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MICROBIOLOGIA PRÁTICAS DE LABORATÓRIO MATERIAL TEÓRICO Professora Josiana Laporti COORDENADORIA DO CURSO SUPERIOR DE TECNOLOGIA EM SANEAMENTO AMBIENTAL 2 SUMÁRIO 1 INTRODUÇÃO À MICROBIOLOGIA ............................................................................................... 3 1.1 HISTÓRICO DA MICROBIOLOGIA ........................................................................................... 3 1.2 A MICROBIOLOGIA NA ATUALIDADE ..................................................................................... 4 1.3 A UBIQUIDADE DOS MICROORGANISMOS ........................................................................... 5 1.4 PRINCIPAIS FUNÇÕES DOS MICROORGANISMOS NA NATUREZA ................................... 6 1.5 MICROORGANISMOS COMO AGENTES DE DOENÇAS ....................................................... 8 1.6 IMPORTÂNCIA DA MICROBIOLOGIA ...................................................................................... 8 2 CLASSIFICAÇÃO DOS MICRORGANISMOS DE ACORDO COM SUA RELAÇÃO COM OXIGÊNIO ........................................................................................................................................ 10 2.1 CLASSIFICAÇÃO DOS MICRORGANISMOS DE ACORDO COM SUA DIVERSIDADE METABÓLICA ................................................................................................................................ 10 2.2 MICROBIOLOGIA E SANEAMENTO AMBIENTAL ................................................................. 11 2.2.1 Problemática do Lançamento e Disposição de Rejeitos no Ambiente ................................. 13 2.2.2 Biotratamento de Águas Residuárias e Resíduos Sólidos ................................................... 17 2.2.3 Microrganismos aeróbios ...................................................................................................... 21 2.2.4 Microrganismos anaeróbios .................................................................................................. 24 2.2.5 Potencial microbiano ............................................................................................................. 28 2.3 Bioremediação ......................................................................................................................... 30 3 PERSPECTIVAS ............................................................................................................................ 32 AULAS PRÁTICAS ........................................................................................................................... 35 1- NORMAS DE SEGURANÇA NO LABORATÓRIO DE MICROBIOLOGIA ................................... 36 2- MEIOS DE CULTURA, TÉCNICAS DE ISOLAMENTO E SEMEADURA BACTERIANA ............ 41 3 COLORAÇÃO DE ZIEHL-NEELSEN ............................................................................................. 44 3.1 COLORAÇÃO DE GRAM ........................................................................................................ 45 4 CONTROLE DE MICRORGANISMOS .......................................................................................... 47 5 DILUIÇÃO EM SÉRIE .................................................................................................................... 70 6 ANÁLISE BACTERIOLÓGICA DA ÁGUA ...................................................................................... 72 6.1 COLIFORMES TOTAIS ........................................................................................................... 78 7 COLIFORMES TERMOTOLERANTES ......................................................................................... 81 3 1 INTRODUÇÃO À MICROBIOLOGIA Microbiologia: Mikros (= pequeno) + Bio (= vida) + logos (= ciência) A Microbiologia era definida, até recentemente, como a área da ciência que dedica-se ao estudo dos microrganismos, um vasto e diverso grupo de organismos unicelulares de dimensões reduzidas, que podem ser encontrados como células isoladas ou agrupados em diferentes arranjos (cadeias ou massas), sendo que as células, mesmo estando associadas, exibiriam um caráter fisiológico independente. Assim, com base neste conceito, a microbiologia envolve o estudo de organismos procariotos (bactérias, archaeas), eucariotos inferiores (algas, protozoários, fungos) e também os vírus. 1.1 HISTÓRICO DA MICROBIOLOGIA Esta área do conhecimento teve seu início com os relatos de Robert Hooke e Antony van Leeuwenhoek, que desenvolveram microscópios que possibilitaram as primeiras observações de bactérias e outros microrganismos, além de diversos espécimes biológicos. Embora van Leeuwenhoek seja considerado o "pai" da microbiologia, os relatos de Hooke, descrevendo a estrutura de um bolor, foram publicados anteriormente aos de Leeuwenhoek. Em 1684, na Holanda, Antony Van Lewenhack construiu microscópios que podiam aumentar 300X e começou a ver pequenos animais E ao fazer desenhos dos mesmos, concluiu que existem seres invisíveis, mas não conseguiu provar a origem deles. Já Pasteur concluiu que os microorganismos surgem de células pré-existentes propondo a teoria de biogênese que diz que enquanto não cair o primeiro microorganismo não tem multiplicação. Os ensinamentos de Pasteur dizem que: • O ar é contaminado 4 • Tudo que está exposto ao ar está contaminado • Os microorganismos contaminados causam alterações nos alimentos (fermentação) • O calor pode matar os microorganismos presentes nos alimentos Descobriu então que os microorganismos poderiam ser eliminados com a pasteurização (ferver e resfriar). Outras descobertas importantes de Pasteur foram a pasteurização, a fermentação e a descoberta de vacinas para cólera aviária e raiva. Em 1857, Robert Kock descobriu a cultura e deixou como postulados: •Os microorganismos devem estar presentes em todos os casos de doenças. •Os microorganismos devem ser isolados em cultura pura no laboratório. •Os mesmos sintomas devem surgir se o microorganismo for inoculado em um hospedeiro saudável e susceptível. •O mesmo microorganismo deve ser re-isolado do hospedeiro inoculado. Josephlister percebeu que 50% dos seus pacientes amputados morriam de infecção pós-operatória então em 1865, após os experimentos de Pasteur passou a usar ácido carbólico surgindo o primeiro centro cirúrgico asséptico. Semmelweis instituiu a lavagem das mãos com uma substancia clorada antes de qualquer procedimento obstétrico reduzindo o índice de febre puerperal e de mortalidade de 12% para 1,3%. 1.2 A MICROBIOLOGIA NA ATUALIDADE A definição clássica de "microbiologia" mostra-se bastante imprecisa, e até mesmo inadequada, frente aos dados da literatura publicados nesta última década. Como exemplo pode-se citar duas premissas que já não podem mais ser consideradas como verdade absoluta na conceituação desta área de conhecimento: as dimensões dos microrganismos e a natureza independente destes seres. Em 1985 foi descoberto um organismo, denominado Epulopiscium fischelsoni que, a partir de 1991, foi definido como sendo o maior procarioto já descrito, exibindo cerca de 500 µm de comprimento. Esta bactéria foi isolada do intestino de um peixe marinho (Surgeonfish, peixe barbeiro ou cirurgião), 5 encontrado nas águas da Austrália e do Mar Vermelho. Além de apresentar dimensões nunca vistas, tal bactéria mostra-se totalmente diferente das demais quanto ao processo de divisão celular, que ao invés de ser por fissão binária, envolve um provável tipo de reprodução vivíparo, levando à formação de pequenos“glóbulos”, que correspondem às células filhas. Mais recentemente, em 1999, outro relato descreve o isolamento de uma bactéria ainda maior, isolada na costa da Namíbia. Esta, denominada Thiomargarita namibiensis, pode ser visualizada a olho nú, atingindo até cerca de 0,8 mm de comprimento e 0,1 a 0,3 mm de largura. 1.3 A UBIQUIDADE DOS MICROORGANISMOS Os microrganismos são os menores seres vivos existentes, encontrando-se em uma vasta diversidade de ambientes e desempenhando importantes papéis na natureza. Este grupo caracteriza-se por ser completamente heterogêneo, tendo com única característica comum o pequeno tamanho dos organismos. Acredita-se que cerca de metade da biomassa do planeta seja constituída pelos microrganismos, sendo os 50% restantes distribuídos entre plantas (35%) e animais (15%). Em termos de habitat, os microrganismos são encontrados em quase todos os ambientes, tanto na superfície, como no mar e subsolo. Desta forma, podemos isolar microrganismos de fontes termais, com temperaturas atingindo até 130°C (clique aqui para ler o relato do isolamento de um procarioto cujo máximo de temperatura de crescimento foi definido como 130°C); de regiões polares, com temperaturas inferiores a -10°C; de ambientes extremamente ácidos (pH=1) ou básicos (pH=13). Alguns sobrevivem em ambientes extremamente pobres em nutrientes, assemelhando-se à água destilada. Há ainda aqueles encontrados no interior de rochas na Antártida. Em termos metabólicos, temos também os mais variados tipos, desde aqueles com vias metabólicas semelhantes a de eucariotos superiores, até outros que 6 são capazes de produzir ácido sulfúrico, ou aqueles capazes de degradar compostos pouco usuais como cânfora, herbicidas, petróleo, etc. Uma vez que os microrganismos precederam o homem em bilhões de anos, pode-se dizer que nós evoluímos em seu mundo e eles em nosso. Desta forma, não é de se estranhar que a associação homem-microrganismo mostra- se com grande complexidade, com os microrganismos habitando nosso organismo, em locais tais como a pele, intestinos, cavidade oral, nariz, ouvidos e trato genitourinário. Embora a grande maioria destes microrganismos não causem qualquer dano, compondo a denominada “microbiota normal”, algumas vezes estes podem originar uma série de doenças, com maior ou menor gravidade. Nesta classe de organismos estão aqueles denominados patogênicos e potencialmente patogênicos. Sabe-se que em cerca de 1013 células de um ser humano podem ser encontradas, em média, cerca de 1014 células bacterianas. No homem, estas se encontram em várias superfícies, especialmente na cavidade oral e trato intestinal. 