Apostila de Microbiologia

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MICROBIOLOGIA 
 
 
 
 
PRÁTICAS DE LABORATÓRIO 
MATERIAL TEÓRICO 
 
 
 
 
Professora Josiana Laporti 
 
 
 
 
 
 
 
COORDENADORIA DO CURSO SUPERIOR DE TECNOLOGIA EM 
SANEAMENTO AMBIENTAL 
 2 
 
SUMÁRIO 
1 INTRODUÇÃO À MICROBIOLOGIA ............................................................................................... 3	
  
1.1 HISTÓRICO DA MICROBIOLOGIA ........................................................................................... 3	
  
1.2 A MICROBIOLOGIA NA ATUALIDADE ..................................................................................... 4	
  
1.3 A UBIQUIDADE DOS MICROORGANISMOS ........................................................................... 5	
  
1.4 PRINCIPAIS FUNÇÕES DOS MICROORGANISMOS NA NATUREZA ................................... 6	
  
1.5 MICROORGANISMOS COMO AGENTES DE DOENÇAS ....................................................... 8	
  
1.6 IMPORTÂNCIA DA MICROBIOLOGIA ...................................................................................... 8	
  
2 CLASSIFICAÇÃO DOS MICRORGANISMOS DE ACORDO COM SUA RELAÇÃO COM 
OXIGÊNIO ........................................................................................................................................ 10	
  
2.1 CLASSIFICAÇÃO DOS MICRORGANISMOS DE ACORDO COM SUA DIVERSIDADE 
METABÓLICA ................................................................................................................................ 10	
  
2.2 MICROBIOLOGIA E SANEAMENTO AMBIENTAL ................................................................. 11	
  
2.2.1 Problemática do Lançamento e Disposição de Rejeitos no Ambiente ................................. 13	
  
2.2.2 Biotratamento de Águas Residuárias e Resíduos Sólidos ................................................... 17	
  
2.2.3 Microrganismos aeróbios ...................................................................................................... 21	
  
2.2.4 Microrganismos anaeróbios .................................................................................................. 24	
  
2.2.5 Potencial microbiano ............................................................................................................. 28	
  
2.3 Bioremediação ......................................................................................................................... 30	
  
3 PERSPECTIVAS ............................................................................................................................ 32	
  
AULAS PRÁTICAS ........................................................................................................................... 35	
  
1- NORMAS DE SEGURANÇA NO LABORATÓRIO DE MICROBIOLOGIA ................................... 36	
  
2- MEIOS DE CULTURA, TÉCNICAS DE ISOLAMENTO E SEMEADURA BACTERIANA ............ 41	
  
3 COLORAÇÃO DE ZIEHL-NEELSEN ............................................................................................. 44	
  
3.1 COLORAÇÃO DE GRAM ........................................................................................................ 45	
  
4 CONTROLE DE MICRORGANISMOS .......................................................................................... 47	
  
5 DILUIÇÃO EM SÉRIE .................................................................................................................... 70	
  
6 ANÁLISE BACTERIOLÓGICA DA ÁGUA ...................................................................................... 72	
  
 6.1 COLIFORMES TOTAIS ........................................................................................................... 78	
  
7 COLIFORMES TERMOTOLERANTES ......................................................................................... 81	
  
 
 3 
1 INTRODUÇÃO À MICROBIOLOGIA 
Microbiologia: Mikros (= pequeno) + Bio (= vida) + logos (= ciência) 
A Microbiologia era definida, até recentemente, como a área da ciência que 
dedica-se ao estudo dos microrganismos, um vasto e diverso grupo de 
organismos unicelulares de dimensões reduzidas, que podem ser encontrados 
como células isoladas ou agrupados em diferentes arranjos (cadeias ou 
massas), sendo que as células, mesmo estando associadas, exibiriam um 
caráter fisiológico independente. 
Assim, com base neste conceito, a microbiologia envolve o estudo de 
organismos procariotos (bactérias, archaeas), eucariotos inferiores (algas, 
protozoários, fungos) e também os vírus. 
1.1 HISTÓRICO DA MICROBIOLOGIA 
Esta área do conhecimento teve seu início com os relatos de Robert Hooke e 
Antony van Leeuwenhoek, que desenvolveram microscópios que possibilitaram 
as primeiras observações de bactérias e outros microrganismos, além de 
diversos espécimes biológicos. 
Embora van Leeuwenhoek seja considerado o "pai" da microbiologia, os relatos 
de Hooke, descrevendo a estrutura de um bolor, foram publicados 
anteriormente aos de Leeuwenhoek. 
Em 1684, na Holanda, Antony Van Lewenhack construiu microscópios que 
podiam aumentar 300X e começou a ver pequenos animais E ao fazer 
desenhos dos mesmos, concluiu que existem seres invisíveis, mas não 
conseguiu provar a origem deles. 
Já Pasteur concluiu que os microorganismos surgem de células pré-existentes 
propondo a teoria de biogênese que diz que enquanto não cair o primeiro 
microorganismo não tem multiplicação. 
Os ensinamentos de Pasteur dizem que: 
• O ar é contaminado 
 4 
• Tudo que está exposto ao ar está contaminado 
• Os microorganismos contaminados causam alterações nos alimentos 
(fermentação) 
• O calor pode matar os microorganismos presentes nos alimentos 
Descobriu então que os microorganismos poderiam ser eliminados com a 
pasteurização (ferver e resfriar). 
Outras descobertas importantes de Pasteur foram a pasteurização, a 
fermentação e a descoberta de vacinas para cólera aviária e raiva. 
Em 1857, Robert Kock descobriu a cultura e deixou como postulados: 
•Os microorganismos devem estar presentes em todos os casos de 
doenças. 
•Os microorganismos devem ser isolados em cultura pura no laboratório. 
•Os mesmos sintomas devem surgir se o microorganismo for inoculado em 
um hospedeiro saudável e susceptível. 
•O mesmo microorganismo deve ser re-isolado do hospedeiro inoculado. 
Josephlister percebeu que 50% dos seus pacientes amputados morriam de 
infecção pós-operatória então em 1865, após os experimentos de Pasteur 
passou a usar ácido carbólico surgindo o primeiro centro cirúrgico asséptico. 
Semmelweis instituiu a lavagem das mãos com uma substancia clorada antes 
de qualquer procedimento obstétrico reduzindo o índice de febre puerperal e de 
mortalidade de 12% para 1,3%. 
 
1.2 A MICROBIOLOGIA NA ATUALIDADE 
A definição clássica de "microbiologia" mostra-se bastante imprecisa, e até 
mesmo inadequada, frente aos dados da literatura publicados nesta última 
década. Como exemplo pode-se citar duas premissas que já não podem mais 
ser consideradas como verdade absoluta na conceituação desta área de 
conhecimento: as dimensões dos microrganismos e a natureza independente 
destes seres. 
Em 1985 foi descoberto um organismo, denominado Epulopiscium 
fischelsoni que, a partir de 1991, foi definido como sendo o maior procarioto já 
descrito, exibindo cerca de 500 µm de comprimento. Esta bactéria foi isolada 
do intestino de um peixe marinho (Surgeonfish, peixe barbeiro ou cirurgião), 
 5 
encontrado nas águas da Austrália e do Mar Vermelho. Além de apresentar 
dimensões nunca vistas, tal bactéria mostra-se totalmente diferente das demais 
quanto ao processo de divisão celular, que ao invés de ser por fissão binária, 
envolve um provável tipo de reprodução vivíparo, levando à formação de 
pequenos“glóbulos”, que correspondem às células filhas. 
Mais recentemente, em 1999, outro relato descreve o isolamento de uma 
bactéria ainda maior, isolada na costa da Namíbia. Esta, denominada 
Thiomargarita namibiensis, pode ser visualizada a olho nú, atingindo até cerca 
de 0,8 mm de comprimento e 0,1 a 0,3 mm de largura. 
 
1.3 A UBIQUIDADE DOS MICROORGANISMOS 
Os microrganismos são os menores seres vivos existentes, encontrando-se em 
uma vasta diversidade de ambientes e desempenhando importantes papéis na 
natureza. Este grupo caracteriza-se por ser completamente heterogêneo, tendo 
com única característica comum o pequeno tamanho dos organismos. 
Acredita-se que cerca de metade da biomassa do planeta seja constituída 
pelos microrganismos, sendo os 50% restantes distribuídos entre plantas (35%) 
e animais (15%). 
Em termos de habitat, os microrganismos são encontrados em quase todos os 
ambientes, tanto na superfície, como no mar e subsolo. Desta forma, podemos 
isolar microrganismos de fontes termais, com temperaturas atingindo até 130°C 
(clique aqui para ler o relato do isolamento de um procarioto cujo máximo de 
temperatura de crescimento foi definido como 130°C); de regiões polares, com 
temperaturas inferiores a -10°C; de ambientes extremamente ácidos (pH=1) ou 
básicos (pH=13). Alguns sobrevivem em ambientes extremamente pobres em 
nutrientes, assemelhando-se à água destilada. Há ainda aqueles encontrados 
no interior de rochas na Antártida. 
Em termos metabólicos, temos também os mais variados tipos, desde aqueles 
com vias metabólicas semelhantes a de eucariotos superiores, até outros que 
 6 
são capazes de produzir ácido sulfúrico, ou aqueles capazes de degradar 
compostos pouco usuais como cânfora, herbicidas, petróleo, etc. 
Uma vez que os microrganismos precederam o homem em bilhões de anos, 
pode-se dizer que nós evoluímos em seu mundo e eles em nosso. Desta 
forma, não é de se estranhar que a associação homem-microrganismo mostra-
se com grande complexidade, com os microrganismos habitando nosso 
organismo, em locais tais como a pele, intestinos, cavidade oral, nariz, ouvidos 
e trato genitourinário. Embora a grande maioria destes microrganismos não 
causem qualquer dano, compondo a denominada “microbiota normal”, algumas 
vezes estes podem originar uma série de doenças, com maior ou menor 
gravidade. Nesta classe de organismos estão aqueles denominados 
patogênicos e potencialmente patogênicos. 
Sabe-se que em cerca de 1013 células de um ser humano podem ser 
encontradas, em média, cerca de 1014 células bacterianas. No homem, estas 
se encontram em várias superfícies, especialmente na cavidade oral e trato 
intestinal. 
 
