Eletroforese_Biolmol_2

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Professor:	
  Chris,an	
  Reis	
  
Disciplina:	
  Biologia	
  Molecular	
  
ELETROFORESE	
  
Eletroforese, do grego elektronphorese 
(conduzida pela eletricidade), refere-se 
ao deslocamento de biomoléculas numa 
m a t r i z s ó l i d a ( a g a r o s e o u 
poliacrilamida) pela ação de um campo 
elétrico. 
FATORES QUE INFLUENCIAM O 
DESLOCAMENTO DE 
BIOMOLÉCULA 
 Carga Elétrica (positiva, negativa ou 
neutra) 
Estrutura Tridimensional 
Tamanho da Biomolécula 
 
 
Carga Elétrica 
aplicada ao sistema, 
em um mesmo 
intervalo de tempo 
Moléculas diferentes 
migram com 
velocidades diferentes 
As menores migram 
mais rápido 
MATRIZES 
Matriz ou gel é o meio sólido onde ocorre a 
separação das biomoléculas. 
 
 AGAROSE 
 
 POLIACRILAMIDA 
 
 Agarose: polissacarídeo purificado de algas 
marinhas que apresenta baixa carga elétrica. 
Resolução do gel é a capacidade de 
separação de moléculas com peso molecular 
muito parecidos. 
 
 Ex. 2 fragmentos com diferença de tamanho 
de 100 pb. 
Não é possível separar em gel com agarose de 
0,5% de concentração 
Possível apenas em gel mais concentrado, por 
exemplo gel 2% concentração. 
9	
  
Eletroforese:	
  a concentração do gel 
Ø A	
  concentração	
  do	
  gel	
  
definirá	
  o	
  tamanho	
  dos	
  
poros	
  a	
  serem	
  
atravessados	
  pelas	
  
moléculas	
  em	
  migração.	
  
Ø  G e i s 	
   m u i t o	
  
c o n c e n t r a d o s	
  
o f e r e c e r ã o	
   m a i o r	
  
resistência	
   à	
   migração	
  
das	
  moléculas.	
  
Concentração do gel X Intervalo de separação 
Agarose (%) intervalo ótimo de separação (Kb) 
 0,3 60-50 
 0,6 20-1,0 
 0,7 10-0,8 
 0,9 7- 0,8 
 1,2 6-0,4 
 1,5 4-0,2 
 2,0 3-0,1 
+ 
Gel de agarose Amostras de DNA 
+ 
Os ácidos nucléicos migram para o pólo positivo 
+ 
Fragmentos menores migram a frente... 
+ 
Carga elétrica superficial também influência na migração 
+ 
Fragmentos mais leves também migram a frente 
Cuba e fonte eletroforética 
VISUALIZANDO O DNA ATRAVÉS 
DO BROMETO DE ETÍDIO 
Brometo de Etídio (EtBr) é um agente 
intercalante amplamente utilizado para 
visualizar todas as formas de fragmentos de 
DNA após eletroforese em gel, baseado na 
sua fluorescência sob luz UV. 
 
 
BROMETO	
  DE	
  ETÍDEO	
  
Outros corantes menos carcinogênicos - 
SYBER SAFE DNA GEL STAIN 
Exposição	
  luz	
  UV	
  -­‐	
  Fluorescência	
  
Grupo	
  1	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  Grupo	
  2	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  Grupo	
  3	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  Grupo	
  4	
  
1,3
0,7
Kb
0,2
pT
Z1
8R
pT
ZS
L1
pT
ZS
L2
Tampões	
  
 
Tampão Aplicação e comentários 
TAE – 
Tris/Acetato/
EDTA 
Usar quando o DNA vai ser recuperado 
Usar para eletroforese de DNA de grande tamanho (> 3 Kb) 
Baixa força iônica 
Propriedades: 
Baixa capacidade tamponante - recirculação pode ser necessária 
para corridas eletroforéticas longas (> 6 horas). 
TBE – 
Tris/Borato/ 
EDTA 
Usar para eletroforese de DNA pequeno (0,1 a 4kb) 
Melhor resolução de DNA pequeno 
Mobilidade do DNA mais restrita 
Alta força iônica 
Propriedades: 
Diminui a mobilidade do DNA. 
Alta capacidade tamponante - não requer recirculação para corridas 
longas. 
 
Recomendações para uso gel de agarose 
 
• Deixar pelo menos 1 minuto em tampão à t.amb antes 
de ir para o microondas (hidratação). 
• Não colocar o gel muito quente na forma de acrílico! 
• Colocar o Brometo de Etidio com gel ainda morno na 
forma e esperar a completa solidificação. 
 
•  Colocar o gel na cuba eletroforética e aplicar a amostra 
com cuidado para não furar o poço. 
 