1.4 PRINCIPAIS FUNÇÕES DOS MICROORGANISMOS NA NATUREZA Além de seu importante papel como componentes da microbiota residente de animais e plantas, em nosso dia a dia convivemos com os mais diversos produtos microbiológicos “naturais” tais como: vinho, cerveja, queijo, picles, vinagre, antibióticos, pães, etc. Paralelamente, não pode ser deixada de lado a importância dos processos biotecnológicos, envolvendo engenharia genética, que permitem a “criação” de novos microrganismos, com as mais diversas capacidades metabólicas. Os microrganismos desempenham também um importante papel nos processos geoquímicos, tais como o ciclo do carbono e do nitrogênio, sendo genericamente importantes nos processos de decomposição de substratos e sua reciclagem. Dentre os compostos utilizados como substrato temos, alguns de grande importância atualmente: DDT, outros pesticidas, cânfora, etc. 7 O carbono encontra-se na atmosfera primariamente como CO2, sendo utilizado pelos organismos fotossintetizantes, para sua nutrição. Virtualmente, a energia para o desenvolvimento da vida na Terra é derivada, em última análise, a partir da luz solar. Esta é captada pelas plantas e microrganismos fotossintetizantes (algas e bactérias), que convertem o CO2 em compostos orgânicos, através da reação: CO2 + H2O à (CH2O)n + O2 (Equação 1) Os herbívoros alimentam-se de plantas e os carnívoros alimentam-se dos herbívoros. O CO2 atmosférico torna-se disponível para a utilização na fotossíntese origina- se de duas fontes biológicas principais: 1) 5 a 10% a partir de processos de respiração e; 2) 90 a 95% oriundos da degradação (decomposição ou mineralização) microbiana de compostos orgânicos. Em termos de ciclo global, há um balanço entre o consumo de CO2 na fotossíntese e sua produção através da mineralização e respiração. Este balanço, no entanto, vem sendo fortemente alterado por atividades humanas, tais como a queima de combustíveis fósseis, promovendo um aumento da quantidade de CO2 atmosférico, resultando no conhecido “efeito estufa”. A celulose existente nas plantas, embora seja um substrato extremamente abundante na Terra, não é utilizável pela vasta maioria dos animais. Por outro lado, vários microrganismos, incluindo fungos, bactérias e protozoários a utilizam, como fonte de carbono e energia. Destes microrganismos, muitos encontram-se no trato intestinal de vários herbívoros e nos cupins. Muitos compostos tóxicos podem ser degradados por microrganismos, dentre eles, policlorados, DDT, pesticidas. Outra abordagem que tem se mostrado de grande valia para o homem refere- se à introdução de genes bacterianos em outros organismos (ditos 8 transgênicos), tais como plantas. Assim, está em franco desenvolvimento a obtenção de plantas transgênicas resistentes a pesticidas ou ao ataque de insetos. 1.5 MICROORGANISMOS COMO AGENTES DE DOENÇAS Os microrganismos, eventualmente provocam doenças no homem, outros animais e plantas. Apesar dos enormes avanços em relação ao tratamento de doenças infecciosas, estas vêm se tornando novamente um tema preocupante, em virtude do crescente surgimento de linhagens bacterianas cada vez mais resistentes às drogas. Atualmente, a Organização Mundial da Saúde vem demonstrando crescente interesse nas doenças emergentes e re-emergentes, de origem infecciosa. Abaixo apresentamos um quadro cronológico que deixa clara tais preocupações, em relação ao número de mortes provocadas por doenças infecciosas. (Adaptado do livro Brock Biology of Microorganisms, 10 Ed., 2003) 1.6 IMPORTÂNCIA DA MICROBIOLOGIA É uma área da Biologia que tem grande importância seja como ciência básica ou aplicada. 9 Básica: estudos fisiológicos, bioquímicos e moleculares (modelo comparativo para seres superiores). àMicrobiologia Molecular Aplicada: processos industriais, controle de doenças, de pragas, produção de alimentos, etc. Áreas de estudo: Odontologia: Estudo de microrganismos associados à placa dental, cárie dental e doenças periodontais. Estudos com abordagem preventiva. Medicina e Enfermagem: - Doenças infecciosas e infecções hospitalares. Nutrição: - Doenças transmitidas por alimentos, Controle de qualidade de alimentos, Produção de alimentos (queijos, bebidas). Biologia: - Aspectos básicos e biotecnológicos. Produção de antibióticos, hormônios (insulina, GH), enzimas (lipases, celulases), insumos (ácidos, álcool), Despoluição (Herbicidas - Pseudomonas, Petróleo), Bio-filme (Acinetobacter), etc. BIOTECNOLOGIA - Uso de microrganismos com finalidades industriais, como agentes de biodegradação, de limpeza ambiental, etc. 10 2 CLASSIFICAÇÃO DOS MICRORGANISMOS DE ACORDO COM SUA RELAÇÃO COM OXIGÊNIO Os microrganismos podem crescer na presença ou ausência de oxigênio e, neste aspecto, podem ser classificados em: Aeróbios: são os microrganismos que normalmente requerem oxigênio para crescer. Facultativos: sãoos microrganismos que crescem na presença de oxigênio ou na ausência dele (anaerobiose). Anaeróbios: são os microrganismos que ou crescem na presença de baixas concentrações de oxigênio, os chamados de anaeróbios facultativos, ou morrem quando estão na presença deste gás; estes são os chamados de anaeróbios estritos. Microaerófilos: são organismos aeróbios, porém somente crescem em concentrações de oxigênio menores que a do ar (entre 1% e 15%). 2.1 CLASSIFICAÇÃO DOS MICRORGANISMOS DE ACORDO COM SUA DIVERSIDADE METABÓLICA Os microrganismos necessitam de uma fonte de carbono (gás carbônico (CO2) ou carbono orgânico) e de uma fonte de energia (luz ou energia derivada da oxidação de compostos orgânicos ou inorgânicos). Os microrganismos que usam a luz como fonte de energia podem ser: Fotoautotróficos: são organismos que usam a luz como fonte de energia e o carbono inorgânico (CO2) como fonte de carbono. São representados pelas bactérias fotossintetizantes (cianobactérias), bactérias sulfurosas púrpura (exemplo: Chromatium) e bactérias sulfurosas verdes (exemplo: Chlorobium), algas e plantas verdes. Existem cerca de 60 espécies de bactérias fotoautotróficas. Fotoheterotróficos: usam luz como fonte de energia e compostos orgânicos (álcool, carboidratos, ácidos orgânicos, etc.) como fonte de carbono. São as 11 bactérias verdes não sulfurosas (exemplo: Chloroflexus) e as bactérias púrpuras não sulfurosas (exemplo: Rhodopseudomonas ). Os microrganismos que obtêm energia através da oxidação de compostos orgânicos ou inorgânicos podem ser classificados em: Quimioautotróficos: usam os compostos químicos (gás sulfídrico (H2S), enxofre elementar (S), amônia (NH3), gás hidrogênio (H2), nitrato (NO3-), nitrito (NO2-) e ferro (Fe2+) como fonte de energia e usam o CO2 como fonte de carbono. Quimioheterotróficos: são organismos que usam compostos orgânicos como fonte de energia e de carbono. Este grupo inclui a maioria das bactérias, fungos e protozoários. 2.2 MICROBIOLOGIA E SANEAMENTO AMBIENTAL Texto: Rosana Filomena Vazoller, USP A utilização de microrganismos no saneamento básico e ambiental é prática comum desde os primórdios do desenvolvimento dos processos biológicos de tratamento de águas residuárias e resíduos sólidos. É evidente, que a capacidade microbiana de catabolizar diferentes compostos orgânicos, naturais ou sintéticos, e inorgânicos, extraindo desses compostos fontes nutricionais e energéticas, é o que possibilitou o emprego desses agentes biológicos, pela engenharia sanitária, como solução aos problemas gerados pelos rejeitos lançados no meio ambiente. A habilidade notável de degradação de compostos por microrganismos é consequência da evolução dos sistemas enzimáticos de células procariotas e eucariotas, as quais vêm coexistindo, durante bilhões de anos, com uma enorme variedade de substâncias naturais de diferentes origens. Esta diversidade de substratos potenciais ao crescimento microbiano resultou, então, no aparecimento de enzimas aptas a transformar moléculas orgânicas com estruturas bastante distintas. Os "arsenais" enzimáticos microbianos têm sido também capazes de atuar sobre substâncias químicas sintéticas, oriundas das atividades antropogênicas. Esta resposta do metabolismo de certos microrganismos, sem dúvida, confere algumas vantagens adicionais às células microbianas, tais como a exploração de novos nichos ecológicos e fontes energéticas. 