1.4 PRINCIPAIS FUNÇÕES DOS MICROORGANISMOS NA NATUREZA 
Além de seu importante papel como componentes da microbiota residente de 
animais e plantas, em nosso dia a dia convivemos com os mais diversos 
produtos microbiológicos “naturais” tais como: vinho, cerveja, queijo, picles, 
vinagre, antibióticos, pães, etc. Paralelamente, não pode ser deixada de lado a 
importância dos processos biotecnológicos, envolvendo engenharia genética, 
que permitem a “criação” de novos microrganismos, com as mais diversas 
capacidades metabólicas. 
Os microrganismos desempenham também um importante papel nos 
processos geoquímicos, tais como o ciclo do carbono e do nitrogênio, sendo 
genericamente importantes nos processos de decomposição de substratos e 
sua reciclagem. Dentre os compostos utilizados como substrato temos, alguns 
de grande importância atualmente: DDT, outros pesticidas, cânfora, etc. 
 7 
O carbono encontra-se na atmosfera primariamente como CO2, sendo utilizado 
pelos organismos fotossintetizantes, para sua nutrição. Virtualmente, a energia 
para o desenvolvimento da vida na Terra é derivada, em última análise, a partir 
da luz solar. Esta é captada pelas plantas e microrganismos fotossintetizantes 
(algas e bactérias), que convertem o CO2 em compostos orgânicos, através da 
reação: 
CO2 + H2O à (CH2O)n + O2 (Equação 1) 
Os herbívoros alimentam-se de plantas e os carnívoros alimentam-se dos 
herbívoros. 
O CO2 atmosférico torna-se disponível para a utilização na fotossíntese origina-
se de duas fontes biológicas principais: 
1) 5 a 10% a partir de processos de respiração e; 
2) 90 a 95% oriundos da degradação (decomposição ou mineralização) 
microbiana de compostos orgânicos. 
Em termos de ciclo global, há um balanço entre o consumo de CO2 na 
fotossíntese e sua produção através da mineralização e respiração. Este 
balanço, no entanto, vem sendo fortemente alterado por atividades humanas, 
tais como a queima de combustíveis fósseis, promovendo um aumento da 
quantidade de CO2 atmosférico, resultando no conhecido “efeito estufa”. 
A celulose existente nas plantas, embora seja um substrato extremamente 
abundante na Terra, não é utilizável pela vasta maioria dos animais. Por outro 
lado, vários microrganismos, incluindo fungos, bactérias e protozoários a 
utilizam, como fonte de carbono e energia. Destes microrganismos, muitos 
encontram-se no trato intestinal de vários herbívoros e nos cupins. 
Muitos compostos tóxicos podem ser degradados por microrganismos, dentre 
eles, policlorados, DDT, pesticidas. 
Outra abordagem que tem se mostrado de grande valia para o homem refere-
se à introdução de genes bacterianos em outros organismos (ditos 
 8 
transgênicos), tais como plantas. Assim, está em franco desenvolvimento a 
obtenção de plantas transgênicas resistentes a pesticidas ou ao ataque de 
insetos. 
 
1.5 MICROORGANISMOS COMO AGENTES DE DOENÇAS 
Os microrganismos, eventualmente provocam doenças no homem, outros 
animais e plantas. Apesar dos enormes avanços em relação ao tratamento de 
doenças infecciosas, estas vêm se tornando novamente um tema preocupante, 
em virtude do crescente surgimento de linhagens bacterianas cada vez mais 
resistentes às drogas. Atualmente, a Organização Mundial da Saúde vem 
demonstrando crescente interesse nas doenças emergentes e re-emergentes, 
de origem infecciosa. 
Abaixo apresentamos um quadro cronológico que deixa clara tais 
preocupações, em relação ao número de mortes provocadas por doenças 
infecciosas. 
 
(Adaptado do livro Brock Biology of Microorganisms, 10 Ed., 2003) 
 
1.6 IMPORTÂNCIA DA MICROBIOLOGIA 
É uma área da Biologia que tem grande importância seja como ciência básica 
ou aplicada. 
 9 
Básica: estudos fisiológicos, bioquímicos e moleculares (modelo comparativo 
para seres superiores). 
àMicrobiologia Molecular Aplicada: processos industriais, controle de doenças, 
de pragas, produção de alimentos, etc. 
Áreas de estudo: 
Odontologia: Estudo de microrganismos associados à placa dental, cárie 
dental e doenças periodontais. Estudos com abordagem preventiva. 
Medicina e Enfermagem: - Doenças infecciosas e infecções hospitalares. 
Nutrição: - Doenças transmitidas por alimentos, Controle de qualidade de 
alimentos, Produção de alimentos (queijos, bebidas). 
Biologia: - Aspectos básicos e biotecnológicos. Produção de antibióticos, 
hormônios (insulina, GH), enzimas (lipases, celulases), insumos (ácidos, 
álcool), Despoluição (Herbicidas - Pseudomonas, Petróleo), Bio-filme 
(Acinetobacter), etc. 
BIOTECNOLOGIA - Uso de microrganismos com finalidades industriais, como 
agentes de biodegradação, de limpeza ambiental, etc. 
 10 
2 CLASSIFICAÇÃO DOS MICRORGANISMOS DE ACORDO COM SUA 
RELAÇÃO COM OXIGÊNIO 
Os microrganismos podem crescer na presença ou ausência de oxigênio e, 
neste aspecto, podem ser classificados em: 
Aeróbios: são os microrganismos que normalmente requerem oxigênio para 
crescer. 
Facultativos: sãoos microrganismos que crescem na presença de oxigênio ou 
na ausência dele (anaerobiose). 
Anaeróbios: são os microrganismos que ou crescem na presença de baixas 
concentrações de oxigênio, os chamados de anaeróbios facultativos, ou 
morrem quando estão na presença deste gás; estes são os chamados de 
anaeróbios estritos. 
Microaerófilos: são organismos aeróbios, porém somente crescem em 
concentrações de oxigênio menores que a do ar (entre 1% e 15%). 
2.1 CLASSIFICAÇÃO DOS MICRORGANISMOS DE ACORDO COM SUA 
DIVERSIDADE METABÓLICA 
Os microrganismos necessitam de uma fonte de carbono (gás carbônico (CO2) 
ou carbono orgânico) e de uma fonte de energia (luz ou energia derivada da 
oxidação de compostos orgânicos ou inorgânicos). Os microrganismos que 
usam a luz como fonte de energia podem ser: 
Fotoautotróficos: são organismos que usam a luz como fonte de energia e o 
carbono inorgânico (CO2) como fonte de carbono. São representados pelas 
bactérias fotossintetizantes (cianobactérias), bactérias sulfurosas púrpura 
(exemplo: Chromatium) e bactérias sulfurosas verdes (exemplo: Chlorobium), 
algas e plantas verdes. Existem cerca de 60 espécies de bactérias 
fotoautotróficas. 
Fotoheterotróficos: usam luz como fonte de energia e compostos orgânicos 
(álcool, carboidratos, ácidos orgânicos, etc.) como fonte de carbono. São as 
 11 
bactérias verdes não sulfurosas (exemplo: Chloroflexus) e as bactérias 
púrpuras não sulfurosas (exemplo: Rhodopseudomonas ). 
Os microrganismos que obtêm energia através da oxidação de compostos 
orgânicos ou inorgânicos podem ser classificados em: 
Quimioautotróficos: usam os compostos químicos (gás sulfídrico (H2S), 
enxofre elementar (S), amônia (NH3), gás hidrogênio (H2), nitrato (NO3-), nitrito 
(NO2-) e ferro (Fe2+) como fonte de energia e usam o CO2 como fonte de 
carbono. 
Quimioheterotróficos: são organismos que usam compostos orgânicos como 
fonte de energia e de carbono. Este grupo inclui a maioria das bactérias, 
fungos e protozoários. 
2.2 MICROBIOLOGIA E SANEAMENTO AMBIENTAL 
Texto: Rosana Filomena Vazoller, USP 
A utilização de microrganismos no saneamento básico e ambiental é prática comum 
desde os primórdios do desenvolvimento dos processos biológicos de tratamento de 
águas residuárias e resíduos sólidos. É evidente, que a capacidade microbiana de 
catabolizar diferentes compostos orgânicos, naturais ou sintéticos, e inorgânicos, 
extraindo desses compostos fontes nutricionais e energéticas, é o que possibilitou o 
emprego desses agentes biológicos, pela engenharia sanitária, como solução aos 
problemas gerados pelos rejeitos lançados no meio ambiente. 
A habilidade notável de degradação de compostos por microrganismos é 
consequência da evolução dos sistemas enzimáticos de células procariotas e 
eucariotas, as quais vêm coexistindo, durante bilhões de anos, com uma enorme 
variedade de substâncias naturais de diferentes origens. Esta diversidade de 
substratos potenciais ao crescimento microbiano resultou, então, no aparecimento de 
enzimas aptas a transformar moléculas orgânicas com estruturas bastante distintas. 
Os "arsenais" enzimáticos microbianos têm sido também capazes de atuar sobre 
substâncias químicas sintéticas, oriundas das atividades antropogênicas. Esta 
resposta do metabolismo de certos microrganismos, sem dúvida, confere algumas 
vantagens adicionais às células microbianas, tais como a exploração de novos 
nichos ecológicos e fontes energéticas. 
 12 
O desenvolvimento do saneamento ambiental é consequência direta das atividades 
de produção do Homem em seu meio. O aumento das necessidades e anseios da 
sociedade moderna industrializada, reflete-se no aumento de materiais descartados 
sob forma de esgotos e lixo. Portanto, soluções para os efeitos do acúmulo de 
materiais indesejáveis são prementes e devem ser duradouras. 
O tratamento de águas residuárias e resíduos sólidos pela ação de microrganismos 
resulta na estabilização dos compostos orgânicos poluentes, e emprega reatores 
(bioreatores) com diferentes configurações, constituindo verdadeiros ecossistemas 
microbianos. O principal produto dos processos biológicos de tratamento de rejeitos 
é a despoluição ambiental. Assim, pode-se denominar por Biotecnologia Ambiental, 
os métodos da engenharia sanitária que utilizam microrganismos, ou que conduzam 
ao desenvolvimento dos microrganismos em um meio, cuja a finalidade é a obtenção 
de um produto que propicie benefícios ao Homem em seu ambiente. 
A Biotecnologia no saneamento ambiental corresponde às aplicações da tecnologia 
sanitária apropriadas para a otimização da qualidade ambiental, especificamente em 
relação aos recursos hídricos, solos e ar. Atualmente, as soluções para os problemas 
ambientais podem ser encontradas além do vantajoso uso dos bioreatores, como é o 
caso da aplicação in situ de microrganismos especializados na degradação e/ou 
transformação de substâncias químicas sintéticas tóxicas encontradas nos solos pela 
disposição de materiais poluentes, ou em aquíferos contaminados pela percolação 
de poluentes. Esta prática é denominada Bioremediação. O aprimoramento das 
tecnologias existentes ou o aparecimento de novos processos para a manutenção da 
qualidade ambiental devem estar de acordo com um dos princípios formulados pela 
The World Comission on Environment and Development (Brundtland Comission, 
Declaração de Tóquio), segundo ZEHNDER (1992). 
 
