografia em camada delgada (Ccd)
ROTEIRO 1
Objetivo
Padronizar o comportamento do fármaco na realização de testes rápidos utilizados 
como triagem da exposição do organismo a fármacos ou drogas.
Amostra 
Padrões
1. Ácido acetilsalicílico
Reagentes e soluções 
Agentes cromogênicos
1. Solução de cloreto férrico (FeCl₃) 5%
Sistema solvente
Cuba ácida: clorofórmio:acetona (9:1)
Técnica
1. Aplicar 40 vezes a solução padrão em uma placa cromatográfica, por meio de 
tubos capilares ou micropipetas. Deve-se atentar que o diâmetro do solvente não 
deve ultrapassar 5 mm, uma vez que manchas muito grandes podem descaracterizar a 
identificação da substância. Um secador de cabelo a frio pode ser utilizado para 
evaporar o solvente mais rapidamente e aplicar a 2,0 cm da borda inferior da placa.
2. Colocar a cromatoplaca em uma cuba de desenvolvimento previamente saturada 
contendo o sistema solvente clorofórmio: acetona (9:1). Após o desenvolvimento 
das placas (10 cm, a partir do ponto de aplicação), retirá-las das cubas e deixá-las à 
temperatura ambiente para a completa evaporação do solvente, sob capela.
3. A seguir, revelar a cromatoplaca com FeCl3 e avaliar o comportamento da mancha.
4. Expressar os resultados segundo a forma da mancha, cor da mancha e hRf.
Materiais Quantidades
Acetona 100 mL
Ácido acético 50 mL
Clorofórmio 500 mL
Éter de petróleo 100 mL
Fe(NO3)3.9H2O Nitrato férrico nano-hidratado 40 g
Iodeto de potássio 4,0 g
Metanol 100 mL
NaOH 1 g
Nitrato de bismuto 2,0 g
Solução de cloreto férrico 10 g
Sulfato de sódio 10 g
Equipamentos Quantidades
Placa cromatográfica de sílica gel (0,25 mm de espessura) 1
Capilar de vidro para aplicação em cromatografia 2
Cuba de vidro 1
Nebulizador 1
Bomba a vácuo 1
Descarte do material utilizado conforme normas internacionais de segurança.
Instituto de 
Ciências da Saúde
Disciplina: Toxicologia e Análises Toxicológicas
Título da Aula: Triagem em urina por cromatografia 
em camada delgada (Ccd). Extração líquido/líquido e 
identificação de fármacos por Ccd
ROTEIRO 2
Objetivo
Teste rápido para triagem da exposição do organismo a fármacos ou drogas de abuso e 
extração de substâncias em material biológico.
Amostra 
Padrões
1. Ácido acetilsalicílico
Reagentes e soluções 
Agentes cromogênicos
Solução de cloreto férrico (FeCl3) 5%
Sistema solvente
Cuba ácida: clorofórmio:acetona (9:1)
Técnica de extração
Extração de substâncias de caráter ácido e neutro
1. Colocar 10 mL da amostra em funil de separação (125 mL) e ler o pH.
2. Ajustar o pH entre 4,0 e 5,0 por meio de solução de H2SO4 1%.
3. Extrair 20 mL da mistura clorofórmio:éter (3:1), agitando vigorosamente o funil por 
1 minuto.
4. Deixar o funil em repouso por 5 minutos para a separação das fases.
5. Filtar a camada orgânica sobre Na2SO4 1% anidro, previamente umedecido com a 
mistura clorofórmio: éter. Recolher o extrato em béquer.
6. Repetir os itens 3 e 4, recolhendo o filtrado no mesmo béquer.
7. Evaporar o solvente à secura e reservar o resíduo (Ra = ácido).
8. Desprezar o remanescente aquoso, que ficou no funil de separação.
Técnica de identificação
Proceder a análise do resíduo Ra por cromatografia em camada delgada (CCD) nas 
condições previamente padronizadas.
Materiais Quantidades
Acetona 100 mL
Ácido acético 50 mL
Clorofórmio 500 mL
Éter de petróleo 100 mL
Fe(NO3)3.9H2O Nitrato férrico nona-hidratado 40 g
Iodeto de potássio 4,0 g
Metanol 100 mL
NaOH 1 g
Nitrato de bismuto 2,0 g
Solução de cloreto férrico 10 g
Sulfato de sódio 10 g
Equipamentos Quantidades
Funil de separação (125 mL) 2
Bastão de vidro 1
Funil de vidro (capacidade de 100 mL) 1
Papel universal pH 2 fitas
Béquer (100 mL) 3
Placa cromatográfica de sílica gel (0,25 mm de espessura) 2
Capilar de vidro para aplicação em cromatografia 10
Cuba de vidro 2
Nebulizador 1
Descarte do material utilizado conforme normas internacionais de segurança.
