biologia molecular métodos de análise

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05/11/2018
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Métodos de Análise dos 
ácidos nucléicos
Dra. Marina Mortati Dias Barbero
barbero.mmd@gmail.com
http://debuglies.com/2017/12/31/dna-testing-kit-company-to-launch-huge-weight-loss-study-focused-diet-exercise-and-genes/
Etapas para a análise do DNA
• Extração do DNA
•Replicação in vitro
• Sequenciamento
Eletroforese
• Técnica de separação de partículas carregadas em um campo elétrico
• Ocorre em gel (agarose ou poliacrilamida)
• baseada na sua carga elétrica, tamanho (peso molecular) e conformação
Poros de um gel de agarose
0,5% 2%
4% 8%
Chou et al., 2012https://courses.lumenlearning.com/microbiology/chapter/structure-and-function-of-dna/
Eletroforese
https://www.carlsonstockart.com/photo/electrophoresis-set-up-step-by-step-diagram-illustration/
http://adamogama.blogspot.com/2012/07/eletroforese.html
A amostra de DNA deve ser misturada a um tampão de
corrida antes de ser pipetado no gel.
O tampão de amostra (ou de migração) contém um
corante, como o azul de bromofenol, e um açúcar, como
o ficol e o glicerol. O corante ajuda na visualização da
corrida e o açúcar aumenta a densidade final da
amostra, fazendo com que ela permaneça no fundo do
pocinho de aplicação
Eletroforese
• Marcador de Peso Molecular (Ladder)
https://greenbioresearch.com/product/dna-ladder-100-bp-1kb-marker-agarose-gel-electrophoresis/
Eletroforese
Watson et al., 2015
Permite a passagem da corrente
elétrica. As soluções mais utilizadas
são TBE (Tris, ácido Bórico e EDTA),
e a TAE (Tris, ácido Acético e EDTA).
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https://www.youtube.com/watch?v=9f2VSyVhsGI
Visualização do Gel
http://www.ciencianamedida.com.br/2017/10/analisando-o-dna-na-escola.html
Visualização do Gel - Fotodocumentador
Google Imagens
https://www.youtube.com/watch?v=ndCyxYxI7Ng
Extração de DNA
• De onde podemos extrair o
DNA?
• De qualquer tecido ou
microorganismo que possua DNA
como material genético
• A obtenção da amostra para
extração pode ser diretamente de
um tecido ou de uma cultura de
células
• A extração pode ser feita através
de protocolos ou kits de
extração
http://eng.bioneer.com/products/dnarnaprep/GenomicDNAExtraction-technical.aspx?PRINTABLE=YES
Etapas da extração
1. Liberação do complexo DNA-proteínas através da lise das
membranas celular e nuclear
• Lise celular
2. Purificação do DNA
• Separação dos constituintes celulares
• Precipitação do DNA
• Lavagem e Ressuspensão do DNA
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Etapas da Extração
Liberação do complexo DNA-proteínas
• Amostras líquidas, como sangue e urina, geralmente são
centrifugadas para a separação de células nucleadas, no precipitado,
ou de partículas virais, no sobrenadante.
• Os tecidos sólidos, como folhas e músculos, precisam passar por uma
etapa de quebra das estruturas rígidas, com o objetivo de aumentar a
superfície de contato para a ação dos reagentes nas etapas seguintes.
• A quebra pode ser realizada por picotagem, utilizando tesouras, ou por
maceração, muitas vezes utilizando almofariz e pistilo associados ao
congelamento das amostras com nitrogênio liquido.
Etapas da Extração
Liberação do complexo DNA-proteínas
• A lise celular envolve o rompimento das células e deve ser realizada em
soluções tamponadas, geralmente contendo um detergente e os reagentes
tris-hidroximetil aminometano (Tris), cloreto de sódio (NaCl) e ácido etileno
diamino tetra-acético (EDTA).
• Detergente: atua sobre os lipídeos, promovendo o rompimento das membranas e a
liberação do conteúdo celular. Exemplos: dodecil sulfato de sódio (SDS) e brometo de
cetil-trimetilamônio (CTAB).