 
Princípio sobre a "Conservação e otimização dos recursos naturais", formulado durante a The 
world Comission on Environment and Development (Brundtland Comission, Declaração de 
Tóquio), ZEHNDER (1992). 
 13 
 
A Biotecnologia Ambiental se insere com sucesso, portanto, no passado, 
presente e futuro da preservação, recuperação e utilização racional dos 
recursos naturais. Este capítulo abordará a microbiologia no saneamento 
ambiental, particularmente no uso de tecnologias de reatores e sistemas em 
que o objetivo final é a preservação e recuperação de ecossistemas aquáticos 
e terrestres. 
Os exemplos serão restritos às tecnologias de tratamento de águas 
residuárias e resíduos sólidos, divididas em duas categorias, segundo a 
definição de GRIFFITHS (1992): 
-Biotratamento, em que os poluentes são tratados em bioreatores, 
geralmente instalados junto às fontes de emissão; 
- Bioremediação, é a recuperação pelo tratamento in situ de ambientes 
danificados pela disposição de enormes quantidades de materiais 
poluentes tóxicos; pode ser necessário o uso de bioreatores. 
 
2.2.1 Problemática do Lançamento e Disposição de Rejeitos no Ambiente 
 
Os ecossistemas aquáticos possuem funções ambientais de indiscutível valor. 
Neles, os nutrientes são reciclados, a água é purificada, as enchentes são 
atenuadas, os fluxos das águas são conservados e ampliados, os lençóis 
freáticos são recarregados, e sobretudo, constituem fonte de abastecimento 
de água para a vida vegetal, animal e humana. 
Porém, o rápido aumento populacional em diversas partes do mundo, em 
conjunto com o intenso desenvolvimento industrial, comercial e residencial, 
resultaram na poluição dos recursos hídricos superficiais e subterrâneos por 
fertilizantes, pesticidas, inseticidas, óleos, percolados tóxicos de aterros 
Sustentabilidade requer a conservação dos recursos ambientais, tais como 
manutenção da qualidade dos recursos hídricos, dos solos, do ar e das 
florestas; conservação da diversidade genética; e utilização eficiente de 
energia, água e materiais naturais. Aperfeiçoamento da eficiência dos 
mecanismos de produção, afim de reduzir o consumo per capita dos 
recursos naturais e estimular a mudança de tecnologias e de produção de 
materiaisde consumo não-poluentes. Todos os países são conclamados a 
prevenir a poluição ambiental através do cumprimento de leis de proteção 
ambientais, promover tecnologias com baixa geração de resíduos, e prever o 
impacto de novos produtos, tecnologias e resíduos. 
 14 
sanitários (local de disposição controlada de resíduos sólidos), enfim, uma 
enorme variedade de efluentes industriais e os sanitários. O agravamento da 
situação pelo uso indiscriminado dos sistemas hídricos verificou-se ainda, 
pelo aumento da demanda do consumo de água, que em último caso, 
provoca a redução do fluxo de água disponível no meio ambiente para a 
diluição dos despejos (Committee on Restoration of Aquatic Ecosystems - 
EUA, 1992). 
Em 1992, GRIFFITHS indicou que apenas 10% do total mundial de águas 
residuárias estão sujeitas a algum tipo de tratamento. O residual de 90% 
permanece no meio suscetível a auto-purificação nos sistemas aquáticos. 
Em termos quantitativos, como abordado por Glazer e Nikaido (1995),10% de 
todas as bacias continentais no mundo suprem as necessidades de uso da 
água. Deste valor, são consumidos 70% na irrigação agrícola, 20% nos 
processos industriais, e o restante pelas atividades domésticas e de 
agropecuária, entre outras. 
No Brasil, a maioria dos ecossistemas aquáticos recebe toda a espécie de 
impactos oriundos da atividade humana, sendo prováveis exceções algumas 
áreas da bacia amazônica e corpos d'água situados em localidades bastante 
isoladas. O Brasil possue uma ampla rede hidrográfica em relação ao mundo, 
e 51% dos sistemas existentes para a captação de águas de abastecimento 
estão localizados em rios, nos quais são lançados cerca de 92% dos esgotos 
gerados nas regiões (TUNDIS; BARBOSA, 1995). 
As interferências geradas nos sistemas aquáticos são, portanto, de diferentes 
origens, e aquelas resultantes do lançamento de efluentes industriais e 
sanitários são de difícil controle, principalmente devido a diversidade e 
quantidade das fontes de emissão. 
Os solos também sofrem alterações pelo despejo de poluentes nos sistemas 
aquáticos, e pela disposição superficial de resíduos, tais como compostos 
químicos tóxicos e lixos oriundos das atividades agrícolas e industriais. 
 
 
 
 
 15 
Atividades antrópicas e suas consequências nos ecossistemas aquáticos brasileiros. 
ATIVIDADES ANTRÓPICAS CONSEQUÊNCIAS DAS ATIVIDADES 
Irrigação Eutrofização de lagos, rios, reservatórios, 
estuários e águas costeiras 
Lançamento de efluentes industriais Alteração no nível das águas e no ciclo 
hidrológico 
Lançamento de esgotos sanitários Alteração nas cadeias alimentares existentes 
Produção e disposição de resíduos 
agrícolas 
Toxicidade nos sistemas aquáticos 
Produção e disposição de resíduos 
sólidos (urbanos, hospitalares, etc.) 
Aumento nos custos dos sistemas de 
tratamento de águas de abastecimento 
Desflorestamento Veiculação de doenças, com consequências 
prejudiciais a saúde pública 
Mineração Perda da biodiversidade 
Construção de rodovias Impedimento dos múltiplos usos da água 
Remoção de espécies nativas 
importantes 
Mudanças na qualidade de vida 
Uma das fontes de poluição mais agressiva às águas subterrâneas, e 
consequentemente aos aquíferos, é aquela produzida pela percolação de 
resíduos colocados em solos permeáveis, que não dispõem de nenhum 
método artificial de proteção das camadas superficiais da terra que o 
constituem. São exemplos de fontes de poluição dos lençóis freáticos, 
líquidos gerados pela degradação e/ou percolação de resíduos sólidos 
industriais ou urbanos, inadequadamente dispostos em áreas permeáveis, e 
por vazamentos de dutos de condução de petróleo. 
Os resíduos mais comuns são os sanitários e os produzidos pela atividade 
agro-pecuária, e são constituídos, em sua maioria, por matéria de origem 
orgânica. Um número significante de compostos sintéticos, ou xenobióticos, 
muitos dos quais são pesticidas, solventes orgânicos, e compostos 
poliaromáticos e halogenados, tais como as dioxinas, também compõem a 
gama de poluentes orgânicos que persistem e acumulam no ambiente. 
Além disso, um importante número de poluentes inorgânicos pode ocasionar 
efeitos prejudiciais ao meio ambiente, como é o caso de várias formas de 
nitrogênio, fósforo e metais pesados. Particularmente, a eutrofização dos 
 16 
sistemas aquáticos é ocasionada pela liberação de nitratos e fosfatos, 
nutrientes que suportam o florescimento de uma enorme massa celular de 
algas no corpo d'água receptor. 
Fontes de poluição por compostos antropogênicos aromáticos tóxicos. 
COMPOSTOS AROMÁTICOS FONTES INDUSTRIAIS 
BTEX combustíveis fósseis, solventes, 
estireno plásticos 
PAH combustíveis fósseis, preservantes de madeiras 
alquilfenóis sulfactantes, detergentes 
sulfo aromáticos sulfactantes, detergentes, despolpamento com 
sulfito, corantes 
amino aromáticos pesticidas, corantes, pigmentos, fármacos 
azo aromáticos corantes 
nitroaromáticos explosivos, fármacos, pesticidas, corantes 
clorofenóis e dioxinas preservantes de madeiras, pesticidas, efluentes de 
branqueamento de polpa 
hidrocarbonetos 
cloroaromáticos e PCB 
pesticidas, solventes, fluidos hidraúlicos e dieletricos 
BTEX=benzeno, tolueno, etilbenzeno e xileno; PAH= hidrocarbonetos aromáticos policíclicos; 
PCB= bifenilas policloradas. 
As ações de prevenção, recuperação e manutenção dos ecossistemas devem 
priorizar as tecnologias que conduzam a purificação de áreas poluídas, com 
base na remoção da matéria orgânica facilmente degradável ou, pela 
eliminação de um poluente químico específico de difícil degradação. 
As possíveis soluções para os rejeitos lançados no meio ambiente podem 
abrigar diferentes processos biológicos, cujo objetivo é a biodegradação de 
compostos poluentes em compostos mais simples, em outras palavras, a 
mineralização completa de moléculas orgânicas. Alguns processos podem 
gerar ainda, produtos finais de valor energético, como é o caso do metano, ou 
de valor para a indústria de química fina, como é o caso do catecol, originado 
a partir da transformação biológica de fenóis (GRIFFITHS, 1992). 
 
 
 
 17 
2.2.2 Biotratamento de Águas Residuárias e Resíduos Sólidos 
 
O tratamento biológico ou biotratamento de águas residuárias e resíduos 
sólidos emprega a ação conjunta de espécies diferentes de microrganismos, 
em bioreatores, que operados sob determinadas condições resulta na 
estabilização da matéria orgânica poluente. 
Os sistemas biológicos de tratamento de resíduos deve atender alguns 
importantes aspectos : (1) - remoção da matéria orgânica, portanto redução 
da Demanda Bioquímica de Oxigênio do resíduo a ser tratado (ver Quadro 2); 
(2) - se possível, degradação de compostos químicos orgânicos de difícil 
degradação (recalcitrantes); (3) - fornecimento de um efluente em condições 
que não afete o equilíbrio do sistema receptor final (rios, lagos, etc.). 
O volume de informações existentes sobre os aspectos básicos dos 
processos de tratamento biológico de rejeitos, nos campos da engenharia e 
microbiologia, possibilita a adoção de diferentes tipos de reatores, com 
elevado desempenho e eficiência na redução da Demanda Bioquímica de 
Oxigênio. 
 Os processos biológicos de tratamento de rejeitos incorporam uma 
variedade de espécies microbianas e, portanto, uma versatilidade metabólica 
bastante grande. Por exemplo, alguns processos apresentam espécies 
bacterianas capazes de degradar compostos complexos e artificialmente 
sintetizados, ao mesmo tempo que outros, possuem bactérias que apenas 
degradam moléculas orgânicas simples,como o ácido acético, produzindo um 
poderoso combustível, o gás metano. 
A estação pode ser dividida em três seções: (1) - separação física do material 
que entra no sistema, separação mecânica; (2) - processos biológicos, 
aeróbio e anaeróbio, (3) - lançamento do efluente tratado. 
 