Instituto de 
Ciências da Saúde
Disciplina: Toxicologia e Análises Toxicológicas
Título da Aula: Identificação de aflatoxina por 
cromatografia em camada delgada (Ccd)
ROTEIRO 3
Objetivo
Identificação de micotoxinas (aflatoxinas B1, B2, G1 e G2) presentes em alimentos, 
sementes, grãos ou rações, com extração por solventes orgânicos e Cromatografia em 
Camada Delgada (CCD).
Preparação da amostra
Triture ou moa, de acordo com a natureza da amostra, a fim de que se obtenha massa 
homogênea, podendo utilizar liquidificador, moinho ou moedor de carne. Passe a amostra 
pela peneira de 20 mesh. Homogeneíze novamente e retire uma subamostra de 30 g.
Extração e purificação
Pese 30 g da amostra previamente homogeneizada e transfira para um frasco Erlenmeyer. 
Adicione cerca de 10 mL de água aquecida a 60 ºC para facilitar a penetração do solvente 
orgânico nos tecidos hidrofílicos. Homogeneíze com bastão de vidro. Adicione 100 mL de 
clorofórmio, tampe o frasco com algodão e agite manualmente por 30 segundos. Prossiga 
essa operação com agitador mecânico por mais 30 minutos. Filtre o extrato clorofórmico 
em funil de vidro com papel de filtro qualitativo.
No caso de amostra de amendoim ou derivados, adicione pequena quantidade de celite 
ao funil para acelerar a filtração. Colete 50 mL do extrato em outro frasco Erlenmeyer 
e evapore em banho-maria a 80 ºC até que todo o clorofórmio tenha sido eliminado. 
Ressuspenda o resíduo com 50 mL de metanol, transfira quantitativamente para o funil de 
separação, adicione 50 mL da solução de NaCl a 4% e agite lentamente. Extraia as gorduras 
e os demais interferentes com três porções de 50 mL de hexano. Descarte a fração com 
hexano (superior). Recolha o extrato metanólico em béquer ou frasco Erlenmeyer.
Transfira quantitativamente o extrato metanólico para um funil de separação limpo e 
extraia as aflatoxinas com 50 mL de clorofórmio, agitando o funil de separação suavemente 
por três minutos. Deixe as fases se separarem e recolha a inferior (clorofórmio) em frascoErlenmeyer de 250 mL. Repita a operação com mais 50 mL de clorofórmio. Recolha o 
total de clorofórmio juntamente com o extrato da primeira partição e evapore em 
banho-maria a 80 ºC ou rotavapor a (50-60) ºC. O resíduo deve ser transferido 
quantitativamente com clorofórmio para um frasco Erlenmeyer de 25 ou 50 mL e evaporado 
sob corrente de nitrogênio. Para efetuar a cromatografia em camada delgada, dissolva 
o resíduo em clorofórmio em quantidade adequada, normalmente entre 200 a 500 μL 
e utilize banho de ultrassom por cerca de 30 segundos para assegurar total dissolução 
das aflatoxinas.
Triagem das micotoxinas por cromatografia em camada delgada 
Aplique em placa de sílica gel 5 a 10 μL da amostra e alguns pontos de cada padrão 
separadamente, fazendo sobrepor no segundo ponto do padrão 5 μL da amostra. 
Desenvolva o cromatograma em cuba previamente preparada para garantir a saturação 
com tolueno-acetato de etila-ácido fórmico (50:40:10). Remova a placa depois de 12 cm 
de desenvolvimento do solvente e seque. Observe o cromatograma sob lâmpada de luz UV 
de comprimento de onda longo. Excepcionalmente, na ausência do ácido fórmico, utilizar 
clorofórmio-acetona (90:10).
Materiais Quantidades
Celite
Clorofórmio 100 mL
Metanol 300 mL
Cloreto de sódio
Cloreto de potássio 2 g
Hexano
Algodão 1
Equipamentos Quantidades
Agitador mecânico 1
Balão volumétrico (25 mL) 1
Banho-maria ou rotavapor 1
Bastão de vidro 2
Béquer (500 mL) 1
Cubeta para leitura no espectrofotômetro 2
Erlenmeyer (25 ou 50 mL) 1
Funil de separação 1
Lâmpada de luz UV de comprimento de onda longo 1
Liquidificador, moinho ou moedor de carne 1
Papel de filtro qualitativo 2
Peneira de 20 mesh 1
Placas cromatográficas de sílica gel (0,25 mm de espessura) 1
Rotavapor 1
Tubo de ensaio 2
Papel-alumínio 1
Descarte do material utilizado conforme normas internacionais de segurança.