12 O desenvolvimento do saneamento ambiental é consequência direta das atividades de produção do Homem em seu meio. O aumento das necessidades e anseios da sociedade moderna industrializada, reflete-se no aumento de materiais descartados sob forma de esgotos e lixo. Portanto, soluções para os efeitos do acúmulo de materiais indesejáveis são prementes e devem ser duradouras. O tratamento de águas residuárias e resíduos sólidos pela ação de microrganismos resulta na estabilização dos compostos orgânicos poluentes, e emprega reatores (bioreatores) com diferentes configurações, constituindo verdadeiros ecossistemas microbianos. O principal produto dos processos biológicos de tratamento de rejeitos é a despoluição ambiental. Assim, pode-se denominar por Biotecnologia Ambiental, os métodos da engenharia sanitária que utilizam microrganismos, ou que conduzam ao desenvolvimento dos microrganismos em um meio, cuja a finalidade é a obtenção de um produto que propicie benefícios ao Homem em seu ambiente. A Biotecnologia no saneamento ambiental corresponde às aplicações da tecnologia sanitária apropriadas para a otimização da qualidade ambiental, especificamente em relação aos recursos hídricos, solos e ar. Atualmente, as soluções para os problemas ambientais podem ser encontradas além do vantajoso uso dos bioreatores, como é o caso da aplicação in situ de microrganismos especializados na degradação e/ou transformação de substâncias químicas sintéticas tóxicas encontradas nos solos pela disposição de materiais poluentes, ou em aquíferos contaminados pela percolação de poluentes. Esta prática é denominada Bioremediação. O aprimoramento das tecnologias existentes ou o aparecimento de novos processos para a manutenção da qualidade ambiental devem estar de acordo com um dos princípios formulados pela The World Comission on Environment and Development (Brundtland Comission, Declaração de Tóquio), segundo ZEHNDER (1992). Princípio sobre a "Conservação e otimização dos recursos naturais", formulado durante a The world Comission on Environment and Development (Brundtland Comission, Declaração de Tóquio), ZEHNDER (1992). 13 A Biotecnologia Ambiental se insere com sucesso, portanto, no passado, presente e futuro da preservação, recuperação e utilização racional dos recursos naturais. Este capítulo abordará a microbiologia no saneamento ambiental, particularmente no uso de tecnologias de reatores e sistemas em que o objetivo final é a preservação e recuperação de ecossistemas aquáticos e terrestres. Os exemplos serão restritos às tecnologias de tratamento de águas residuárias e resíduos sólidos, divididas em duas categorias, segundo a definição de GRIFFITHS (1992): -Biotratamento, em que os poluentes são tratados em bioreatores, geralmente instalados junto às fontes de emissão; - Bioremediação, é a recuperação pelo tratamento in situ de ambientes danificados pela disposição de enormes quantidades de materiais poluentes tóxicos; pode ser necessário o uso de bioreatores. 2.2.1 Problemática do Lançamento e Disposição de Rejeitos no Ambiente Os ecossistemas aquáticos possuem funções ambientais de indiscutível valor. Neles, os nutrientes são reciclados, a água é purificada, as enchentes são atenuadas, os fluxos das águas são conservados e ampliados, os lençóis freáticos são recarregados, e sobretudo, constituem fonte de abastecimento de água para a vida vegetal, animal e humana. Porém, o rápido aumento populacional em diversas partes do mundo, em conjunto com o intenso desenvolvimento industrial, comercial e residencial, resultaram na poluição dos recursos hídricos superficiais e subterrâneos por fertilizantes, pesticidas, inseticidas, óleos, percolados tóxicos de aterros Sustentabilidade requer a conservação dos recursos ambientais, tais como manutenção da qualidade dos recursos hídricos, dos solos, do ar e das florestas; conservação da diversidade genética; e utilização eficiente de energia, água e materiais naturais. Aperfeiçoamento da eficiência dos mecanismos de produção, afim de reduzir o consumo per capita dos recursos naturais e estimular a mudança de tecnologias e de produção de materiaisde consumo não-poluentes. Todos os países são conclamados a prevenir a poluição ambiental através do cumprimento de leis de proteção ambientais, promover tecnologias com baixa geração de resíduos, e prever o impacto de novos produtos, tecnologias e resíduos. 14 sanitários (local de disposição controlada de resíduos sólidos), enfim, uma enorme variedade de efluentes industriais e os sanitários. O agravamento da situação pelo uso indiscriminado dos sistemas hídricos verificou-se ainda, pelo aumento da demanda do consumo de água, que em último caso, provoca a redução do fluxo de água disponível no meio ambiente para a diluição dos despejos (Committee on Restoration of Aquatic Ecosystems - EUA, 1992). Em 1992, GRIFFITHS indicou que apenas 10% do total mundial de águas residuárias estão sujeitas a algum tipo de tratamento. O residual de 90% permanece no meio suscetível a auto-purificação nos sistemas aquáticos. Em termos quantitativos, como abordado por Glazer e Nikaido (1995),10% de todas as bacias continentais no mundo suprem as necessidades de uso da água. Deste valor, são consumidos 70% na irrigação agrícola, 20% nos processos industriais, e o restante pelas atividades domésticas e de agropecuária, entre outras. No Brasil, a maioria dos ecossistemas aquáticos recebe toda a espécie de impactos oriundos da atividade humana, sendo prováveis exceções algumas áreas da bacia amazônica e corpos d'água situados em localidades bastante isoladas. O Brasil possue uma ampla rede hidrográfica em relação ao mundo, e 51% dos sistemas existentes para a captação de águas de abastecimento estão localizados em rios, nos quais são lançados cerca de 92% dos esgotos gerados nas regiões (TUNDIS; BARBOSA, 1995). As interferências geradas nos sistemas aquáticos são, portanto, de diferentes origens, e aquelas resultantes do lançamento de efluentes industriais e sanitários são de difícil controle, principalmente devido a diversidade e quantidade das fontes de emissão. Os solos também sofrem alterações pelo despejo de poluentes nos sistemas aquáticos, e pela disposição superficial de resíduos, tais como compostos químicos tóxicos e lixos oriundos das atividades agrícolas e industriais. 15 Atividades antrópicas e suas consequências nos ecossistemas aquáticos brasileiros. ATIVIDADES ANTRÓPICAS CONSEQUÊNCIAS DAS ATIVIDADES Irrigação Eutrofização de lagos, rios, reservatórios, estuários e águas costeiras Lançamento de efluentes industriais Alteração no nível das águas e no ciclo hidrológico Lançamento de esgotos sanitários Alteração nas cadeias alimentares existentes Produção e disposição de resíduos agrícolas Toxicidade nos sistemas aquáticos Produção e disposição de resíduos sólidos (urbanos, hospitalares, etc.) Aumento nos custos dos sistemas de tratamento de águas de abastecimento Desflorestamento Veiculação de doenças, com consequências prejudiciais a saúde pública Mineração Perda da biodiversidade Construção de rodovias Impedimento dos múltiplos usos da água Remoção de espécies nativas importantes Mudanças na qualidade de vida Uma das fontes de poluição mais agressiva às águas subterrâneas, e consequentemente aos aquíferos, é aquela produzida pela percolação de resíduos colocados em solos permeáveis, que não dispõem de nenhum método artificial de proteção das camadas superficiais da terra que o constituem. São exemplos de fontes de poluição dos lençóis freáticos, líquidos gerados pela degradação e/ou percolação de resíduos sólidos industriais ou urbanos, inadequadamente dispostos em áreas permeáveis, e por vazamentos de dutos de condução de petróleo. Os resíduos mais comuns são os sanitários e os produzidos pela atividade agro-pecuária, e são constituídos, em sua maioria, por matéria de origem orgânica. Um número significante de compostos sintéticos, ou xenobióticos, muitos dos quais são pesticidas, solventes orgânicos, e compostos poliaromáticos e halogenados, tais como as dioxinas, também compõem a gama de poluentes orgânicos que persistem e acumulam no ambiente. Além disso, um importante número de poluentes inorgânicos pode ocasionar efeitos prejudiciais ao meio ambiente, como é o caso de várias formas de nitrogênio, fósforo e metais pesados. Particularmente, a eutrofização dos 16 sistemas aquáticos é ocasionada pela liberação de nitratos e fosfatos, nutrientes que suportam o florescimento de uma enorme massa celular de algas no corpo d'água receptor. Fontes de poluição por compostos antropogênicos aromáticos tóxicos. COMPOSTOS AROMÁTICOS FONTES INDUSTRIAIS BTEX combustíveis fósseis, solventes, estireno plásticos PAH combustíveis fósseis, preservantes de madeiras alquilfenóis sulfactantes, detergentes sulfo aromáticos sulfactantes, detergentes, despolpamento com sulfito, corantes amino aromáticos pesticidas, corantes, pigmentos, fármacos azo aromáticos corantes nitroaromáticos explosivos, fármacos, pesticidas, corantes clorofenóis e dioxinas preservantes de madeiras, pesticidas, efluentes de branqueamento de polpa hidrocarbonetos cloroaromáticos e PCB pesticidas, solventes, fluidos hidraúlicos e dieletricos BTEX=benzeno, tolueno, etilbenzeno e xileno; PAH= hidrocarbonetos aromáticos policíclicos; PCB= bifenilas policloradas. As ações de prevenção, recuperação e manutenção dos ecossistemas devem priorizar as tecnologias que conduzam a purificação de áreas poluídas, com base na remoção da matéria orgânica facilmente degradável ou, pela eliminação de um poluente químico específico de difícil degradação. As possíveis soluções para os rejeitos lançados no meio ambiente podem abrigar diferentes processos biológicos, cujo objetivo é a biodegradação de compostos poluentes em compostos mais simples, em outras palavras, a mineralização completa de moléculas orgânicas. Alguns processos podem gerar ainda, produtos finais de valor energético, como é o caso do metano, ou de valor para a indústria de química fina, como é o caso do catecol, originado a partir da transformação biológica de fenóis (GRIFFITHS, 1992). 