Definição de Demanda Bioquímica de Oxigênio (DBO), segundo Branco e Hess (1975) e 
Glazer e Nikaido (1995). 
A Demanda Bioquímica de Oxigênio, em termos práticos, é representada pela 
quantidade de oxigênio consumida pela unidade de volume de um resíduo, em 
determinadas condições, através da metabolização da matéria biodegradável 
por organismos vivos ou por suas enzimas. É, portanto, um parâmetro de 
medida, que determina através de um bioensaio, a quantidade de oxigênio 
dissolvido consumido por microrganismos aeróbios durante a metabolização 
da matéria orgânica biodegradável. 
 18 
 
 
Esquema genérico de uma estação de tratamento de esgotos sanitários, em que observam-
se os processos físicos de separação e biológicos de tratamento da água residuária (baseado 
em Glazer e Nikaido, 1995). 
 
O fluxo da água residuária na estação de tratamento é conduzido em etapas, 
como descrito a seguir: 
(1) [tratamento primário], remoção física de materiais grosseiros pela 
passagem através de grades, sedimentação rápida de partículas no tanque 
de areia e sedimentação mais lenta no decantador primário; 
(2) [tratamento secundário], biodegradação aeróbia no tanque de aeração, da 
matéria orgânica contida no sobrenadante originado no decantador primário 
(oxidação biológica por Lodos Ativados), e biodegradação anaeróbia no 
biodigestor anaeróbio das frações sólidas originadas nos decantadores 
primário e secundário (Biodigestão Anaeróbia); 
(3) [tratamento terciário], remoção de compostos inorgânicos e/ou 
microrganismos patógenos por processos físico-químicos, com a finalidade de 
produzir um efluente de qualidade adequada ao corpo d'água receptor. 
O tratamento secundário engloba a atuação dos microrganismos na remoção 
dos compostos orgânicos do meio, através dos metabolismos aeróbio nos 
processos por lodos ativados, e anaeróbio, nos processos de biodigestão 
anaeróbia. Os agentes biológicos mais importantes na degradação da matéria 
orgânica poluente são as bactérias, que se desenvolvem no sistema mediante 
 19 
condições controladas de operação dos reatores, bem como do tipo de água 
residuária a ser tratada. 
Valores de DBO para diferentes tipos de águas residuárias. 
Águas residuárias DBO (mg/L) 
Esgotos sanitários 200-600 
Efluente de enlatados - alimentos 500-2.000 
Efluente de cervejarias 500-2.000 
Efluente de processamento de óleo - comestível 15.000-20.000 
Efluente de destilaria de álcool (vinhaça) 15.000-20.000 
Percolado de aterros sanitários (chorume) 15.000-20.000 
Efluente de laticínios (sem recuperação de soro de leite) 30.000 
Efluente de matadouros (sem recuperação de resíduos) 30.000 
A composição da água residuária pode selecionar os grupos microbianos nos 
processos de tratamento, além da disponibilidade ou não de oxigênio no 
sistema. A constituição do esgoto sanitário, cujo os valores de DBO são 
menores, é cerca de 65% proteínas, 25% carboidratos, 10% lipídeos e o 
restante corresponde a frações inorgânicas como minerais e metais. 
stas características possibilitam o desenvolvimento de diferentes heterótrofos 
no meio, em sua maioria bactérias entéricas, o que é razoável frente ao nicho 
ecológico formado nos reatores empregados no tratamento de esgotos 
sanitários. 
Do mesmo modo, a presença de nitrogênio sob a forma amoniacal poderia 
facilitar o crescimento de bactérias nitrificantes, e o produto metabólico, o 
nitrato, certamente favoreceria o aparecimento de bactérias desnitrificantes. 
Os processos biológicos de tratamento estão intrinsicamente relacionados ao 
metabolismo microbiano que selecionam. Em outras palavras, os bioreatores 
que operam sob condições de aeração, possibilitam o desenvolvimento de 
microrganismos aeróbios, que através da respiração aeróbia oxidam as 
moléculas orgânicas [processos biológicos aeróbios de tratamento]. 
Nos bioreatores anaeróbios, por sua vez, são selecionados microrganismos 
capazes de crescer através do metabolismo fermentativo ou pela respiração 
anaeróbia [processos biológicos anaeróbios de tratamento]. 
 20 
Portanto, a oxidação dos compostos orgânicos pode ocorrer por diferentes 
vias do metabolismo microbiano, possibilitando o desenvolvimento de vários 
aspectos da engenharia dos bioreatores e resultando em variantes dos 
processos tradicionais aeróbios e anaeróbios. 
Alguns sistemas biológicos empregados no saneamento básico, bem como 
algumas de suas funções: 
Sistemas biológicos e funções específicas. 
Sistemas biológicos Funções 
Lagoas de estabilização Fornecimento natural de oxigênio pelo desenvolvimento 
de algas em lagoas construídas para a degradação 
microbiana de compostos orgânicos poluentes, e 
conversão a dióxido de carbono e água. 
Lodos Ativados, Filtros 
biológicos, Lagoas 
aeradas e Valos de 
oxidação 
Degradação microbiana de compostos orgânicos 
poluentes através do metabolismo aeróbio, facilitado pela 
disponibilidade artificial de oxigênio em reatores ou em 
lagoas, e conversão a dióxido de carbono e água. 
Sistemas de nitrificação Conversão de compostos orgânicos nitrogenados e 
amônia a nitratos 
Sistemas de 
desnitrificação 
Conversão de nitratos a nitrogênio gasoso 
Sistema alternado 
anóxico e aeróbio para 
remoção de nutrientes 
Remoção de nutrientes, particulamente de fosfatos 
Biodigestão anaeróbia Degradação microbiana de compostos orgânicos a ácidos 
orgânicos, álcoois, hidrogênio, dióxido de carbono e 
metano 
Fontes: Baseado em COOKSON Jr. (1995). 
Os sistemas biológicos de tratamento desenvolvidos são operados, portanto, 
sob condições aeróbias ou anaeróbias, dependendo da natureza dos resíduos 
orgânicos a serem degradados, da dimensão dos reatores, além de outros 
requerimentos específicos. Além disso, nos processos biológicos que ocorrem 
dentro dos sistemas é possível observar mais de um metabolismo microbiano 
 21 
ativo, como pode ser observado nos Lodos Ativados, pela existência da 
respiração aeróbia e nitrificação por diferentes espécies bacterianas. 
Em geral, os diferentes tipos microbianos nos processos biológicos de 
tratamento atuam conjuntamente, formando uma verdadeira cadeia alimentar 
com interações nutricionais facultativas e obrigatórias. Os microrganismos nos 
bioreatores podem ser encontrados livres, floculados, agregados ou formando 
biofilmes em materiais utilizados para enchimento de certos tipos de reatores, 
como por exemplo, os filtros biológicos aeróbios e anaeróbios. 
Atualmente, têm sido realizadas várias pesquisas para otimizar os processos 
biológicos na remoção de nutrientes dos esgotos sanitários, como nitrogênio e 
fósforo, bem como na destoxificação de poluentes industriais. 
Neste último caso, o uso de bioreatores com microrganismos selecionados e 
especializados na degradação de compostos halogenados vem se tornando 
realidade. 
A evolução tecnológica dos bioreatores resultou, principalmente, em soluções 
para as águas residuárias. Assim, o tratamento dos resíduos sólidos não 
dispõe de um grande número de opções em termos de reatores biológicos na 
estabilização da matéria orgânica. O sistema mais comum de disposição e 
tratamento de resíduos sólidos municipais é o aterro sanitário. 
O processo biológico predominante nos aterros é o anaeróbio, semelhante ao 
que ocorre nos biodigestores anaeróbios. Contudo, nas etapas iniciais dabiodegradação microbiana podem ser encontrados fungos e bactérias aeróbias 
bastante ativos, particularmente na degradação de materiais celulósicos. 
 
2.2.3 Microrganismos aeróbios 
 
O sistema biológico mais comumente utilizado como exemplo dos processos 
aeróbios é o conhecido por Lodos Ativados. No entanto, sua descrição 
microbiana é bastante semelhante para outros sistemas, como os filtros 
biológicos, as lagoas aeradas e os valos de oxidação. 
O processo aeróbio que se desenvolve nos sistemas de Lodos Ativados é 
usualmente empregado no tratamento secundário de esgotos sanitários. 
 
Microrganismos presentes nos Processos Aeróbios de Tratamento de Águas Residuárias por 
Lodos Ativados . 
 22 
 
A característica principal da massa celular produzida é a formação de 
aglomerados bacterianos, que possibilita a separação das células floculadas do 
meio líquido no tanque de aeração. Nas estações de tratamento a 
sedimentação do lodo floculado ocorre no decantador secundário. 
A floculação bacteriana é consequência direta da operação do bioreator, que 
promove condições de estresse nutricional, conduzindo a menor atividade de 
parte das células no sistema, ou induzindo o metabolismo endógeno celular. A 
baixa atividade das bactérias favorece a floculação no reator, bem como a 
auto-oxidação das células, o que em certo grau auxilia na diminuição da massa 
celular. 
As bactérias responsáveis pelo processo biológico e presentes no floco 
pertencem a diferentes gêneros, e em sua grande maioria são heterótrofas. 
Algumas espécies de bactérias filamentosas são também heterótrofas, 
removendo a matéria orgânica do meio, e outras são capazes de oxidar 
compostos reduzidos de enxofre, com formação intracelular de grânulos de 
enxofre elementar, como é o caso dos gêneros Thiothrix sp e Beggiatoa sp. 
Estas bactérias podem ser encontradas na estrutura dos flocos ou livres, e são 
em geral, os organismos responsáveis pela ocorrência de um dos graves 
problemas no tanque de aeração, o intumescimento do lodo. O crescimento em 
abundância das filamentosas, como efeito de algum desequilíbrio operacional 
do sistema, forma uma macroestrutura semelhante a uma rede, que interfere 
na sedimentação e compactação do floco bacteriano, além da competição com 
as demais espécies bacterianas pelo substrato orgânico. A existência de outros 
metabolismos bacterianos também pode ser exemplificada pelas espécies 
quimioautótrofas Nitrosomonas sp e Nitrobacter sp. A primeira oxida a amônia 
a nitrito, e a segunda, nitrito a nitrato. As atividades combinadas desses dois 
organismos efetuam a conversão completa da amônia a nitrato nos processos 
aeróbios. 
Bactérias heterótrofas, quimioautótrofas, protozoários e micrometazoários. 
Dentre os tipos bacterianos, destacam-se as bactérias filamentosas. 
Os microrganismos aeróbios [lodos ativados] no sistema de lodos ativados 
promovem a seguinte reação : 
Matéria orgânica + O2 + Nutrientes ( CO2 + NH3 + Células + outros produtos) 
 23 
Nos tanques de aeração são encontrados protozoários e micrometazoários, 
indicados como clarificadores do meio. As bactérias constituem a base 
nutricional dos protozoários, e estes, em conjunto com as próprias bactérias, 
são consumidos pelos micrometazoários. 
Os tipos microbianos dos Lodos Ativados são encontrados naturalmente nos 
ecossistemas aquáticos, e se estabelecem no bioreator através das condições 
de operação, como características e quantidade da matéria orgânica presente 
na água residuária, agitação, disponibilidade de oxigênio dissolvido e 
interações microbianas. 
No início do processo, pode-se observar a presença de amebas e flagelados, 
posteriormente substituídos por protozoários holozóicos, como por exemplo, os 
ciliados livre-natantes. O clímax do sistema atinge quando se observa a 
presença de ciliados sésseis, e micrometazoários, como os rotíferos e 
nematóides. O emprego prático da avaliação dos tipos de protozoários e 
micrometazoários presentes no bioreator é de extremo valor, uma vez que 
análises microscópicas bastante simples podem indicar as condições de 
operação do sistema. 
Os fungos não são comuns ao sistema de Lodos Ativados, mas quando 
presentes pertencem ao grupo dos Deuteromicetos (fungos imperfeitos). No 
entanto, podem predominar quando o tratamento de águas residuárias de 
origem industrial resulta em acentuada queda de pH no meio, ou limita a 
disponibilidade de fontes nitrogenadas. 
 