Referências
ASSOCIATION OF OFFICIAL ANALYTICAL CHEMISTS. Official Methods of Analysis of the 
Association of Official Analytical Chemists. 15 th, v. 2. Arlington: AOAC, 1990, p. 1184-
1199.
INSTITUTO ADOLFO LUTZ. Normas analíticas do Instituto Adolfo Lutz. 2. ed. v. 1. Métodos 
químicos e físicos para análise de alimentos. São Paulo: IMESP, 1976, p. 323-325.
PRZYBYLSKI, W. Formation of aflatoxin derivatives on thin-layer chromatographic 
plates. J. Assoc. Off. Analyt. Chem., v. 58, 1975, p. 163-164.
STACK, M. E.; POHLAND, A. E. Colaborative study of a method for chemical confirmation 
of the identity of aflatoxin. J. Assoc. Off. Analy. Chem., v. 58, 1975, p. 110- 113.
VELASCO, J. Replacement of benzene as a solvent for aflatoxin standards. J. Am. Oil 
Chem. Soc., 1981, p. 938A-940A.
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Ciências da Saúde
Disciplina: Toxicologia e Análises Toxicológicas
Título da Aula: Determinação da carboxi-hemoglobinemia ROTEIRO 4
Objetivo
Determinar os níveis de carboxi-hemoglobina de amostras biológicas para verificar se 
estão dentro dos limites máximos permitidos.
Amostra
Sangue. Deve ser colhido no final da jornada de trabalho em vacutainer-heparinizado e 
conservado a 4 ºC por, no máximo, uma semana. Para os fumantes devem ser colhidas duas 
amostras, antes e após a jornada de trabalho.
Reagentes e soluções
 � Sol. Tampão pH = 6,85: KH2PO4 (fosfato monobásico de potássio)/K2HPO4 (fosfato 
dibásico de potássio) 0,1M.
 � Sol. Hemolisante: diluir o tampão com água de 1:10. Preparar semanalmente.
 � Sol. Diluente: dissolver 25 mg de hidrossulfito de sódio em 20 mL de sol. Tampão. 
Preparar antes do uso.
Técnica
1. Em um tubo de ensaio com tampa, colocar 0,1 mL de sangue (amostra) e 12 mL de 
solução hemolisante. Agitar e deixar em repouso por 10 minutos.
2. Diluir 0,2 mL do hemolisado com 2,3 mL de solução diluente. Tampar.
3. Deixar à temperatura ambiente por 10 minutos. Ler a absorvância a 420 e 432 nm, 
usando como branco a solução diluente.
Cálculo da carboxi-hemoglobina
% COHb = 1 – (AR . F1) x 100 
AR (F2 – F1) – F3 + 1
Sendo: AR = Abs. 420 
Abs. 432
F1 = Abs. Hb 432
Abs. Hb 420
F2 = Abs. HbCO 432 
Abs. HbCO 420
F3 = Abs. HbCO 420
Abs. Hb 420
AR= A 420/ A 432
F1= A Hb red 432 / A Hbred 420 (1,3330) 
F2= A HbCO 432 / A Hb red 420 (0,4787) 
F3= A HbCO 420 / A Hb red 432 (1,9939)
Interpretação
O Índice Biológico Permitido (IBMP) é de 3,5% e o Valor de Referência (VR) é < 1%, 
ambos para não fumantes.
Materiais Quantidades
Amostra de sangue 2 mL
KH2PO4 3 g
K2HPO4 3 g
Hidrossulfito de sódio 25 mg
Água destilada 1 L
Equipamentos Quantidades
Espectrofotômetro 1
Cubeta para leitura no espectrofotômetro 1
Tubo de ensaio com tampa (10 mL) 3
Pipeta (5 mL) 2
Vórtex para agitação 1
Descarte do material utilizado conforme normas internacionais de segurança.
Referências
BEUTLER, E.; WEST. C. Simplified determination of carboxihemoglobin. Clin. Chem, 1984.
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Disciplina: Toxicologia e Análises Toxicológicas
Título da Aula: Determinação de nitrito em alimento ROTEIRO 5
Objetivo
Determinar os teores de nitrito como conservante em amostra de salsicha para verificar 
se estão dentro dos limites máximos permitidos segundo a legislação brasileira preconizados 
pelo Ministério da Agricultura.