17 2.2.2 Biotratamento de Águas Residuárias e Resíduos Sólidos O tratamento biológico ou biotratamento de águas residuárias e resíduos sólidos emprega a ação conjunta de espécies diferentes de microrganismos, em bioreatores, que operados sob determinadas condições resulta na estabilização da matéria orgânica poluente. Os sistemas biológicos de tratamento de resíduos deve atender alguns importantes aspectos : (1) - remoção da matéria orgânica, portanto redução da Demanda Bioquímica de Oxigênio do resíduo a ser tratado (ver Quadro 2); (2) - se possível, degradação de compostos químicos orgânicos de difícil degradação (recalcitrantes); (3) - fornecimento de um efluente em condições que não afete o equilíbrio do sistema receptor final (rios, lagos, etc.). O volume de informações existentes sobre os aspectos básicos dos processos de tratamento biológico de rejeitos, nos campos da engenharia e microbiologia, possibilita a adoção de diferentes tipos de reatores, com elevado desempenho e eficiência na redução da Demanda Bioquímica de Oxigênio. Os processos biológicos de tratamento de rejeitos incorporam uma variedade de espécies microbianas e, portanto, uma versatilidade metabólica bastante grande. Por exemplo, alguns processos apresentam espécies bacterianas capazes de degradar compostos complexos e artificialmente sintetizados, ao mesmo tempo que outros, possuem bactérias que apenas degradam moléculas orgânicas simples,como o ácido acético, produzindo um poderoso combustível, o gás metano. A estação pode ser dividida em três seções: (1) - separação física do material que entra no sistema, separação mecânica; (2) - processos biológicos, aeróbio e anaeróbio, (3) - lançamento do efluente tratado. Definição de Demanda Bioquímica de Oxigênio (DBO), segundo Branco e Hess (1975) e Glazer e Nikaido (1995). A Demanda Bioquímica de Oxigênio, em termos práticos, é representada pela quantidade de oxigênio consumida pela unidade de volume de um resíduo, em determinadas condições, através da metabolização da matéria biodegradável por organismos vivos ou por suas enzimas. É, portanto, um parâmetro de medida, que determina através de um bioensaio, a quantidade de oxigênio dissolvido consumido por microrganismos aeróbios durante a metabolização da matéria orgânica biodegradável. 18 Esquema genérico de uma estação de tratamento de esgotos sanitários, em que observam- se os processos físicos de separação e biológicos de tratamento da água residuária (baseado em Glazer e Nikaido, 1995). O fluxo da água residuária na estação de tratamento é conduzido em etapas, como descrito a seguir: (1) [tratamento primário], remoção física de materiais grosseiros pela passagem através de grades, sedimentação rápida de partículas no tanque de areia e sedimentação mais lenta no decantador primário; (2) [tratamento secundário], biodegradação aeróbia no tanque de aeração, da matéria orgânica contida no sobrenadante originado no decantador primário (oxidação biológica por Lodos Ativados), e biodegradação anaeróbia no biodigestor anaeróbio das frações sólidas originadas nos decantadores primário e secundário (Biodigestão Anaeróbia); (3) [tratamento terciário], remoção de compostos inorgânicos e/ou microrganismos patógenos por processos físico-químicos, com a finalidade de produzir um efluente de qualidade adequada ao corpo d'água receptor. O tratamento secundário engloba a atuação dos microrganismos na remoção dos compostos orgânicos do meio, através dos metabolismos aeróbio nos processos por lodos ativados, e anaeróbio, nos processos de biodigestão anaeróbia. Os agentes biológicos mais importantes na degradação da matéria orgânica poluente são as bactérias, que se desenvolvem no sistema mediante 19 condições controladas de operação dos reatores, bem como do tipo de água residuária a ser tratada. Valores de DBO para diferentes tipos de águas residuárias. Águas residuárias DBO (mg/L) Esgotos sanitários 200-600 Efluente de enlatados - alimentos 500-2.000 Efluente de cervejarias 500-2.000 Efluente de processamento de óleo - comestível 15.000-20.000 Efluente de destilaria de álcool (vinhaça) 15.000-20.000 Percolado de aterros sanitários (chorume) 15.000-20.000 Efluente de laticínios (sem recuperação de soro de leite) 30.000 Efluente de matadouros (sem recuperação de resíduos) 30.000 A composição da água residuária pode selecionar os grupos microbianos nos processos de tratamento, além da disponibilidade ou não de oxigênio no sistema. A constituição do esgoto sanitário, cujo os valores de DBO são menores, é cerca de 65% proteínas, 25% carboidratos, 10% lipídeos e o restante corresponde a frações inorgânicas como minerais e metais. stas características possibilitam o desenvolvimento de diferentes heterótrofos no meio, em sua maioria bactérias entéricas, o que é razoável frente ao nicho ecológico formado nos reatores empregados no tratamento de esgotos sanitários. Do mesmo modo, a presença de nitrogênio sob a forma amoniacal poderia facilitar o crescimento de bactérias nitrificantes, e o produto metabólico, o nitrato, certamente favoreceria o aparecimento de bactérias desnitrificantes. Os processos biológicos de tratamento estão intrinsicamente relacionados ao metabolismo microbiano que selecionam. Em outras palavras, os bioreatores que operam sob condições de aeração, possibilitam o desenvolvimento de microrganismos aeróbios, que através da respiração aeróbia oxidam as moléculas orgânicas [processos biológicos aeróbios de tratamento]. Nos bioreatores anaeróbios, por sua vez, são selecionados microrganismos capazes de crescer através do metabolismo fermentativo ou pela respiração anaeróbia [processos biológicos anaeróbios de tratamento]. 20 Portanto, a oxidação dos compostos orgânicos pode ocorrer por diferentes vias do metabolismo microbiano, possibilitando o desenvolvimento de vários aspectos da engenharia dos bioreatores e resultando em variantes dos processos tradicionais aeróbios e anaeróbios. Alguns sistemas biológicos empregados no saneamento básico, bem como algumas de suas funções: Sistemas biológicos e funções específicas. Sistemas biológicos Funções Lagoas de estabilização Fornecimento natural de oxigênio pelo desenvolvimento de algas em lagoas construídas para a degradação microbiana de compostos orgânicos poluentes, e conversão a dióxido de carbono e água. Lodos Ativados, Filtros biológicos, Lagoas aeradas e Valos de oxidação Degradação microbiana de compostos orgânicos poluentes através do metabolismo aeróbio, facilitado pela disponibilidade artificial de oxigênio em reatores ou em lagoas, e conversão a dióxido de carbono e água. Sistemas de nitrificação Conversão de compostos orgânicos nitrogenados e amônia a nitratos Sistemas de desnitrificação Conversão de nitratos a nitrogênio gasoso Sistema alternado anóxico e aeróbio para remoção de nutrientes Remoção de nutrientes, particulamente de fosfatos Biodigestão anaeróbia Degradação microbiana de compostos orgânicos a ácidos orgânicos, álcoois, hidrogênio, dióxido de carbono e metano Fontes: Baseado em COOKSON Jr. (1995). Os sistemas biológicos de tratamento desenvolvidos são operados, portanto, sob condições aeróbias ou anaeróbias, dependendo da natureza dos resíduos orgânicos a serem degradados, da dimensão dos reatores, além de outros requerimentos específicos. Além disso, nos processos biológicos que ocorrem dentro dos sistemas é possível observar mais de um metabolismo microbiano 21 ativo, como pode ser observado nos Lodos Ativados, pela existência da respiração aeróbia e nitrificação por diferentes espécies bacterianas. Em geral, os diferentes tipos microbianos nos processos biológicos de tratamento atuam conjuntamente, formando uma verdadeira cadeia alimentar com interações nutricionais facultativas e obrigatórias. Os microrganismos nos bioreatores podem ser encontrados livres, floculados, agregados ou formando biofilmes em materiais utilizados para enchimento de certos tipos de reatores, como por exemplo, os filtros biológicos aeróbios e anaeróbios. Atualmente, têm sido realizadas várias pesquisas para otimizar os processos biológicos na remoção de nutrientes dos esgotos sanitários, como nitrogênio e fósforo, bem como na destoxificação de poluentes industriais. Neste último caso, o uso de bioreatores com microrganismos selecionados e especializados na degradação de compostos halogenados vem se tornando realidade. A evolução tecnológica dos bioreatores resultou, principalmente, em soluções para as águas residuárias. Assim, o tratamento dos resíduos sólidos não dispõe de um grande número de opções em termos de reatores biológicos na estabilização da matéria orgânica. O sistema mais comum de disposição e tratamento de resíduos sólidos municipais é o aterro sanitário. O processo biológico predominante nos aterros é o anaeróbio, semelhante ao que ocorre nos biodigestores anaeróbios. Contudo, nas etapas iniciais dabiodegradação microbiana podem ser encontrados fungos e bactérias aeróbias bastante ativos, particularmente na degradação de materiais celulósicos. 