Heterótrofas: Pseudomonas sp, Zooglea ramigera, Achromobacter sp, 
Flavobacterium sp, Bdellovibrio sp, Mycobacterium sp, Alcaligenes sp, 
Arthrobacter sp e Citromonas sp. 
Filamentosas: Sphaerotillus natans, Beggiatoa sp, Thiothrix, Leucothrix sp, 
Microthrix parvicella, Nocardia sp, Nostocoida limicola, Haliscomenobacter 
hydrossis, Flexibacter sp e Geotrichum sp. 
Nitrificantes: Nitrosomonas sp e Nitrobacter sp. 
 
Filo Protozoa Exemplos 
Classe SarcodinaAmebas - Arcella discoides, Amoeba sp 
Classe Ciliata Ciliados livre-natantes e sésseis - Aspidisca costata, 
Trachelophyllum sp, Paramecium sp, Didinium sp, Chilodenella sp 
 24 
Classe MastigophoraFlagelados - Spiromonas sp, Bodo sp, Euglena sp, Monas 
sp, Cercobodo sp 
 
2.2.4 Microrganismos anaeróbios 
 
Nos processos anaeróbios ou, nos sistemas de biodigestão anaeróbia, a 
degradação da matéria orgânica envolve a atuação de microrganismos 
procarióticos anaeróbios facultativos e obrigatórios, cujas espécies pertencem 
ao grupo de bactérias hidrolíticas-fermentativas, acetogênicas produtoras de 
hidrogênio e metanogênicas. A bioconversão da matéria orgânica poluente com 
produção de metano requer a cooperação entre culturas bacterianas. Na 
atividade microbiana anaeróbia em biodigestores, como também em habitats 
naturais com formação de metano (sedimentos aquáticos, sistema 
gastrointestinal de animais superiores, pântanos, etc.), o que se observa é a 
ocorrência da oxidação de compostos complexos, resultando nos precursores 
do metano, acetato e hidrogênio. 
 
Esquema que representa o fluxo de carbono durante a decomposição anaeróbia da matéria 
orgânica complexa a metano. 
 
A natureza da gênese do metano em etapas, a partir de compostos orgânicos 
complexos, mostra a importância das interações microbianas que buscam 
evitar o acúmulo de ácidos orgânicos e álcoois no meio em fermentação. São 
vários os tipos de bactérias que participam no processo: 
 
 25 
Exemplos de espécies de bactérias anaeróbias presentes nos tratamentos de rejeitos por 
biodigestão anaeróbia. FONTE: in ZEHNDER (1988). 
 
Os organismos da biodigestão anaeróbia apresentam um elevado grau de 
especialização metabólica. A eficiência do processo anaeróbio depende, 
portanto, das interações positivas entre as diversas espécies bacterianas, com 
diferentes capacidades degradativas. Os intermediários metabólicos de um 
grupo de bactérias podem servir como nutrientes ao crescimento de outras 
espécies. Assim, observa-se a ocorrência de várias reações de degradação 
dos compostos orgânicos e a dependência das mesmas da presença do 
hidrogênio formado no sistema. 
Os organismos da biodigestão anaeróbia apresentam um elevado grau de 
especialização metabólica. A eficiência do processo anaeróbio depende, 
portanto, das interações positivas entre as diversas espécies bacterianas, com 
diferentes capacidades degradativas. Os intermediários metabólicos de um 
grupo de bactérias podem servir como nutrientes ao crescimento de outras 
espécies. Assim, observa-se a ocorrência de várias reações de degradação 
dos compostos orgânicos e a dependência das mesmas da presença do 
hidrogênio formado no sistema. 
Exemplosde reações que ocorrem nos biodigestores anaeróbios, e as energias livres destas 
reações sob condições padrão de ocorrência e nos biodigestores. 
 
Etapas da biodigestão anaeróbiaEspécies bacterianas 
Hidrólise e acidogênese.......Clostrídios, Acetivibrio cellulolyticus, Bacteroides 
succinogenes, Butyrivibrio fibrisolvens, Eubacterium cellulosolvens, Bacillus sp, 
Selenomonas sp, Megasphaera sp, Lachnospira multiparus, Peptococcus 
anaerobicus, Bifidobacterium sp, Staphylococcus sp 
Acetogênese......Syntrophomonas wolinii, S. wolfei, Syntrophus buswellii, 
Clostridium bryantii, Acetobacterium woddii, várias espécies de bactérias 
redutoras do íon sulfato - Desulfovibrio sp, Desulfotomaculum sp 
Metanogênese acetoclástica......Methanosarcina sp e Methanothrix sp 
Metanogênese hidrogenotrófica......Methanobacterium sp, Methanobrevibacter sp, 
Methanospirillum sp 
 26 
Reações (G0)(kcal/reação) (G1)(kcal/reação) 
1. Conversão da glicose em metano e dióxido de 
carbono C6H1206 + 3H2O ( 3CH4 + 3HCO3- + 3H+ 
-96,5 -95,3 
2. Conversão da glicose em acetato e hidrogênio 
C6H1206 + 4 H2O( 2CH3COO- + 2 HCO3- + 4H+ + 4H2 
-49,3 -76,1 
3. Metanogênese do acetato CH3COO- + H2O( CH4 + 
HCO3- 
-7,4 -5,9 
4. Metanogênese do hidrogênio e dióxido de carbono 
4H2 + HCO3- + H+ (CH4 + 3H2O 
-32,4 -7,6 
5. Acetogênese do hidrogênio e dióxido de carbono 
4H2 + 2HCO3- + H+ ( CH3COO- + 4H2O 
-25,0 -1,7 
6. Oxidação de aminoácido Leucina + 3H2O ( 
isovalerato + HCO3- + NH4+ + 2H2 
+1,0 -14,2 
7. Oxidação do butirato a acetato CH3CH2CH2COO- + 
2H2O (2CH3COO- + H+ + 2H2 
+11,5 -4,2 
8. Oxidação dopropionato a acetato CH3 CH2COO- + 
3H2O - ( CH3COO- + HCO3- + H++ 3H2 
+18,2 -1,3 
9. Oxidação do benzoato a acetato C7 H5 O2- + 7H2O ( 
3CH3COO- + HCO3- + 3H+ + 3H2 
+21,4 -3,8 
10. Desalogenação redutiva H2 + CH3 Cl ( CH4 + H++ 
Cl- ) 
-39,1 -29,0 
 
A remoção do hidrogênio nos sistemas anaeróbios é feita pela ação de 
bactérias anaeróbias hidrogenotróficas, representadas por espécies de 
metanobactérias e de redutoras do íon sulfato. A cooperação entre as bactérias 
produtoras e consumidoras de hidrogênio, sob condições anaeróbias, é 
denominada "transferência de hidrogênio entre espécies". 
Os dados das variações de energia livre das reações e associados à oxidação 
anaeróbia da glicose, ácidos orgânicos, aminoácidos e benzoato pelas 
bactérias fermentativas e acetogênicas produtoras de hidrogênio, indicam a 
necessidade de baixas pressões parciais de hidrogênio no sistema. 
Na prática, contudo, a natureza dos substratos orgânicos presentes nos 
resíduos em um biodigestor é raramente tão bem definida ou, tão simples como 
a glicose. Além disso, os reatores anaeróbios podem receber cargas orgânicas 
variáveis, e portanto, quase sempre, os ácidos orgânicos estão presentes. 
Os sistemas de biodigestão anaeróbia foram inicialmente adotados na 
estabilização da fração sólida dos esgotos sanitários e de resíduos agrícolas. 
 27 
Esta escolha deveu-se às baixas velocidades de degradação inerentes ao 
metabolismo anaeróbio (fermentação e respiração anaeróbia). 
Por sua vez, os processos aeróbios sempre foram adequados para o 
tratamento de resíduos líquidos com concentrações baixas de matéria 
orgânica, devido a demanda artificial de oxigênio. Assim, surgiu a necessidade 
de sistemas que suportassem concentrações elevadas de matéria orgânica 
poluente, e boas velocidades na biodegradação. 
A concepção dos reatores anaeróbios avançados iniciou como uma resposta à 
necessidade de tratamento das águas residuárias com elevada Demanda 
Bioquímica de Oxigênio. Na Europa, durante o início dos anos 80, a 
biodigestão anaeróbia tornou-se então atraente, pois possibilitou o tratamento 
de diferentes tipos de águas residuárias de origem industrial. 
Particularmente no Brasil, as pesquisas realizadas com bioreatores como os 
filtros anaeróbios e o reator anaeróbio de fluxo ascendente e manta de lodo, 
permitiram a adoção com sucesso desses sistemas não somente para as 
águas residuárias de origem industrial, como para os esgotos sanitários . 
O elevado desempenho dos biodigestores anaeróbios modernos, denominados 
avançados ou não-convencionais, é consequência da organização eficiente dos 
microrganismos anaeróbios e sua retenção no reator. Os microrganismos 
fisicamente organizados em aglomerados bacterianos, grânulos biológicos, ou 
em biofilmes, ficam facilmente retidos dentro do sistema. 
A presença de um material que suporte a adesão dos microrganismos não é 
obrigatória em alguns reatores, como no caso do lodo granulado dos reatores 
de fluxo ascendente e manta de lodo 
A utilização dos processos anaeróbios para o tratamento de resíduos possue 
várias vantagens sobre os processos aeróbios, tais como: - baixa produção de 
lodo; - poucos requerimentos nutricionais à fermentação; - baixo ou nenhum 
gasto de energia; - aplicação de elevadas cargas orgânicas; - recuperação 
potencial de energia na forma de metano (biogás); - degradação de certos 
compostos tóxicos, tais como halogenados recalcitrantes à degradação 
aeróbia; - habilidade em preservar a atividade do lodo por longos períodos sob 
ausência de alimentação. 
 