• O reagente Tris mantem o pH da solução tampão de lise estável (próximo a 8,0),
evitando que o DNA, ao ser liberado, sofra o ataque das enzimas
desoxirribonucleases (DNases) endógenas que o degradam, as quais atuam em pH
ótimo de 7,8.
• A adição do agente quelante EDTA também auxilia na inibição da ação das DNases
por se ligar aos cofatores Ca+2e Mg+2 da enzima DNase.
• O NaCl contribui rompendo ligações iônicas das cadeias peptídicas, auxiliando na
desnaturação das proteínas e adicionalmente promove a aglomeração das moléculas
de DNA.
Etapas da Extração
Purificação do DNA
• Deve-se separar o DNA dos outros componentes celulares. Isto é feito por
meio da adição de substâncias que façam com que a solução torne-se
heterogênea e que o DNA fique dissolvido em apenas uma das fases.
• São utilizados solventes orgânicos, como o fenol, clorofórmio ou ambos,
que desnaturam proteínas.
• Incorporação de proteinase K: facilita a separação do DNA das histonas.
Também por ser não específica ajuda a digerir proteínas e remover
contaminações proteicas durante a extação.
Etapas da Extração
Purificação do DNA
• Nessa etapa, após a centrifugação, o DNA permanecera solúvel na
fase aquosa (sobrenadante), a qual e transferida para um novo tubo,
separando os ácidos nucleicos de proteínas e demais constituintes
celulares presentes na interfase e fase orgânica
Romano & Miranda
Etapas da Extração
Purificação do DNA
• Em condições de baixa temperatura e elevada concentração salina
(devido ao NaCl presente no tampão de lise), a adição de etanol
absoluto, isopropanol ou soluções acetatos de amônio ou sódio
resulta na precipitação do DNA, o que forma em solução um
aglomerado de filamentos esbranquiçados que podem ser “pescados”
com um bastão de vidro ou concentrados no fundo do tubo por
centrifugação.
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Etapas da Extração
Purificação do DNA
• Geralmente a lavagem do DNA e
realizada com etanol 70% para a
remoção dos sais, detergentes e
de outras impurezas.
• Após a secagem por
evaporação, o DNA e
solubilizado em solução tampão
TE (Tris-HCl e EDTA) ou água
ultrapura.
Anerao et al., 2017
Estimativa da Concentração de DNA
• Quantificação
• 2 métodos:
• Gel: quantidade e integridade
• Espectofotômetro : quantidade e qualidade
Nonohay & Hepp, 2017 
Espectofotômetro : Nanodrop
Reação da Polimerase em Cadeia -
PCR ( Polymerase Chain Reaction)
https://mesuturkey.wordpress.com/2014/04/09/primer-designing-for-pcr/
Componentes necessários para a PCR
1. DNA molde
2. Taq polimerase
• DNA polimerase proveniente da bactéria termófila Thermus aquaticus, possui temperatura ótima
de atividade a 72°C e não desnatura em altas temperaturas.
3. dNTPs
• desoxirribonucleotídeos trifosfatos: dATP, dGTP, dCTP, dTTP
4. Primers ou oligonucleotídeos
• Um par iniciadores de DNA, um completar a fita “líder” (forward) e o outro a fita “tardia”
(reverse),
• Iniciadores são específicos a região alvo do DNA e são feitos sob encomenda em um laboratório
ou comprados de fornecedores bioquímicos comerciais.
5. MgCl2
• Cofator da polimerase
6. Solução tampão
• ambiente químico adequado para uma atividade ótima e estabilidade da DNA polimerase
7.Água estéril
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Etapas da PCR
1. Inicialização: este passo é necessário apenas para polimerases de DNA que requerem
ativação de calor por PCR de inicialização a quente. Consiste em aquecer a câmara de
reação a uma temperatura de 94–98 °C, durante 1-10 minutos.
2. Desnaturação: É o primeiro passo regular do ciclo e consiste em aquecer a câmara de
reação a 92–94 °C por 20 a 30 segundos. Causa o rompimento das pontes de hidrogênio e
o DNA agora fica em fita simples.
3. Anelamento: a temperatura de reação é reduzida para 50-65 °C durante 20-40
segundos, permitindo o anelamento dos iniciadores para cada um dos modelos de DNA de
cadeia simples. Vale ressaltar que cada primer possui uma temperatura ótima.