2.2.3 Microrganismos aeróbios O sistema biológico mais comumente utilizado como exemplo dos processos aeróbios é o conhecido por Lodos Ativados. No entanto, sua descrição microbiana é bastante semelhante para outros sistemas, como os filtros biológicos, as lagoas aeradas e os valos de oxidação. O processo aeróbio que se desenvolve nos sistemas de Lodos Ativados é usualmente empregado no tratamento secundário de esgotos sanitários. Microrganismos presentes nos Processos Aeróbios de Tratamento de Águas Residuárias por Lodos Ativados . 22 A característica principal da massa celular produzida é a formação de aglomerados bacterianos, que possibilita a separação das células floculadas do meio líquido no tanque de aeração. Nas estações de tratamento a sedimentação do lodo floculado ocorre no decantador secundário. A floculação bacteriana é consequência direta da operação do bioreator, que promove condições de estresse nutricional, conduzindo a menor atividade de parte das células no sistema, ou induzindo o metabolismo endógeno celular. A baixa atividade das bactérias favorece a floculação no reator, bem como a auto-oxidação das células, o que em certo grau auxilia na diminuição da massa celular. As bactérias responsáveis pelo processo biológico e presentes no floco pertencem a diferentes gêneros, e em sua grande maioria são heterótrofas. Algumas espécies de bactérias filamentosas são também heterótrofas, removendo a matéria orgânica do meio, e outras são capazes de oxidar compostos reduzidos de enxofre, com formação intracelular de grânulos de enxofre elementar, como é o caso dos gêneros Thiothrix sp e Beggiatoa sp. Estas bactérias podem ser encontradas na estrutura dos flocos ou livres, e são em geral, os organismos responsáveis pela ocorrência de um dos graves problemas no tanque de aeração, o intumescimento do lodo. O crescimento em abundância das filamentosas, como efeito de algum desequilíbrio operacional do sistema, forma uma macroestrutura semelhante a uma rede, que interfere na sedimentação e compactação do floco bacteriano, além da competição com as demais espécies bacterianas pelo substrato orgânico. A existência de outros metabolismos bacterianos também pode ser exemplificada pelas espécies quimioautótrofas Nitrosomonas sp e Nitrobacter sp. A primeira oxida a amônia a nitrito, e a segunda, nitrito a nitrato. As atividades combinadas desses dois organismos efetuam a conversão completa da amônia a nitrato nos processos aeróbios. Bactérias heterótrofas, quimioautótrofas, protozoários e micrometazoários. Dentre os tipos bacterianos, destacam-se as bactérias filamentosas. Os microrganismos aeróbios [lodos ativados] no sistema de lodos ativados promovem a seguinte reação : Matéria orgânica + O2 + Nutrientes ( CO2 + NH3 + Células + outros produtos) 23 Nos tanques de aeração são encontrados protozoários e micrometazoários, indicados como clarificadores do meio. As bactérias constituem a base nutricional dos protozoários, e estes, em conjunto com as próprias bactérias, são consumidos pelos micrometazoários. Os tipos microbianos dos Lodos Ativados são encontrados naturalmente nos ecossistemas aquáticos, e se estabelecem no bioreator através das condições de operação, como características e quantidade da matéria orgânica presente na água residuária, agitação, disponibilidade de oxigênio dissolvido e interações microbianas. No início do processo, pode-se observar a presença de amebas e flagelados, posteriormente substituídos por protozoários holozóicos, como por exemplo, os ciliados livre-natantes. O clímax do sistema atinge quando se observa a presença de ciliados sésseis, e micrometazoários, como os rotíferos e nematóides. O emprego prático da avaliação dos tipos de protozoários e micrometazoários presentes no bioreator é de extremo valor, uma vez que análises microscópicas bastante simples podem indicar as condições de operação do sistema. Os fungos não são comuns ao sistema de Lodos Ativados, mas quando presentes pertencem ao grupo dos Deuteromicetos (fungos imperfeitos). No entanto, podem predominar quando o tratamento de águas residuárias de origem industrial resulta em acentuada queda de pH no meio, ou limita a disponibilidade de fontes nitrogenadas. Heterótrofas: Pseudomonas sp, Zooglea ramigera, Achromobacter sp, Flavobacterium sp, Bdellovibrio sp, Mycobacterium sp, Alcaligenes sp, Arthrobacter sp e Citromonas sp. Filamentosas: Sphaerotillus natans, Beggiatoa sp, Thiothrix, Leucothrix sp, Microthrix parvicella, Nocardia sp, Nostocoida limicola, Haliscomenobacter hydrossis, Flexibacter sp e Geotrichum sp. Nitrificantes: Nitrosomonas sp e Nitrobacter sp. Filo Protozoa Exemplos Classe SarcodinaAmebas - Arcella discoides, Amoeba sp Classe Ciliata Ciliados livre-natantes e sésseis - Aspidisca costata, Trachelophyllum sp, Paramecium sp, Didinium sp, Chilodenella sp 24 Classe MastigophoraFlagelados - Spiromonas sp, Bodo sp, Euglena sp, Monas sp, Cercobodo sp 2.2.4 Microrganismos anaeróbios Nos processos anaeróbios ou, nos sistemas de biodigestão anaeróbia, a degradação da matéria orgânica envolve a atuação de microrganismos procarióticos anaeróbios facultativos e obrigatórios, cujas espécies pertencem ao grupo de bactérias hidrolíticas-fermentativas, acetogênicas produtoras de hidrogênio e metanogênicas. A bioconversão da matéria orgânica poluente com produção de metano requer a cooperação entre culturas bacterianas. Na atividade microbiana anaeróbia em biodigestores, como também em habitats naturais com formação de metano (sedimentos aquáticos, sistema gastrointestinal de animais superiores, pântanos, etc.), o que se observa é a ocorrência da oxidação de compostos complexos, resultando nos precursores do metano, acetato e hidrogênio. Esquema que representa o fluxo de carbono durante a decomposição anaeróbia da matéria orgânica complexa a metano. A natureza da gênese do metano em etapas, a partir de compostos orgânicos complexos, mostra a importância das interações microbianas que buscam evitar o acúmulo de ácidos orgânicos e álcoois no meio em fermentação. São vários os tipos de bactérias que participam no processo: 25 Exemplos de espécies de bactérias anaeróbias presentes nos tratamentos de rejeitos por biodigestão anaeróbia. FONTE: in ZEHNDER (1988). Os organismos da biodigestão anaeróbia apresentam um elevado grau de especialização metabólica. A eficiência do processo anaeróbio depende, portanto, das interações positivas entre as diversas espécies bacterianas, com diferentes capacidades degradativas. Os intermediários metabólicos de um grupo de bactérias podem servir como nutrientes ao crescimento de outras espécies. Assim, observa-se a ocorrência de várias reações de degradação dos compostos orgânicos e a dependência das mesmas da presença do hidrogênio formado no sistema. Os organismos da biodigestão anaeróbia apresentam um elevado grau de especialização metabólica. A eficiência do processo anaeróbio depende, portanto, das interações positivas entre as diversas espécies bacterianas, com diferentes capacidades degradativas. Os intermediários metabólicos de um grupo de bactérias podem servir como nutrientes ao crescimento de outras espécies. Assim, observa-se a ocorrência de várias reações de degradação dos compostos orgânicos e a dependência das mesmas da presença do hidrogênio formado no sistema. Exemplosde reações que ocorrem nos biodigestores anaeróbios, e as energias livres destas reações sob condições padrão de ocorrência e nos biodigestores. Etapas da biodigestão anaeróbiaEspécies bacterianas Hidrólise e acidogênese.......Clostrídios, Acetivibrio cellulolyticus, Bacteroides succinogenes, Butyrivibrio fibrisolvens, Eubacterium cellulosolvens, Bacillus sp, Selenomonas sp, Megasphaera sp, Lachnospira multiparus, Peptococcus anaerobicus, Bifidobacterium sp, Staphylococcus sp Acetogênese......Syntrophomonas wolinii, S. wolfei, Syntrophus buswellii, Clostridium bryantii, Acetobacterium woddii, várias espécies de bactérias redutoras do íon sulfato - Desulfovibrio sp, Desulfotomaculum sp Metanogênese acetoclástica......Methanosarcina sp e Methanothrix sp Metanogênese hidrogenotrófica......Methanobacterium sp, Methanobrevibacter sp, Methanospirillum sp 26 Reações (G0)(kcal/reação) (G1)(kcal/reação) 1. Conversão da glicose em metano e dióxido de carbono C6H1206 + 3H2O ( 3CH4 + 3HCO3- + 3H+ -96,5 -95,3 2. Conversão da glicose em acetato e hidrogênio C6H1206 + 4 H2O( 2CH3COO- + 2 HCO3- + 4H+ + 4H2 -49,3 -76,1 3. Metanogênese do acetato CH3COO- + H2O( CH4 + HCO3- -7,4 -5,9 4. Metanogênese do hidrogênio e dióxido de carbono 4H2 + HCO3- + H+ (CH4 + 3H2O -32,4 -7,6 5. Acetogênese do hidrogênio e dióxido de carbono 4H2 + 2HCO3- + H+ ( CH3COO- + 4H2O -25,0 -1,7 6. Oxidação de aminoácido Leucina + 3H2O ( isovalerato + HCO3- + NH4+ + 2H2 +1,0 -14,2 7. Oxidação do butirato a acetato CH3CH2CH2COO- + 2H2O (2CH3COO- + H+ + 2H2 +11,5 -4,2 8. Oxidação dopropionato a acetato CH3 CH2COO- + 3H2O - ( CH3COO- + HCO3- + H++ 3H2 +18,2 -1,3 9. Oxidação do benzoato a acetato C7 H5 O2- + 7H2O ( 3CH3COO- + HCO3- + 3H+ + 3H2 +21,4 -3,8 10. Desalogenação redutiva H2 + CH3 Cl ( CH4 + H++ Cl- ) -39,1 -29,0 A remoção do hidrogênio nos sistemas anaeróbios é feita pela ação de bactérias anaeróbias hidrogenotróficas, representadas por espécies de metanobactérias e de redutoras do íon sulfato. A cooperação entre as bactérias produtoras e consumidoras de hidrogênio, sob condições anaeróbias, é denominada "transferência de hidrogênio entre espécies". Os dados das variações de energia livre das reações e associados à oxidação anaeróbia da glicose, ácidos orgânicos, aminoácidos e benzoato pelas bactérias fermentativas e acetogênicas produtoras de hidrogênio, indicam a necessidade de baixas pressões parciais de hidrogênio no sistema. Na prática, contudo, a natureza dos substratos orgânicos presentes nos resíduos em um biodigestor é raramente tão bem definida ou, tão simples como a glicose. Além disso, os reatores anaeróbios podem receber cargas orgânicas variáveis, e portanto, quase sempre, os ácidos orgânicos estão presentes. Os sistemas de biodigestão anaeróbia foram inicialmente adotados na estabilização da fração sólida dos esgotos sanitários e de resíduos agrícolas. 