Amostra
Salsichas.
Reagentes e soluções 
Solução I
Tetraborato de sódio deca-hidratado
(Na2B4O7. 10H2O). ..............................................................................50 g
Água destilada até completar 1 L
Solução II
Ferrocianeto de potássio tri-hidratado
K4Fe(CN)6 . 3H2O. ..............................................................................106 g
Água destilada até completar 1 L
Solução III
Acetato de zinco di-hidratado Zn(CH3COO)2 220 g
Ácido acético glacial. ..............................................................................30 mL
Água destilada até completar 1 L
Reagente cromogênico
Solução de alfa-naftol: aquecer 360 mL de água destilada e 50 mL de ácido acético a 
50 ºC. Transferir essa solução para um frasco escuro contendo 0,25 g de ácido sulfanílico. 
Agitar até dissolver, adicionar 0,20 g de alfa-naftol agitando bem. Esfriar à temperatura 
ambiente e adicionar 90 mL de solução de NH4OH a 10%. O pH dessa solução deverá ser 
4,0 +/- 0,5.
Solução tampão: em 500 mL de H2O destilada, adicionar 20 mL de HCl concentrado. 
Agitar e adicionar 50 mL de NH4OH concentrado e diluir com água destilada até 1000 mL. 
O pH obtido é de 9,6-9,7.
Solução padrão de nitrito: 0,25 g NaNO2 em 500 mL H2O.
Procedimento
Padronização
Transferir alíquotas de 1, 2, 4, 8 e 16 mL da solução padrão de nitrito de sódio em 
5 diferentes balões volumétricos de 100 mL; adicionar 5 mL do tampão e completar com 
H2O destilada, qsp 100 mL, em cada um dos balões.
Transferir 10 mL de cada alíquota da solução (1) para 5 diferentes balões volumétricos 
de 100 mL e completar com H2O destilada, qsp 100 mL, em cada um dos balões.
Transferir 5 mL de cada uma das soluções (2) em tubos de vidro e acrescentar 10 mL de 
reagente cromogênico, 5 mL de água destilada e 5 mL da solução tampão em cada um dos 
diferentes tubos.
Deixar em banho de H2O a 30 ºC por 30 minutos.
Leitura espectrofotométrica em 474 nm, contra um branco.
Obs.: o branco se constituirá de 10 mL do reagente cromogênico em 10 mL de água e 
5 mL tampão (deixar em banho de água a 30 ºC por 30 minutos).
Desproteinização
Pesar 10 g do alimento homogeneizado em um béquer de 150 mL. Adicionar 5 mL 
da solução I (bórax) e cerca de 40 mL de água destilada, à temperatura acima de 70 ºC. 
Aquecer em banho de água fervente por 15 minutos, agitando frequentemente. Deixar 
esfriar à temperatura ambiente. Adicionar 2 mL da solução II (ferrocianeto de potássio) e 2 
mL da solução III (acetato de zinco). Agitar vigorosamente após cada adição.
Transferir a amostra para um balão volumétrico de 100 mL. Deixar o balão em repouso 
por 30 minutos à temperatura ambiente.
Completar o volume com água destilada, qsp 100 mL. Agitar o conteúdo do balão 
vigorosamente e filtrar em papellivre de nitritos. Determinar a concentração de nitrito 
presente nessa solução.
Determinação de nitrito
Pipetar 10 mL da solução desproteinizada da amostra de alimento para um tubo 
de ensaio.
Adicionar 5 mL da solução tampão e 10 mL da solução de alfa-naftol.
Deixar em banho de água a 30 ºC, durante 30 minutos, esfriar à temperatura ambiente: 
ler em 474 nm. Calcular o valor de nitrito presente na amostra, usando a curva padrão 
previamente estabelecida.
Interpretação
Segundo a Portaria n. 1.004, de 11 de dezembro de 1998, da Secretaria de Vigilância 
Sanitária do Ministério da Saúde, a quantidade residual máxima de nitritos e nitratos 
em produtos cárneos, excetuando-se o charque brasileiro, é de 150 mg/kg e 300 mg/kg, 
respectivamente, expressos como sal de sódio.