4. Extensão (alongamento): a temperatura neste passo depende da DNA polimerase
utilizada; a temperatura de atividade ideal para a polimerase de DNA termoestável da
polimerase Taq (Thermus aquaticus) é de aproximadamente 72–80 °C. A DNA polimerase
sintetiza uma nova
cadeia de DNA complementar à cadeia de matriz de DNA por adição de
dNTPs livres a partir da mistura de reação que são complementares ao modelo na direção
5' a 3', condensando o grupo 5'-fosfato dos dNTPs com o grupo 3'-hidroxi no final da cadeia
de DNA nascente (alongada).
Termociclador
Google Imagens
http://www.youtube.com/watch?v=2KoLnIwoZKU
Tipos de PCR
• PCR multiplex: Na PCR multiplex, mais de um par de primers são utilizados,
promovendo a amplificação de fragmentos de diferentes tamanhos em um
mesmo tubo, ou seja, permitindo a amplificação de diferentes regiões em uma só
reação.
• RT-PCR: Neste tipo de PCR, utiliza-se inicialmente a enzima transcriptase reversa
(RT, enzima de vírus de genomas de RNA) e como molde moléculas de RNA. A
ação da enzima determina a síntese de molécula de DNA complementar (cDNA)
ao RNA, que e então amplificado por PCR. Esse tipo de PCR permite a analise da
expressão de genes por partir de moléculas de RNA mensageiro (RNAm).
• Nested PCR: A fim de aumentar a sensibilidade da PCR, desenvolveu-se a
estratégia de utilizar dois pares de primers complementares a sequencia alvo.
Inicialmente e realizada a amplificação com o par mais externo e,
posteriormente, o produto desta PCR e amplificado com um par interno ao
primeiro (aninhado), que utilizara os fragmentos multiplicados na primeira reação
como molde.
Tipos de PCR
• PCR em tempo real: Na PCR em tempo real, além dos dois primers que
determinam a amplificação de determinada região do DNA alvo, e adicionada
uma sonda complementar a região do DNA localizada entre os dois primers,
contendo, em uma extremidade, uma molécula fluorescente (fluoróforo) e, na
outra extremidade, uma molécula inibidora. Na sonda integra, a molécula
inibidora impede a emissão de fluorescência. Durante a reação de síntese, a
sonda hibridiza-se ao DNA alvo e é degradada pela atividade 5’-3’ exonuclease da
enzima Taq polimerase, resultando na emissão da fluorescência. A emissão de
fluorescência é medida a cada ciclo, permitindo acompanhar o seu aumento ao
longo da reação, geralmente por um computador acoplado ao termociclador (por
isso, a denominação “em tempo real”). A quantidade de fluorescência emitida
pela reação irá aumentar exponencialmente conforme as moléculas são
sintetizadas, sendo proporcional a quantidade inicial de DNA alvo.
• A técnica de PCR em tempo real permite a quantificação precisa de moléculas de DNA e tem
sido utilizada para a quantificação de patógenos virais e bacterianos em amostras biológicas,
na genotipagem de variantes genéticas, na avaliação dos níveis de expressão gênica e na
detecção de produtos transgênicos em alimentos.
Termociclador para PCR em Tempo Real
Google Imagens
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https://www.youtube.com/watch?v=pRwoOBuk00c
• Sequenciamento:
• Determinação da ordem precisa de nucleotídeos dentro de uma molécula de
DNA.
• Tipos:
• 1° Geração : Maxam-Gilbert e Sanger
• 2° Geração
• 3° Geração
Sequenciamento
Sequenciamento de Nova Geração (NGS)
Método Maxam–Gilbert
Sequenciamento
• 1977: Allan Maxam e Walter Gilbert
• Hidrólise química da molécula de DNA
• Processo catalítico de dois passos envolvendo piperidina e dois produtos
químicos que atacam seletivamente purinas e pirimidinas
Método Maxam–Gilbert
Sequenciamento
Moreira et al., 2015
O rompimento das
pontes de hidrogênio
da fita dupla de DNA
ocorre pela adição de
dimetil sulfato e
aquecimento a 90º C.