27 Esta escolha deveu-se às baixas velocidades de degradação inerentes ao metabolismo anaeróbio (fermentação e respiração anaeróbia). Por sua vez, os processos aeróbios sempre foram adequados para o tratamento de resíduos líquidos com concentrações baixas de matéria orgânica, devido a demanda artificial de oxigênio. Assim, surgiu a necessidade de sistemas que suportassem concentrações elevadas de matéria orgânica poluente, e boas velocidades na biodegradação. A concepção dos reatores anaeróbios avançados iniciou como uma resposta à necessidade de tratamento das águas residuárias com elevada Demanda Bioquímica de Oxigênio. Na Europa, durante o início dos anos 80, a biodigestão anaeróbia tornou-se então atraente, pois possibilitou o tratamento de diferentes tipos de águas residuárias de origem industrial. Particularmente no Brasil, as pesquisas realizadas com bioreatores como os filtros anaeróbios e o reator anaeróbio de fluxo ascendente e manta de lodo, permitiram a adoção com sucesso desses sistemas não somente para as águas residuárias de origem industrial, como para os esgotos sanitários . O elevado desempenho dos biodigestores anaeróbios modernos, denominados avançados ou não-convencionais, é consequência da organização eficiente dos microrganismos anaeróbios e sua retenção no reator. Os microrganismos fisicamente organizados em aglomerados bacterianos, grânulos biológicos, ou em biofilmes, ficam facilmente retidos dentro do sistema. A presença de um material que suporte a adesão dos microrganismos não é obrigatória em alguns reatores, como no caso do lodo granulado dos reatores de fluxo ascendente e manta de lodo A utilização dos processos anaeróbios para o tratamento de resíduos possue várias vantagens sobre os processos aeróbios, tais como: - baixa produção de lodo; - poucos requerimentos nutricionais à fermentação; - baixo ou nenhum gasto de energia; - aplicação de elevadas cargas orgânicas; - recuperação potencial de energia na forma de metano (biogás); - degradação de certos compostos tóxicos, tais como halogenados recalcitrantes à degradação aeróbia; - habilidade em preservar a atividade do lodo por longos períodos sob ausência de alimentação. 28 2.2.5 Potencial microbiano Os microrganismos nos sistemas biológicos de tratamento de rejeitos podem atuar de maneira particular, ou seja, realizando reações de transformação de certas moléculas por mecanismos específicos de seu metabolismo. Assim, bioreatores podem ser operados de modo a selecionar a atividade de uma bactéria em particular. Alguns exemplos são os sistemas biológicos que favorecem prioritariamente a nitrificação, ou aqueles que conduzem a desnitrificação. A composição dos resíduos poluentes, somada às modificações na operação ou construção dos bioreatores constituem a base para a seleção do microrganismo em questão. Outro importante exemplo nesse sentido, é o sistema de Lodos Ativados modificado, operado para a remoção de nutrientes. Os esgotos domésticos, por exemplo, possuem quantidades em excesso de fósforo e nitrogênio, que nos processos biológicos de tratamento não são consumidas pelo crescimento microbiano. Portanto, o residual não utilizado pode ser lançado diretamente nos corpos d'água receptores, ocasionando eutrofização do meio, toxicidade pela amônia e prejuízos aos sistemas de abastecimento. O sistema desenhado para a remoção de nutrientes seleciona em bioreatores, sequencialmente operados sob aerobiose e anaerobiose, bactérias capazes de remover fosfatos do meio, bem como promove a nitrificação e desnitrificação. Os compostos poluentes sintéticos possuem estruturas bastante complexas e desconhecidas para o metabolismo bacteriano. A biodegradação de algumas moléculas orgânicas xenobióticas pode ocorrer pelos processos biológicos aeróbios e anaeróbios, e sua completa estabilização depende das velocidades das reações realizadas pelos microrganismos. Este potencial microbiano tem sido ilustrado pela capacidade de espécies bacterianas, presentes nos bioreatores aeróbios e anaeróbios, em degradar detergentes como os alquilbenzenos sulfonados lineares (LAS) e ramificados (BAS). O passo limitante da degradação microbiana desses detergentes é a separação do radical alquila do anel benzeno sulfonado, pois a reação de degradação dos ácidos graxos resultantes ocorre pela via microbiana comum 29 de (-oxidação. O anel aromático sulfonado é degradado posteriormente, a dióxido de carbono, água e sulfato. Mais recentemente, a atenção de vários pesquisadores no mundo está voltada para a problemática de compostos xenobióticosaltamente tóxicos ao meio ambiente. A atividade combinada de bactérias nos biotratamentos, através de reatores aeróbios e anaeróbios alternados, resulta na estabilização de poluentes aromáticos halogenados e nitroaromáticos. Os microrganismos responsáveis pela biodegradação de tais compostos podem ser selecionados de diferentes fontes naturais, ou dos tanques de aeração e biodigestão anaeróbia. Esta ação microbiana é de extrema importância para as tecnologias da bioremediação. A grande questão em discussão está em como os microrganismos se adaptam à utilização de moléculas xenobióticas, afim de suprir suas necessidades de carbono e energia. Existem grandes evidências de que os compostos halogenados não são incomuns a vida microbiana. Foram identificados cerca de 1.500 organohalogenados naturais, e alguns cloroaromáticos são produzidos por fungos. A adaptação das bactérias a esses poluentes ambientais tem sido verificada em vários estudos sobre as comunidades microbianas, que após longos períodos de incubaçãos, são capazes de degradar compostos como as bifenilas policloradas (PCBs). Autores como van der MEER et al. (1994) preconizaram duas possibilidades para a adaptação dos microrganismos às moléculas sintéticas: - existência de enzimas nas células microbianas que reconhecem a estrutura do composto como substrato, conduzindo a uma "adaptação bioquímica" celular; - alteração dos sistemas enzimáticos, pelo estímulo na expressão de novos genes necessários a conversão do composto, conduzindo a uma "adaptação genética" celular. As vantagens da biotransformação dos compostos aromáticos pelas células está nos mecanismos de produção de energia celular, uma vez que a variação de energia livre disponível durante a oxidação de certos aromáticos é alta. Alguns trabalhos sugerem que as reações microbianas favorecem a destoxificação do próprio meio pelos microrganismos. É certo contudo, que a 30 disponibilidade energética evidencia "o interesse real das células" na utilização de um aromático poluente. A existência de materiais poluentes antropogênicos tem favorecido o desenvolvimento de tecnologias que adotam bioreatores com células microbianas especializadas na degradação eficiente de um composto. Além disso, estimula o uso da biologia molecular na engenharia de novas células com o objetivo de alterar as propriedades enzimáticas celulares, modificar os mecanismos regulatórios e reunir em um único organismo os sistemas enzimáticos de interesse, encontrados em espécies microbianas filogeneticamente distintas. Um exemplo descrito por Glazer e Nikaido (1995), é a bactéria Pseudomonas putida modificada, e assim, hábil na degradação de uma gama de alquilbenzoatos. 2.3 Bioremediação No âmbito desse texto, a definição de bioremediação é feita segundo COOKSON Jr. (1995). Assim, bioremediação é a tecnologia de utilização de microrganismos na recuperação de áreas degradadas pela disposição de resíduos, particularmente os resíduos químicos tóxicos. A bioremediação requer o controle e a manipulação de processos biológicos microbianos in situ, ou seja, na área degradada, introdução de microganismos específicos no local poluído, e, quando imprescindível, em reatores operados no local de disposição do material poluente. Nesse último caso, ocorre a interface com as tecnologias de biotratamento. Porém, na bioremediação, o objetivo principal é a obtenção de consórcios microbianos ou culturas bacterianas altamente especializadas na degradação de determinados poluentes. 31 Bioremediação : "Dando uma mão para a natureza" (LIU; SUFLITA,1993). 