Materiais Quantidades
Acetato de zinco di-hidratado – Zn(CH3COO)2 220 g
Ácido acético 50 mL
Ácido sulfanílico 0,25 g
Ácido acético glacial 30 mL
Água destilada 2 L
Alfa-naftol 0,20 g
Amostra de salsicha 10 g
Ferrocianeto de potássio tri-hidratado (K4Fe(CN)6 . 3H2O 106 g
HCl 20 mL
NaNO2 0,25 g
NH4OH 50 mL
NH4OH a 10% 90 mL
Tetraborato de sódio deca-hidratado (Na2B4O7 . 10H2O) 50 g
Equipamentos Quantidades
Bagueta de vidro 1
Banho de água fervente 1
Béquer (100 mL) 3
Cubeta para leitura no espectrofotômetro 1
Espectrofotômetro 1
Funil de vidro (100 mL) 1
Papel de filtro 2
Papel universal PH 2 fitas
Pipeta (1 mL) 2
Pipeta (10 mL) 2
Descarte do material utilizado conforme normas internacionais de segurança.
Referências
ARAÚJO, A. C. P. Determinação de nitratos e nitritos em alimentos destinados à 
população infantil. Dissertação de Mestrado apresentada à Faculdade de Ciências 
Farmacêuticas da Universidade de São Paulo, 1988.
LARA, W. H.; TAKAHASHI, M. Y.; SILVEIRA, N. Determinação de nitritos e nitratos em 
conservas de carne. Rev. Inst. Adolfo Lutz, 1978, p. 161-166.
MORIE, G. P. et al. Determination of Nitrate and Nitrite in Mixture with Nitrate ion 
eletrode. Ana. Clin. Acta., 1972, p. 397-403.
Nome do aluno: RA: Data: / / 
ATIVIDADE OBRIGATÓRIA 1
1. Explique como é feita experimentalmente a triagem da intoxicação por ácido 
salicílico na urina e a quantificação do ácido salicílico no sangue.
Visto do docente: (solicita-se evitar rubricas e, se possível, adicionar carimbo)
 
Nome do aluno: RA: Data: / / 
ATIVIDADE OBRIGATÓRIA 1
2. Caso a amostra de urina seja positiva para ácido salicílico, é indicada a 
administração de bicarbonato no paciente. Explique o porquê.
Visto do docente: (solicita-se evitar rubricas e, se possível, adicionar carimbo)
 
Nome do aluno: RA: Data: / / 
ATIVIDADE OBRIGATÓRIA 2
1. Explique como ocorre a intoxicação por aflatoxinas e quais as principais 
características da intoxicação.
Visto do docente: (solicita-se evitar rubricas e, se possível, adicionar carimbo)
 
Nome do aluno: RA: Data: / / 
ATIVIDADE OBRIGATÓRIA 3
1. Explique como é feita a diferenciação entre os quatro tipos principais de aflatoxinas 
nos ensaios de cromatografia em camada delgada. Cite as principais características de 
cada um dos tipos.
Visto do docente: (solicita-se evitar rubricas e, se possível, adicionar carimbo)
 
Nome do aluno: RA: Data: / / 
ATIVIDADE OBRIGATÓRIA 4
1. Equívocos pré-analíticos, ou seja, equívocos cometidos antes da análise toxicológica, 
não são incomuns. Para evitá-los, prioriza-se trabalhar com profissionais experientes 
e manter informada a equipe de analistas. Imaginemos que um laboratório de análise 
toxicológica coletasse o sangue do trabalhador, para análise de HbCO, no início da 
jornada. O que se espera desse resultado analítico? Justifique sua resposta.
Visto do docente: (solicita-se evitar rubricas e, se possível, adicionar carimbo)
 
Nome do aluno: RA: Data: / / 
ATIVIDADE OBRIGATÓRIA 4
2. Discorra sobre o risco de intoxicação de dois indivíduos, descritos a seguir:
 � Um trabalhador que apresenta nível de HbCO igual a 3,0% e que se expõe 
ocupacionalmente ao CO.
 � Uma pessoa não exposta ocupacionalmente ao CO e que apresenta como nível de 
HbCO igual a 3,0%.
Visto do docente: (solicita-se evitar rubricas e, se possível, adicionar carimbo)
 
Nome do aluno: RA: Data: / / 
ATIVIDADE OBRIGATÓRIA 5
1. Nitritos e nitratos são substâncias químicas adicionadas intencionalmente aos 
alimentos, com finalidades de realçar as propriedades organolépticas do alimento e 
inibir a proliferação bacteriana. Sob a ótica da toxicologia, qual é o significado de 
determinar os níveis desses sais nos alimentos industrializados?
Visto do docente: (solicita-se evitar rubricas e, se possível, adicionar carimbo)
 
Nome do aluno: RA: Data: / / 
ATIVIDADE OBRIGATÓRIA 6
1. Existem efeitos agudos decorrentes da intoxicação por nitritos? Quais são esses 
efeitos?
Visto do docente: (solicita-se evitar rubricas e, se possível, adicionar carimbo)