 
 28 
2.2.5 Potencial microbiano 
 
Os microrganismos nos sistemas biológicos de tratamento de rejeitos podem 
atuar de maneira particular, ou seja, realizando reações de transformação de 
certas moléculas por mecanismos específicos de seu metabolismo. Assim, 
bioreatores podem ser operados de modo a selecionar a atividade de uma 
bactéria em particular. 
Alguns exemplos são os sistemas biológicos que favorecem prioritariamente a 
nitrificação, ou aqueles que conduzem a desnitrificação. A composição dos 
resíduos poluentes, somada às modificações na operação ou construção dos 
bioreatores constituem a base para a seleção do microrganismo em questão. 
Outro importante exemplo nesse sentido, é o sistema de Lodos Ativados 
modificado, operado para a remoção de nutrientes. Os esgotos domésticos, por 
exemplo, possuem quantidades em excesso de fósforo e nitrogênio, que nos 
processos biológicos de tratamento não são consumidas pelo crescimento 
microbiano. Portanto, o residual não utilizado pode ser lançado diretamente nos 
corpos d'água receptores, ocasionando eutrofização do meio, toxicidade pela 
amônia e prejuízos aos sistemas de abastecimento. 
O sistema desenhado para a remoção de nutrientes seleciona em bioreatores, 
sequencialmente operados sob aerobiose e anaerobiose, bactérias capazes de 
remover fosfatos do meio, bem como promove a nitrificação e desnitrificação. 
Os compostos poluentes sintéticos possuem estruturas bastante complexas e 
desconhecidas para o metabolismo bacteriano. 
A biodegradação de algumas moléculas orgânicas xenobióticas pode ocorrer 
pelos processos biológicos aeróbios e anaeróbios, e sua completa 
estabilização depende das velocidades das reações realizadas pelos 
microrganismos. Este potencial microbiano tem sido ilustrado pela capacidade 
de espécies bacterianas, presentes nos bioreatores aeróbios e anaeróbios, em 
degradar detergentes como os alquilbenzenos sulfonados lineares (LAS) e 
ramificados (BAS). 
O passo limitante da degradação microbiana desses detergentes é a 
separação do radical alquila do anel benzeno sulfonado, pois a reação de 
degradação dos ácidos graxos resultantes ocorre pela via microbiana comum 
 29 
de (-oxidação. O anel aromático sulfonado é degradado posteriormente, a 
dióxido de carbono, água e sulfato. 
Mais recentemente, a atenção de vários pesquisadores no mundo está voltada 
para a problemática de compostos xenobióticosaltamente tóxicos ao meio 
ambiente. A atividade combinada de bactérias nos biotratamentos, através de 
reatores aeróbios e anaeróbios alternados, resulta na estabilização de 
poluentes aromáticos halogenados e nitroaromáticos. 
Os microrganismos responsáveis pela biodegradação de tais compostos 
podem ser selecionados de diferentes fontes naturais, ou dos tanques de 
aeração e biodigestão anaeróbia. Esta ação microbiana é de extrema 
importância para as tecnologias da bioremediação. 
A grande questão em discussão está em como os microrganismos se adaptam 
à utilização de moléculas xenobióticas, afim de suprir suas necessidades de 
carbono e energia. Existem grandes evidências de que os compostos 
halogenados não são incomuns a vida microbiana. Foram identificados cerca 
de 1.500 organohalogenados naturais, e alguns cloroaromáticos são 
produzidos por fungos. 
A adaptação das bactérias a esses poluentes ambientais tem sido verificada 
em vários estudos sobre as comunidades microbianas, que após longos 
períodos de incubaçãos, são capazes de degradar compostos como as 
bifenilas policloradas (PCBs). 
Autores como van der MEER et al. (1994) preconizaram duas possibilidades 
para a adaptação dos microrganismos às moléculas sintéticas: - existência de 
enzimas nas células microbianas que reconhecem a estrutura do composto 
como substrato, conduzindo a uma "adaptação bioquímica" celular; - alteração 
dos sistemas enzimáticos, pelo estímulo na expressão de novos genes 
necessários a conversão do composto, conduzindo a uma "adaptação 
genética" celular. 
As vantagens da biotransformação dos compostos aromáticos pelas células 
está nos mecanismos de produção de energia celular, uma vez que a variação 
de energia livre disponível durante a oxidação de certos aromáticos é alta. 
Alguns trabalhos sugerem que as reações microbianas favorecem a 
destoxificação do próprio meio pelos microrganismos. É certo contudo, que a 
 30 
disponibilidade energética evidencia "o interesse real das células" na utilização 
de um aromático poluente. 
A existência de materiais poluentes antropogênicos tem favorecido o 
desenvolvimento de tecnologias que adotam bioreatores com células 
microbianas especializadas na degradação eficiente de um composto. Além 
disso, estimula o uso da biologia molecular na engenharia de novas células 
com o objetivo de alterar as propriedades enzimáticas celulares, modificar os 
mecanismos regulatórios e reunir em um único organismo os sistemas 
enzimáticos de interesse, encontrados em espécies microbianas 
filogeneticamente distintas. Um exemplo descrito por Glazer e Nikaido (1995), é 
a bactéria Pseudomonas putida modificada, e assim, hábil na degradação de 
uma gama de alquilbenzoatos. 
 
2.3 Bioremediação 
 
No âmbito desse texto, a definição de bioremediação é feita segundo 
COOKSON Jr. (1995). Assim, bioremediação é a tecnologia de utilização de 
microrganismos na recuperação de áreas degradadas pela disposição de 
resíduos, particularmente os resíduos químicos tóxicos. 
A bioremediação requer o controle e a manipulação de processos biológicos 
microbianos in situ, ou seja, na área degradada, introdução de microganismos 
específicos no local poluído, e, quando imprescindível, em reatores operados 
no local de disposição do material poluente. Nesse último caso, ocorre a 
interface com as tecnologias de biotratamento. Porém, na bioremediação, o 
objetivo principal é a obtenção de consórcios microbianos ou culturas 
bacterianas altamente especializadas na degradação de determinados 
poluentes. 
 
 31 
 
Bioremediação : "Dando uma mão para a natureza" (LIU; SUFLITA,1993). 1. relocação 
de materiais; 2. síntese de compostos; 3. depósitos naturais; 4. extração pela atividade 
antrópica; 5. área em recuperação. 
 
Bioremediação: "Dando uma mão para a natureza" 
 
A bioremediação é praticada de modo a promover as melhores condições 
ambientais para o desenvolvimento da capacidade metabólica dos 
microrganismos em questão, selecionando a melhor combinação de doadores 
e aceptores de elétrons, e no caso da existência de co-metabolismo (enzimas 
envolvidas na degradação de um substrato, suportam a transformação do 
substrato orgânico poluente), a seleção do substrato primário. 
 
No ecossistema global a decomposição em dióxido de carbono e água da 
matéria orgânica poluente, originada da atividade antrópica, pode ser 
atualmente estimulada pela utilização de métodos que otimizem a 
biodegradação microbiana no meio. Em última análise, métodos que 
manipulem no local de deposição do poluente, o potencial catabólico 
microbiano pela seleção de grupos de organismos de interesse, ou 
introduzam no sistema organismos previamente selecionados. 
 32 
Sistemas mais comuns utilizados na bioremediação de áreas degradadas. 
Fonte: Cookson Jr. (1995). 
 
 
Exemplos sobre a aplicação da tecnologia de bioremediação. 
Ações microbianas Dificuldades Soluções 
Otimização da degradação de 
fenantreno em solos contaminados com 
óleos de alcatrã, através da ação de 
Phanerochaeta chrysosporium 
Inexistência de população 
especializada in situ. 
Inoculação com 
organismos 
externos. 
Otimização da mineralização de pireno, 
benzopireno e carbazol por consórcios 
microbianos 
Baixa população de 
agentes degradadores in 
situ. 
Seleção e 
enriquecimento in 
situ. 
Co-metabolismo de PCBs pela espécie 
Acinetobacter sp, estimulado pela 
presença do substrato primário 
benzoato 
Ausência de substrato para 
crescimento. 
Suplementação com 
o substrato primário. 
Favorecimento do metabolismo 
anaeróbio para a ocorrência de reações 
de desalogenação redutiva (reações de 
redução de moléculas halogenadas, 
seguida de sua degradação) 
Condições físico-químicas 
ambientais 
Alteração das 
condições 
ambientais. 
Estimulação da biodegradação 
clorofenóis pela presença de doadores 
de elétrons (ácidos orgânicos e álcoois) 
Ausência de doadores de 
elétrons que favorecem as 
reações de redução de 
compostos halogenados. 
Suplementação de 
compostos doadores 
de elétrons. 
Fonte: baseado em (LIU; SUFLITA, 1993). 
 