1. relocação de materiais; 2. síntese de compostos; 3. depósitos naturais; 4. extração pela atividade antrópica; 5. área em recuperação. Bioremediação: "Dando uma mão para a natureza" A bioremediação é praticada de modo a promover as melhores condições ambientais para o desenvolvimento da capacidade metabólica dos microrganismos em questão, selecionando a melhor combinação de doadores e aceptores de elétrons, e no caso da existência de co-metabolismo (enzimas envolvidas na degradação de um substrato, suportam a transformação do substrato orgânico poluente), a seleção do substrato primário. No ecossistema global a decomposição em dióxido de carbono e água da matéria orgânica poluente, originada da atividade antrópica, pode ser atualmente estimulada pela utilização de métodos que otimizem a biodegradação microbiana no meio. Em última análise, métodos que manipulem no local de deposição do poluente, o potencial catabólico microbiano pela seleção de grupos de organismos de interesse, ou introduzam no sistema organismos previamente selecionados. 32 Sistemas mais comuns utilizados na bioremediação de áreas degradadas. Fonte: Cookson Jr. (1995). Exemplos sobre a aplicação da tecnologia de bioremediação. Ações microbianas Dificuldades Soluções Otimização da degradação de fenantreno em solos contaminados com óleos de alcatrã, através da ação de Phanerochaeta chrysosporium Inexistência de população especializada in situ. Inoculação com organismos externos. Otimização da mineralização de pireno, benzopireno e carbazol por consórcios microbianos Baixa população de agentes degradadores in situ. Seleção e enriquecimento in situ. Co-metabolismo de PCBs pela espécie Acinetobacter sp, estimulado pela presença do substrato primário benzoato Ausência de substrato para crescimento. Suplementação com o substrato primário. Favorecimento do metabolismo anaeróbio para a ocorrência de reações de desalogenação redutiva (reações de redução de moléculas halogenadas, seguida de sua degradação) Condições físico-químicas ambientais Alteração das condições ambientais. Estimulação da biodegradação clorofenóis pela presença de doadores de elétrons (ácidos orgânicos e álcoois) Ausência de doadores de elétrons que favorecem as reações de redução de compostos halogenados. Suplementação de compostos doadores de elétrons. Fonte: baseado em (LIU; SUFLITA, 1993). 3 PERSPECTIVAS Os microrganismos estão expostos a uma imensa variedade de compostos orgânicos nos ambientes naturais, incluindo os originados da matéria viva e Resíduos sólidos - Lagoas projetadas, lagoas in situ, movimentação de solos agriculturáveis, compostagem, reatores de lodos Resíduos líquidos - Lagoas projetadas, lagoas in situ, bioreatores de superfície, bioreatores de leito fixo, in situ através da saturação local. 33 dos processos geoquímicos. Virtualmente, cada um desses compostos pode ser utilizado como fonte de energia e/ou carbono por certos tipos microbianos. A espetacular versatilidade metabólica de bactérias e fungos é atualmente explorada pelo menos em duas áreas do saneamento ambiental: tratamento biológico de resíduos líquidos e sólidos, e degradação de compostos xenobióticos. O biotratamento de águas residuárias sanitárias e de origem industrial conduz a mineralização completa de compostos orgânicos pela atuação de microrganismos aeróbios e anaeróbios, resultando na recuperação das águas. Muitos compostos presentes em alguns resíduos líquidos (fenóis e clorobenzenos) são passíveis de degradação nesses sistemas biológicos. Outros, contudo, são lentamente ou incompletamente degradados, ou não são oxidados. Portanto, um composto pode ser biodegradável, mas a velocidade das reações de mineralização no biotratamento são insuficientes para evitar que este seja despejado no meio ambiente. Das consideraçõessobre a competência de um microrganismo em atuar sobre um composto, principalmente xenobiótico, surgiram as pesquisas sobre novas tecnologias, cujo o objetivo principal era o de solucionar problemas ambientais específicos. A bioremediação é uma das atuais soluções para poluentes ambientais, outrora considerados "recalcitrantes". As soluções para todos os problemas ambientais de poluição não existem, porém não é devido a ausência de tentativas. Muitos esforços têm sido empreendidos no desenvolvimento de sistemas que diminuam ou controlem a poluição das águas e dos solos. O manejo adequado de diversos ecossistemas, com o emprego correto das tecnologias disponíveis de biotratamento e bioremediação, é realidade inclusive nos países em desenvolvimento. Os obstáculos, contudo, são notadamente sentidos pela falta de conhecimento dos fundamentos dos sistemas biológicos empregados na "purificação" dos ambientes afetados por poluentes. Por exemplo, processos aeróbios tradicionalmente utilizados, como os Lodos Ativados, são operados com parâmetros químicos e físicos bastante rudimentares, se comparados a outros processos biotecnológicos na produção de bens de consumo. A pequena compreensão dos sistemas biológicos não impede sua aplicação com bons 34 resultados para o ambiente, mas com certeza, não permite a exploração máxima do potencial microbiano. Alguns aspectos são de particular interesse para a biotecnologia ambiental: - estudos sobre os consórcios microbianos envolvidos nos processos biológicos aeróbios e anaeróbios; - estudos sobre a fisiologia dos microrganismos de interesse na área ambiental, particularmente os atuantes na degradação de compostos tóxicos; - desenvolvimento de novos reatores; - modelagem dos processos biológicos; - aumento de escala dos bioreatores; - utilização de microrganismos específicos na degradação de certos compostos; - viabilização do emprego de microganismos modificados pelas técnicas de engenharia genética (GMOs). As dificuldades inerentes ao aumento de escala, ou seja, "do laboratório para o meio ambiente", são sentidas nos métodos para a bioremediação. O Quadro 9 resume alguns requerimentos específicos que devem atender o emprego de técnicas de bioremediação, bem como do monitoramento das áreas em recuperação. Requerimentos específicos às técnicas de bioremediação e monitoramento das áreas em recuperação. No Brasil, atualmente, os esforços desenvolvidos para a elucidação da microbiologia ambiental são incipientes se comparados àqueles nos países desenvolvidos. Os estudos se concentram em maior intensidade na microbiologia de águas de abastecimento, portanto controle de qualidade de mananciais e avaliação da biodegradação de compostos poluentes, do que na microbiologia dos processos de tratamento de resíduos. Porém, nota-se o aparecimento de grande interesse às linhas de pesquisa que contemplam a avaliação da microbiologia de bioreatores aplicados ao tratamento de resíduos, não somente pela sua importância intrínseca, mas também devido ao melhor Seleção de culturas; enriquecimento in situ; compreensão das interações microbianas, entre microrganismos autóctones e alóctones; identificação de poluentes chaves; domínio na manipulação in situ dos microrganismos; estabelecimento prévio dos processos físico-químicos; avaliação de efeitos transientes nas áreas em questão; avaliação do ecossistema microbiano como um todo; operar com instrumentos sensíveis às modificações locais; desenvolver biosensores; avaliação do impacto provocado pela inserção de GMOs nos ecossistemas em recuperação. 35 conhecimento da biodiversidade microbiana existente nos ecossistemas brasileiros. A tendência no Brasil é o desenvolvimento de processos biológicos de tratamento de baixo custo, que permitam a sua utilização em larga escala, atendendo às necessidades inerentes a qualidade ambiental e de saúde pública, além da preservação dos recursos naturais, notadamente os ecossistemas aquáticos. AULAS PRÁTICAS 36 1- NORMAS DE SEGURANÇA NO LABORATÓRIO DE MICROBIOLOGIA As aulas práticas de Microbiologia têm como objetivo ensinar ao acadêmico os princípios gerais e métodos utilizados no estudo de microbiologia. É essencial que as normas sejam seguidas, a fim de se evitar contaminações acidentais. 01- O uso do jaleco é obrigatório. 02- Cabelos longos devem ser amarrados de forma a não interferir com reagentes e equipamentos. 03- Limpar e desinfetar a superfície das bancadas antes e depois de cada aula prática. 04- Lavar as mãos e calçar luvas de procedimento ao iniciar a análise, lavar as mãos antes de sair do laboratório e sempre que for necessário. Se for portador de algum ferimento nas mãos, procurar não tocar no material. 05- Identificar as amostras, bem como o material a ser utilizado antes de iniciar a análise. 06- Utilizar exclusivamente material estéril para a análise. 07- No caso de derramamento do material contaminado, proceder imediatamente a desinfecção e esterilização. O mesmo procedimento deverá ser repetido se ocorrer ferimentos ou cortes. 08- Não comer, beber ou fumar no laboratório. 09- Não deixar seus pertences sobre os balcões onde os experimentos serão realizados 10- Manter canetas, dedos e outros longe da boca. 11- Não utilizar material de uso pessoal para limpar os objetos de trabalho. 12- Avisar ao professor em caso de contaminação acidental. 13- Depositar todo o material utilizado em recipiente adequado, jamais os deixando sobre a bancada. 