Método Maxam–Gilbert
Sequenciamento
Moreira et al., 2015
RemoveAltera Corta
Moreira et al., 2015
Gel de 
Poliacrilamida
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Método de Sanger
Sequenciamento
• 1977: Frederick Sanger
• Sequenciamento enzimático dideóxi, também chamado de término de cadeia
https://www.telegraph.co.uk/news/obituaries/science-obituaries/10462574/Frederick-Sanger-OM.html
Moreira et al., 2015
Hidroxila
Método de Sanger
Sequenciamento
http://ib.bioninja.com.au/higher-level/topic-7-nucleic-acids/71-dna-structure-and-replic/dna-sequencing.html
Gel de 
Poliacrilamida
Moreira et al., 2015
Autoradiograma
Bisht and Panda, 2014
O que tornou o método de 
sequenciamento Sanger possível?
PCR
• 1985: Lloyd M.Smith, Mike Hunkapiller e Tim Hunkapiller
• Mudança:
• não utiliza compostos radioativos prejudiciais a saúde humana.
• Adição de corantes aos didesoxinucleotídeos
• emitem fluorescência quando excitados em comprimento de onda específico.
Método de Sanger: Semi- Automatizado
Sequenciamento
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Método de Sanger
Sequenciamento
TACGAAGACCGTCTAGACTTGTCACAATGACTATAACGAA
|||||||
5’3’
ATGCTTC
5’ 3’
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5’ 3’
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C
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TACGAAGACCGTCTAGACTTGTCACAATGACTATAACGAA
|||||||||||||||
5’3’
ATGCTTCTGGCAGAT
5’ 3’
A
A
A
A
A
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C
C
C
ABI 377
Renshaw et al. 2013
https://www.mun.ca/biology/scarr/377_gel_file.html
http://www.patho.hku.hk/facilities/dna.html
H
OH
P
P
T
G
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P
T
PP
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H
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?
deoxinucleotídeo
dideoxinucleotídeo
H
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PP
P
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G
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PP
OH
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P
T
G
H
P
T
PP
OH
?
deoxinucleotídeo
dideoxinucleotídeo
Método de Sanger: Automatizado
Sequenciamento
• Nos anos 90, os géis
foram substituídos por
finíssimos capilares
preenchidos com gel onde
os fragmentos de DNA são
separados em altíssima
velocidade.
Moreira et al., 2015
registra a fluorescência e a transmite para um 
computador que possui um software capaz de 
converter fluorescência em picos coloridos
Método de Sanger
Sequenciamento
Eletroferograma
Método de Sanger: Automatizado
Sequenciamento
MegaBase®
http://www.cooganphoto.com/molex-megabace.html
https://jgi.doe.gov/archived-educator-resources/sanger-sequencing-archive/how-sanger-sequencing-is-done/step-10-capillary-sequencing/
É capaz de sequenciar 96 fragmentos de DNA num intervalo de 1 a 3 horas.
Método de Sanger: Automatizado
Sequenciamento
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https://www.youtube.com/watch?v=-RzKFR-
n5zs&t=1s
Estratégia de 
sequenciame
nto de 
genoma 
completo
https://www.genengnews.com/gen-articles/sequencing-within-reach/6252
Shotgun
• Passos:
1. Bombardear aleatoriamente o genoma a ser sequenciado com
partículas que promovem sua fragmentação.
2. Obtenção a biblioteca genômica pela inserção de cada fragmento
em um vetor.
3. Clonar fragmentos
4. Sequenciar
5. Montagem do genoma
Moreira et al., 2015
Shotgun hierárquico
https://www.thermofisher.com/br/en/home/life-science/cloning/cloning-learning-center/invitrogen-school-of-molecular-biology/molecular-cloning/cloning/common-applications-strategies.html
https://commons.wikimedia.org/wiki/File:Human_Genome_Project_Timeline_(26964377742).jpg
http://sandwalk.blogspot.com/2016/02/happy-birthday-human-genome-sequence.html
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Genomas Completos
• GenBank : 
• Junho de 2018
• 239426 procariotos
• 5965 eucariotos
• Em 2012
• 12018 procariotos
• 1830 eucariotos