 
3 PERSPECTIVAS 
 
Os microrganismos estão expostos a uma imensa variedade de compostos 
orgânicos nos ambientes naturais, incluindo os originados da matéria viva e 
Resíduos sólidos - Lagoas projetadas, lagoas in situ, movimentação de solos 
agriculturáveis, compostagem, reatores de lodos 
Resíduos líquidos - Lagoas projetadas, lagoas in situ, bioreatores de 
superfície, bioreatores de leito fixo, in situ através da saturação local. 
 33 
dos processos geoquímicos. Virtualmente, cada um desses compostos pode 
ser utilizado como fonte de energia e/ou carbono por certos tipos microbianos. 
A espetacular versatilidade metabólica de bactérias e fungos é atualmente 
explorada pelo menos em duas áreas do saneamento ambiental: tratamento 
biológico de resíduos líquidos e sólidos, e degradação de compostos 
xenobióticos. 
O biotratamento de águas residuárias sanitárias e de origem industrial conduz 
a mineralização completa de compostos orgânicos pela atuação de 
microrganismos aeróbios e anaeróbios, resultando na recuperação das águas. 
Muitos compostos presentes em alguns resíduos líquidos (fenóis e 
clorobenzenos) são passíveis de degradação nesses sistemas biológicos. 
Outros, contudo, são lentamente ou incompletamente degradados, ou não são 
oxidados. Portanto, um composto pode ser biodegradável, mas a velocidade 
das reações de mineralização no biotratamento são insuficientes para evitar 
que este seja despejado no meio ambiente. 
Das consideraçõessobre a competência de um microrganismo em atuar sobre 
um composto, principalmente xenobiótico, surgiram as pesquisas sobre novas 
tecnologias, cujo o objetivo principal era o de solucionar problemas ambientais 
específicos. A bioremediação é uma das atuais soluções para poluentes 
ambientais, outrora considerados "recalcitrantes". 
As soluções para todos os problemas ambientais de poluição não existem, 
porém não é devido a ausência de tentativas. Muitos esforços têm sido 
empreendidos no desenvolvimento de sistemas que diminuam ou controlem a 
poluição das águas e dos solos. O manejo adequado de diversos 
ecossistemas, com o emprego correto das tecnologias disponíveis de 
biotratamento e bioremediação, é realidade inclusive nos países em 
desenvolvimento. 
Os obstáculos, contudo, são notadamente sentidos pela falta de conhecimento 
dos fundamentos dos sistemas biológicos empregados na "purificação" dos 
ambientes afetados por poluentes. Por exemplo, processos aeróbios 
tradicionalmente utilizados, como os Lodos Ativados, são operados com 
parâmetros químicos e físicos bastante rudimentares, se comparados a outros 
processos biotecnológicos na produção de bens de consumo. A pequena 
compreensão dos sistemas biológicos não impede sua aplicação com bons 
 34 
resultados para o ambiente, mas com certeza, não permite a exploração 
máxima do potencial microbiano. 
Alguns aspectos são de particular interesse para a biotecnologia ambiental: - 
estudos sobre os consórcios microbianos envolvidos nos processos biológicos 
aeróbios e anaeróbios; - estudos sobre a fisiologia dos microrganismos de 
interesse na área ambiental, particularmente os atuantes na degradação de 
compostos tóxicos; - desenvolvimento de novos reatores; - modelagem dos 
processos biológicos; - aumento de escala dos bioreatores; - utilização de 
microrganismos específicos na degradação de certos compostos; - viabilização 
do emprego de microganismos modificados pelas técnicas de engenharia 
genética (GMOs). 
As dificuldades inerentes ao aumento de escala, ou seja, "do laboratório para o 
meio ambiente", são sentidas nos métodos para a bioremediação. O Quadro 9 
resume alguns requerimentos específicos que devem atender o emprego de 
técnicas de bioremediação, bem como do monitoramento das áreas em 
recuperação. 
 
Requerimentos específicos às técnicas de bioremediação e monitoramento das áreas em recuperação. 
 
No Brasil, atualmente, os esforços desenvolvidos para a elucidação da 
microbiologia ambiental são incipientes se comparados àqueles nos países 
desenvolvidos. Os estudos se concentram em maior intensidade na 
microbiologia de águas de abastecimento, portanto controle de qualidade de 
mananciais e avaliação da biodegradação de compostos poluentes, do que na 
microbiologia dos processos de tratamento de resíduos. Porém, nota-se o 
aparecimento de grande interesse às linhas de pesquisa que contemplam a 
avaliação da microbiologia de bioreatores aplicados ao tratamento de resíduos, 
não somente pela sua importância intrínseca, mas também devido ao melhor 
Seleção de culturas; enriquecimento in situ; compreensão das interações 
microbianas, entre microrganismos autóctones e alóctones; identificação de 
poluentes chaves; domínio na manipulação in situ dos microrganismos; 
estabelecimento prévio dos processos físico-químicos; avaliação de efeitos 
transientes nas áreas em questão; avaliação do ecossistema microbiano 
como um todo; operar com instrumentos sensíveis às modificações locais; 
desenvolver biosensores; avaliação do impacto provocado pela inserção de 
GMOs nos ecossistemas em recuperação. 
 35 
conhecimento da biodiversidade microbiana existente nos ecossistemas 
brasileiros. 
A tendência no Brasil é o desenvolvimento de processos biológicos de 
tratamento de baixo custo, que permitam a sua utilização em larga escala, 
atendendo às necessidades inerentes a qualidade ambiental e de saúde 
pública, além da preservação dos recursos naturais, notadamente os 
ecossistemas aquáticos. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
AULAS PRÁTICAS 
 36 
 
 
 
 
 
 
1- NORMAS DE SEGURANÇA NO LABORATÓRIO DE MICROBIOLOGIA 
 
As aulas práticas de Microbiologia têm como objetivo ensinar ao acadêmico os 
princípios gerais e métodos utilizados no estudo de microbiologia. É essencial 
que as normas sejam seguidas, a fim de se evitar contaminações acidentais. 
01- O uso do jaleco é obrigatório. 
02- Cabelos longos devem ser amarrados de forma a não interferir com 
reagentes e equipamentos. 
03- Limpar e desinfetar a superfície das bancadas antes e depois de cada aula 
prática. 
04- Lavar as mãos e calçar luvas de procedimento ao iniciar a análise, lavar as 
mãos antes de sair do laboratório e sempre que for necessário. Se for 
portador de algum ferimento nas mãos, procurar não tocar no material. 
05- Identificar as amostras, bem como o material a ser utilizado antes de iniciar 
a análise. 
06- Utilizar exclusivamente material estéril para a análise. 
07- No caso de derramamento do material contaminado, proceder 
imediatamente a desinfecção e esterilização. O mesmo procedimento 
deverá ser repetido se ocorrer ferimentos ou cortes. 
08- Não comer, beber ou fumar no laboratório. 
09- Não deixar seus pertences sobre os balcões onde os experimentos serão 
realizados 
10- Manter canetas, dedos e outros longe da boca. 
11- Não utilizar material de uso pessoal para limpar os objetos de trabalho. 
12- Avisar ao professor em caso de contaminação acidental. 
13- Depositar todo o material utilizado em recipiente adequado, jamais os 
deixando sobre a bancada. 
14- Flambar as alças, agulhas e pinças antes e após o uso. 
CURSO DE TECNOLOGIA EM SANEAMENTO AMBIENTAL 
DISCIPLINA: MICROBIOLOGIA 
AULA 01 NORMAS DE SEGURANÇA E MATERIAIS UTILIZADOS NO LAB. 
DE MICRO. 
Profª.: JOSIANA LAPORTI 
 
TURMA: ________ DATA: ________ 
ALUNO:___________________________________________________ 
 37 
15- Os cultivos após a leitura devem ser encaminhados para esterilização, 
portanto não os colocar na estufa ou despejar na pia. 
16- Colocar os materiais contaminados (pipetas, lâminas e etc) em recipientes 
apropriados colocados na bancada. 
17- Desinfetar a bancada de trabalho com álcool ou hipoclorito de sódio, ao 
início e término de cada aula prática. Isto removerá microorganismos que 
possam contaminar a área de trabalho. 
18- Seguir as normas de uso de aparelhos. O microscópio deve ser 
manuseado cuidadosamente e após o seu uso, desligá-lo, limpá-lo, e 
colocar a capa. 
19- Ao acender o Bico de Bunsen, verificar se não há vazamento de gás ou 
substâncias inflamáveis por perto. 
20- Trabalhe sempre próximo ao fogo, preservando o cuidado pessoal. 
 
MATERIAIS UTILIZADOS NO LABORATÓRIO DE MICROBIOLOGIA 
 
1. Autoclave (calor úmido) - O seu funcionamento baseia-se no vapor d’água 
sob pressão, e é utilizada para esterilização de materiais usados em 
microbiologia, principalmente meios de cultura. 
2. Estufa esterilizadora ou Forno Pasteur (calor seco) - Usado para 
esterilizar materiais secos tais como tubos, placas, etc. 
3. Estufa Incubadora – Onde os microrganismos são mantidos durante o seu 
desenvolvimento em uma temperatura constante. 
4. Microscópio - Para observação de microrganismos. 
5. Placa de Petri - Recipiente redondo de vidro com tampa rasa, destinada ao 
cultivo de microrganismos em meio sólido. 
6. Tubo de Cultura - Destinado ao cultivo de microrganismos em pequeno 
volume de meio (líquido ou sólido). 
7. Pipeta Graduada - Utilizada para diluição, inoculação, etc. Contém um 
tampão de algodão em uma das extremidades.8. Lâmina e Lamínula - Para o exame microscópico de microrganismos. 
 
LIMPEZA E PREPARAÇÃO DOS MATERIAIS DE LABORATÓRIO DE 
MICROBIOLOGIA 
 38 
 
É muito importante a assepsia dos materiais e do próprio laboratório, quando 
se trabalha com microrganismos, isto porque, qualquer matéria estranha pode 
ser uma fonte de contaminação. 
 
Placas de Petri - se tiverem culturas desenvolvidas, devem ser inicialmente 
autoclavadas (120ºC, 20 minutos), o meio de cultura escorrido ainda quente, 
lavadas com água e sabão e deixadas por algumas horas em solução 
detergente. Depois disso são passadas em água corrente, secas e preparadas 
para a esterilização. As tampas são revestidas com discos de papel de filtro e 
as placas são então embrulhadas ou colocadas em estojos apropriados para 
serem esterilizadas em estufa a 180 ºC por 90 minutos. 
Tubos de Culturas - se tiverem culturas desenvolvidas, proceder como 
descrito anteriormente. Após a lavagem, e antes da esterilização, são 
tamponados com algodão. A esterilização é feita em estufa (180ºC, 90 minutos) 
ou em autoclave, quando já possuem meio de cultura em seu interior. 
Pipetas - são lavadas com água corrente, deixadas em soluções detergente e 
novamente passadas em água. Depois de secas, coloca-se uma mecha de 
algodão na boquilha e em seguida, são esterilizadas em estojos especiais ou 
embrulhadas em papel. No caso do uso de pipetas automáticas, as ponteiras 
devem ser esterilizadas e descartadas após os uso. 
Lâminas e lamínulas - uma vez retiradas do microscópio, são colocadas numa 
cuba contendo solução detergente. Daí são lavadas, deixadas uma noite em 
solução e lavadas novamente. 
 
Observações: 
· Alça e fio de platina devem ser flambados antes e depois de qualquer 
operação de semeadura. É importante que se faça o esfriamento da alça antes 
de ser colhido o material. 
· Em relação às semeaduras feitas em tubos de ensaio, devem ser flambadas 
as bocas dos mesmos, após a retirada e antes da colocação do tampão de 
algodão. Este deve ser mantido pelo dedo mínimo da mão direita e nunca 
deixado sobre a mesa do laboratório. 
 39 
· As placas de Petri deverão ser manuseadas com cuidado e não poderão ficar 
abertas no ambiente, além do cuidado de manuseá-las sempre próximo a uma 
chama. Uma vez semeadas, devem ser incubadas em estufa, com a tampa 
voltada para baixo. 
 OBS: A utilização do Bico de Bunsen é essencial, pois visa a diminuição de 
microrganismos no campo de trabalho através do calor. Para isso ele 
apresenta uma regulagem que torna possível selecionar o tipo de chama ideal 
para o trabalho. No caso da Microbiologia deve ser utilizada a chama azul 
porque esta atinge maior temperatura e não forma fuligem. É importante 
ressaltar que a chama apresenta diferentes zonas, e tal fato é importante para 
que o processo de Flambagem seja executado adequadamente, já que certas 
zonas da chama devem ser evitadas. As zonas da chama são: Zona Neutra (é 
uma zona fria e, portanto, não deve ser utilizada para Flambagem), Zona 
Redutora e Zona Oxidante (são zonas onde já ocorre a combustão e, portanto, 
já podem ser usadas para a Flambagem). 
 