14- Flambar as alças, agulhas e pinças antes e após o uso. CURSO DE TECNOLOGIA EM SANEAMENTO AMBIENTAL DISCIPLINA: MICROBIOLOGIA AULA 01 NORMAS DE SEGURANÇA E MATERIAIS UTILIZADOS NO LAB. DE MICRO. Profª.: JOSIANA LAPORTI TURMA: ________ DATA: ________ ALUNO:___________________________________________________ 37 15- Os cultivos após a leitura devem ser encaminhados para esterilização, portanto não os colocar na estufa ou despejar na pia. 16- Colocar os materiais contaminados (pipetas, lâminas e etc) em recipientes apropriados colocados na bancada. 17- Desinfetar a bancada de trabalho com álcool ou hipoclorito de sódio, ao início e término de cada aula prática. Isto removerá microorganismos que possam contaminar a área de trabalho. 18- Seguir as normas de uso de aparelhos. O microscópio deve ser manuseado cuidadosamente e após o seu uso, desligá-lo, limpá-lo, e colocar a capa. 19- Ao acender o Bico de Bunsen, verificar se não há vazamento de gás ou substâncias inflamáveis por perto. 20- Trabalhe sempre próximo ao fogo, preservando o cuidado pessoal. MATERIAIS UTILIZADOS NO LABORATÓRIO DE MICROBIOLOGIA 1. Autoclave (calor úmido) - O seu funcionamento baseia-se no vapor d’água sob pressão, e é utilizada para esterilização de materiais usados em microbiologia, principalmente meios de cultura. 2. Estufa esterilizadora ou Forno Pasteur (calor seco) - Usado para esterilizar materiais secos tais como tubos, placas, etc. 3. Estufa Incubadora – Onde os microrganismos são mantidos durante o seu desenvolvimento em uma temperatura constante. 4. Microscópio - Para observação de microrganismos. 5. Placa de Petri - Recipiente redondo de vidro com tampa rasa, destinada ao cultivo de microrganismos em meio sólido. 6. Tubo de Cultura - Destinado ao cultivo de microrganismos em pequeno volume de meio (líquido ou sólido). 7. Pipeta Graduada - Utilizada para diluição, inoculação, etc. Contém um tampão de algodão em uma das extremidades.8. Lâmina e Lamínula - Para o exame microscópico de microrganismos. LIMPEZA E PREPARAÇÃO DOS MATERIAIS DE LABORATÓRIO DE MICROBIOLOGIA 38 É muito importante a assepsia dos materiais e do próprio laboratório, quando se trabalha com microrganismos, isto porque, qualquer matéria estranha pode ser uma fonte de contaminação. Placas de Petri - se tiverem culturas desenvolvidas, devem ser inicialmente autoclavadas (120ºC, 20 minutos), o meio de cultura escorrido ainda quente, lavadas com água e sabão e deixadas por algumas horas em solução detergente. Depois disso são passadas em água corrente, secas e preparadas para a esterilização. As tampas são revestidas com discos de papel de filtro e as placas são então embrulhadas ou colocadas em estojos apropriados para serem esterilizadas em estufa a 180 ºC por 90 minutos. Tubos de Culturas - se tiverem culturas desenvolvidas, proceder como descrito anteriormente. Após a lavagem, e antes da esterilização, são tamponados com algodão. A esterilização é feita em estufa (180ºC, 90 minutos) ou em autoclave, quando já possuem meio de cultura em seu interior. Pipetas - são lavadas com água corrente, deixadas em soluções detergente e novamente passadas em água. Depois de secas, coloca-se uma mecha de algodão na boquilha e em seguida, são esterilizadas em estojos especiais ou embrulhadas em papel. No caso do uso de pipetas automáticas, as ponteiras devem ser esterilizadas e descartadas após os uso. Lâminas e lamínulas - uma vez retiradas do microscópio, são colocadas numa cuba contendo solução detergente. Daí são lavadas, deixadas uma noite em solução e lavadas novamente. Observações: · Alça e fio de platina devem ser flambados antes e depois de qualquer operação de semeadura. É importante que se faça o esfriamento da alça antes de ser colhido o material. · Em relação às semeaduras feitas em tubos de ensaio, devem ser flambadas as bocas dos mesmos, após a retirada e antes da colocação do tampão de algodão. Este deve ser mantido pelo dedo mínimo da mão direita e nunca deixado sobre a mesa do laboratório. 39 · As placas de Petri deverão ser manuseadas com cuidado e não poderão ficar abertas no ambiente, além do cuidado de manuseá-las sempre próximo a uma chama. Uma vez semeadas, devem ser incubadas em estufa, com a tampa voltada para baixo. OBS: A utilização do Bico de Bunsen é essencial, pois visa a diminuição de microrganismos no campo de trabalho através do calor. Para isso ele apresenta uma regulagem que torna possível selecionar o tipo de chama ideal para o trabalho. No caso da Microbiologia deve ser utilizada a chama azul porque esta atinge maior temperatura e não forma fuligem. É importante ressaltar que a chama apresenta diferentes zonas, e tal fato é importante para que o processo de Flambagem seja executado adequadamente, já que certas zonas da chama devem ser evitadas. As zonas da chama são: Zona Neutra (é uma zona fria e, portanto, não deve ser utilizada para Flambagem), Zona Redutora e Zona Oxidante (são zonas onde já ocorre a combustão e, portanto, já podem ser usadas para a Flambagem). Bico de Bunsen QUESTÕES PARA ESTUDO 1. Qual a importância da utilização do Bico de Bunsen nas técnicas microbiológicas? 2. Por que devemos usar a flambagem na chama azul do Bico de Bunsen? 3. Diferencie: esterilização, desinfecção, assepsia, anti-sepssia e limpeza. 4. Como são classificados os meios de cultura? 40 5. Quais as funções da semeadura de microrganismos em meios de cultura? 41 2- MEIOS DE CULTURA, TÉCNICAS DE ISOLAMENTO E SEMEADURA BACTERIANA Para o cultivo de microrganismos em condições laboratoriais é necessário o conhecimento de suas exigências nutricionais e das condições físicas requeridas. Quando as bactérias e outros microrganismos crescem em meios de laboratórios, dá-se o nome de cultura. Existe uma variedade de técnicas através dos quais os microrganismos podem ser cultivados e isolados em laboratórios. Os microrganismos podem ser cultivados em meios sólidos ou líquidos. • Cultivo em caldo: Os meios líquidos possuem grande sensibilidade para o crescimento de um pequeno número de microrganismos, porém a identificação de culturas mistas requer subcultivos posteriores em meio sólido para que colônias possam ser processadas separadamente propiciando uma correta identificação. • Cultivo em ágar: Os meios sólidos, embora menos sensíveis que os meios líquidos, permitem a obtenção de colônias isoladas para serem identificadas posteriormente. De acordo com sua composição, os meios de cultura (caldo ou agar) podem ser classificados como: • Meio rico: Além de todos os nutrientes indispensáveis ao crescimento bacteriano, o meio rico é constituído de nutrientes adicionais (tais como: sangue, soro, extrato de plantas ou animais) capazes de estimular o cultivo de microrganismos exigentes nutricionalmente. • Meio seletivo: Adequado ao isolamento de um grupo particular de microrganismos através da adição de substâncias químicas capazes de inibir certos grupos bacterianos sem afetar outros. CURSO DE TECNOLOGIA EM SANEAMENTO AMBIENTAL DISCIPLINA: MICROBIOLOGIA AULA 02: MEIOS DE CULTURA E TÉCNICAS DE ISOLAMENTO E SEMEADURA Profª.: JOSIANA LAPORTI TURMA: ________ DATA: ________ ALUNO: __________________________________________________ 42 • Meio indicador: Através da adição de certos reagentes ao meio, após inoculação e incubação, observa-se uma modificação no meio de cultura e /ou na colônia possibilitando o reconhecimento de certos grupos bacterianos. Semeadura em placa de petri contendo meio sólido: A semeadura dos microrganismos pode ser realizada por: - Estrias: flamba-se a alça de platina no bico de Bunsen, depois de esfriada, introduz-se a alça no tubo ou placa contendo o microrganismo e retira-se um pequeno inóculo. Introduz-se a alça de platina na placa e desliza-se a mesma em vários sentidos sobre a meio de cultura sólido. - Por ponto: com um fio de platina flambado no bico de Bunsen, coleta-se um pequeno inóculo do microrganismo e introduz o fio no centro da placa de petri contendo o meio de cultura sólido. - Por espalhamento: com o auxílio de uma pipeta estéril retira-se 0,1 mL de uma cultura de microrganismo e coloca-se em uma placa de petri contendo meio de cultura sólido. Flamba-se a alça de Drigalsky em álcool e fogo e espalha-se por toda a superfície da placa. Semeadura em meio de cultura líquido Com uma alça de platina previamente flambada retira-se um inóculo de microrganismo contido em placa ou tubo de cultura e transfere-se para o tubo de cultura contendo meio líquido. TÉCNICA DE PREPARO DE MEIO DE CULTURA MATERIAL -Bastão de vidro -Algodão hidrófobo, gaze, papel de embrulho e barbante -Placas de petri esterilizadas -Balança -Bico de Bunsen, tripé e tela de amianto - Becker/ Balão -Agar nutriente -Água destilada. 43 MÉTODO 1-Pesar as quantidades dos meios desidratados de acordo com as instruções do seu orientador. Diluir o meio desidratado em água destilada, mexer bem até dissolver todo o pó. 2- Cozinhar os meios tendo o cuidado de agitar sempre, de modo a que permanecem com aspecto homogêneo e não se formem grânulos. 3- Após o cozimento rolhar os balões de Agar nutriente com rolha confeccionada com algodão hidrófobo e gaze. Envolver a rolha após colocada com papel de embrulho e amarrar bem com o barbante. 5- Leve os balões de Agar Nutriente a autoclavar por 15 minutos à temperatura de
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