 
 
Finalidades -gel de agarose 
 
• Verificar DNA genômico, DNA plasmidial, insertos 
(genes) obtidos por PCR. 
 
• Estimar a concentração e o tamanho da molécula de 
DNA. 
 
• Verificar DNA genômico, plasmídeos e insertos 
submetidos a digestão com enzimas de restrição. 
 
• Purificar plasmídeo e insertos para realização de 
clonagem gênica. 
 
 
 
 
•  Amostras em menor volume possível (bandas 
mais delimitadas) 
 
•  Mínima quantidade detectável 3X5mm 
(tamanho do poço) = 1ng. 
Não exceder 50ng por banda 
Exemplos	
  de	
  Géis	
  
DNA genômico Fragmentos de DNA 
428pb 
170 pb 
 
 M 1 2 3 4 
PROBLEMAS NO GEL 
Gel ideal 
Pouco tempo 
corrida 
Muita 
amostra 
Furo no 
pocinho 
Correu demais Pouca 
amostra 
Gel não 
Gelificado 
suficiente 
Mistura de 
amostras 
 
Bolha no gel Digestão 
incompleta 
Precipitação 
De TBE 
Tampão 
de corrida 
errado 
Fatores que alteram a migração dos 
ácidos nucléicos 
Presença de Corantes: a presença de corantes nos 
ácidos nucléicos, como o brometo de etídio, reduz em 
cerca de 15% a sua mobilidade eletroforética. 
•  Peso Molecular: moléculas com baixo peso molecular 
migram mais rapidamente que as moléculas mais pesadas. 
•  · Conformação do Ácido Nucléico: moléculas lineares 
migram mais lentamente que as moléculas circulares. 
•  · Composição do Ácido Nucléico: moléculas do 
mesmo tamanho compostas por diferentes bases 
apresentam conformações (dobramentos) diferentes. 
 
· 
FATORES QUE INTERFEREM NA 
 
•  Voltagem: a voltagem ideal a ser aplicada é de 5 V/cm, 
medido de eletrodo ao outro. 
•  Composições dos Tampões de Corrida: forças iônicas 
elevadas aumentam a temperatura do sistema devido a uma 
maior condutância elétrica. 
•  Temperatura: em função da voltagem aplicada, a 
temperatura pode elevar-se, de modo a interferir na 
velocidade de migração das moléculas. 
 
 
Poliacrilamida: monômero que em presença 
de radicais livres, polimeriza-se em longas 
cadeias, as quais são interligadas por outro 
monômero (bis-acrilamida). 
 
Acrilamida Bis-Acrilamida 
•  Diferentes relações entre as concentrações dessa moléculas permitem a 
criação de diferentes gradientes de separação. 
Acrilamida e 
Bisacrilamida. 
A acrilamida é uma 
molécula linear, 
A bisacrilamida é em 
forma de "T". 
Gel	
  de	
  poliacrilamida	
  
Polimerização via radicais livres iniciada por 
adição de catalizadores 
 
Catalizadores: 
 
TEMED – N, N, N, N’, N’ – 
tetrametiletilenodiamina 
Base usada para catálise 
Persulfato de amônio - Produção de radicais 
livres de oxigênio 
 
Rede tridimensional 
 
• Concentração de acrilamida determina 
espessura da rede 
• Concentração de bisacrilamida determina 
comprimento da rede 
 
Características: 
 
Elasticidade, densidade do gel, tamanho do 
poro, etc. 
 
Eletroforese	
  VerJcal	
  em	
  Poliacrilamida	
  
Gel	
  de	
  poliacrilamida	
  
Protocolos	
  +	
  comuns	
  para	
  gel	
  de	
  poliacrilamida	
  em	
  
biologia	
  molecular:	
  
•  SDS-­‐PAGE	
  –	
  Eletroforese	
  em	
  gel	
  de	
  poliacrilamida	
  
com	
   dodecil	
   sulfato	
   de	
   sódio	
   (Sodium	
   Dodecyl	
  
Sulfate	
  –	
  Polyacrilamide	
  Gel	
  Eletrophoresis).	
  
Obs.:	
  SDS	
  -­‐	
  Forte	
  detergente	
  aniônico	
  –	
  proteínas	
  com	
  carga	
  negaJva,	
  
migração	
  verJcal	
  pela	
  massa	
  molecular.	
  
	
  
•  Coloração	
  +	
  comum	
  –	
  Coomassie	
  R-­‐250	
  
	
  
SDS-PAGE 15% 
 
Apesar dos géis de poliacrilamida terem um maior 
poder deresolução, seu uso deve ser cuidadoso pela 
sua ação neurotóxica. 
 
 
 
 
Sua utilização é preferencial na análise de proteínas, 
mas pode ser utilizado também para análise de 
moléculas de DNA