Bico de Bunsen 
 
QUESTÕES PARA ESTUDO 
 
1. Qual a importância da utilização do Bico de Bunsen nas técnicas 
microbiológicas? 
 
2. Por que devemos usar a flambagem na chama azul do Bico de Bunsen? 
 
3. Diferencie: esterilização, desinfecção, assepsia, anti-sepssia e limpeza. 
 
4. Como são classificados os meios de cultura? 
 
 40 
5. Quais as funções da semeadura de microrganismos em meios de 
cultura? 
 41 
 
 
 
2- MEIOS DE CULTURA, TÉCNICAS DE ISOLAMENTO E SEMEADURA 
BACTERIANA 
Para o cultivo de microrganismos em condições laboratoriais é necessário o 
conhecimento de suas exigências nutricionais e das condições físicas 
requeridas. Quando as bactérias e outros microrganismos crescem em meios 
de laboratórios, dá-se o nome de cultura. Existe uma variedade de técnicas 
através dos quais os microrganismos podem ser cultivados e isolados em 
laboratórios. Os microrganismos podem ser cultivados em meios sólidos ou 
líquidos. 
• Cultivo em caldo: Os meios líquidos possuem grande sensibilidade para 
o crescimento de um pequeno número de microrganismos, porém a 
identificação de culturas mistas requer subcultivos posteriores em meio 
sólido para que colônias possam ser processadas separadamente 
propiciando uma correta identificação. 
• Cultivo em ágar: Os meios sólidos, embora menos sensíveis que os 
meios líquidos, permitem a obtenção de colônias isoladas para serem 
identificadas posteriormente. 
 
De acordo com sua composição, os meios de cultura (caldo ou agar) podem 
ser classificados como: 
• Meio rico: Além de todos os nutrientes indispensáveis ao crescimento 
bacteriano, o meio rico é constituído de nutrientes adicionais (tais como: 
sangue, soro, extrato de plantas ou animais) capazes de estimular o 
cultivo de microrganismos exigentes nutricionalmente. 
• Meio seletivo: Adequado ao isolamento de um grupo particular de 
microrganismos através da adição de substâncias químicas capazes de 
inibir certos grupos bacterianos sem afetar outros. 
CURSO DE TECNOLOGIA EM SANEAMENTO AMBIENTAL 
DISCIPLINA: MICROBIOLOGIA 
AULA 02: MEIOS DE CULTURA E TÉCNICAS DE ISOLAMENTO E 
SEMEADURA 
Profª.: JOSIANA LAPORTI 
TURMA: ________ DATA: ________ 
ALUNO: __________________________________________________ 
 42 
• Meio indicador: Através da adição de certos reagentes ao meio, após 
inoculação e incubação, observa-se uma modificação no meio de cultura 
e /ou na colônia possibilitando o reconhecimento de certos grupos 
bacterianos. 
 
Semeadura em placa de petri contendo meio sólido: 
A semeadura dos microrganismos pode ser realizada por: 
- Estrias: flamba-se a alça de platina no bico de Bunsen, depois de 
esfriada, introduz-se a alça no tubo ou placa contendo o microrganismo e 
retira-se um pequeno inóculo. Introduz-se a alça de platina na placa e 
desliza-se a mesma em vários sentidos sobre a meio de cultura sólido. 
- Por ponto: com um fio de platina flambado no bico de Bunsen, coleta-se 
um pequeno inóculo do microrganismo e introduz o fio no centro da placa 
de petri contendo o meio de cultura sólido. 
- Por espalhamento: com o auxílio de uma pipeta estéril retira-se 0,1 mL de 
uma cultura de microrganismo e coloca-se em uma placa de petri contendo 
meio de cultura sólido. Flamba-se a alça de Drigalsky em álcool e fogo e 
espalha-se por toda a superfície da placa. 
Semeadura em meio de cultura líquido 
Com uma alça de platina previamente flambada retira-se um inóculo de 
microrganismo contido em placa ou tubo de cultura e transfere-se para o tubo 
de cultura contendo meio líquido. 
 
TÉCNICA DE PREPARO DE MEIO DE CULTURA 
 
MATERIAL 
-Bastão de vidro 
-Algodão hidrófobo, gaze, papel de embrulho e barbante 
-Placas de petri esterilizadas 
-Balança 
-Bico de Bunsen, tripé e tela de amianto 
- Becker/ Balão 
-Agar nutriente 
-Água destilada. 
 43 
 
MÉTODO 
1-Pesar as quantidades dos meios desidratados de acordo com as instruções 
do seu orientador. Diluir o meio desidratado em água destilada, mexer bem até 
dissolver todo o pó. 
2- Cozinhar os meios tendo o cuidado de agitar sempre, de modo a que 
permanecem com aspecto homogêneo e não se formem grânulos. 
3- Após o cozimento rolhar os balões de Agar nutriente com rolha 
confeccionada com algodão hidrófobo e gaze. Envolver a rolha após colocada 
com papel de embrulho e amarrar bem com o barbante. 
5- Leve os balões de Agar Nutriente a autoclavar por 15 minutos à temperatura 
de121ºC. 
6- Após a esterilização retire os meios da autoclave. Deixe arrefecer o Agar 
Nutriente até cerca de 45ºC. Em seguida dispense o meio em placas de petri 
esterilizadas, cerca de 20ml em cada uma delas. O procedimento será o 
seguinte: abra a tampa ligeiramente, verta a quantidade necessária de meio, 
feche a tampa e movimente a placa de modo a espalhar o meio 
homogeneamente por todo o seu fundo. Deixe o meio solidificar . 
7- Inverta as placas, identifique-as com data e tipo de meio e incube por 48h a 
37ºC para a prova de esterilidade. 
8- Guarde todos os meios após a prova de esterilidade no frigorífico, até a 
próxima aula prática. 
9- Trabalhe sempre junto da chama da lamparina ou Bunsen. 
 
Na aula seguinte poderá analisar os meios e verificar se efetivamente estão 
estéreis. Será então possível elaborar o seu relatório sobre preparação de 
meios de cultura e esterilização. 
 
PERGUNTAS: 
01- Diferencie meio rico, seletivo e indicador. 
02- Diferencie as formas de semeadura em meio sólido e líquido. 
03- Pesquise sobre a cultura de microorganismos para análise de água para 
abastecimento. 
 44 
 
 
 
3 COLORAÇÃO DE ZIEHL-NEELSEN 
A Técnica de Ziehl-Neelsen é uma técnica de coloração de bactérias mais 
agressiva que a técnica de Gram. Ela é usada em bactérias que coram mal 
com o Gram e respondem bem a coloração de Bacilos Álcool-Ácido 
Resistentes. 
 
PROCEDIMENTO PRÁTICO: 
a- preparar um esfregaço não muito espesso no centro de uma lâmina nova 
limpa e desengordurada, fixando-o pelo calor; 
b- Cobrir o esfregaço fixado com a fucsina fenicada de Ziehl-Neelsen e aqueça 
a lâmina durante 5 minutos, cuidando para que o líquido não entre em ebulição 
ou ainda que seque; 
c- Lavar rapidamente em água corrente; 
d- Descorar usando a solução descorante (álcool ácido), gotejando-a sobre a 
lâmina inclinada até que não remova mais corante; 
e- Lavar em água corrente; 
f- Corar pelo azul de metileno por 2 minutos; 
g- Lavar em água corrente e deixar secar na posição vertical ao ar ; 
h- Levar ao microscópio e analisar usando a objetiva de imersão. 
 
Os BAAR (Bacilos Álcool-Ácido Resistentes) coram-se em vermelho contra um 
fundo azul. 
 
 
 
CURSO DE TECNOLOGIA EM SANEAMENTO AMBIENTAL 
DISCIPLINA: MICROBIOLOGIA 
AULA 03: COLORAÇÃO ZIEHL NEELSEN E GRAM 
Profª.: JOSIANA LAPORTI 
 
TURMA: ________ DATA: ________ 
ALUNO:___________________________________________________ 
 45 
3.1 COLORAÇÃO DE GRAM 
 
A Técnica de Coloração de Gram é usada para diferenciação de 
microorganismos através das cores, para serem observados em microscópio 
óptico. A técnica recebeu este nome em homenagem ao médico dinamarquês 
Hans Cristian Joaquim Gram. 
Por volta de 1884, Hans Gram observou que as bactérias, após serem tratadas 
com diferentes corantes, adquiriram cores diferenciadas. Assim, as que 
ficavam roxas foram classificadas de Gram-positivas, e as que ficavam 
vermelhas, foram chamadas de Gram-negativas. A técnica de Gram é 
fundamental para a taxonomia e identificação das bactérias, sendo muito 
utilizada atualmente, como técnica de rotina em laboratórios de bacteriologia. 
 
PROCEDIMENTO PRÁTICO: 
a-Em uma lâmina, contendo esfregaço seco, cubra-o pingando gotas de 
violeta-de-metila e deixe agir por 15 segundos; 
b-Adicione água ao esfregaço, em cima do violeta-de-metila, cobrindo toda a 
lâmina. Deixe agir por mais 45 segundos; 
c-Após o tempo corrido, escorra o corante e lave o esfregaço em um filete de 
água corrente. Cubra a lâmina com lugol ou Iodo de Gram e deixe por 60 
segundos; 
d-Escorra todo o lugol e lave em um filete de água corrente; 
e-Aplique álcool etílico a 95%, ou acetona, para descorar a lâmina por 10 a 20 
segundos; 
f-Lave em um filete de água corrente; 
g-Cubra toda a lâmina com safarina e deixe corar por aproximadamente 30 
segundos; 
h-Lave a lâmina em um filete de água; 
i-Seque a lâmina com auxílio de um papel de filtro limpo ou deixe-a secar ao ar 
livre; 
j-Aplique uma gota de óleo de imersão sobre o esfregaço e observe no 
microscópico com objetiva de imersão (100 X). 
 
 46 
Os resultados após a coloração de Gram permitem classificar as bactérias em 
dois grupos: GRAM POSITIVAS E GRAM NEGATIVAS 
 
COLORAÇÃO DE GRAM FEITO EM IOGURTE 
 
A parede celular de bactérias Gram-positivas difere-se das bactérias Gram-
negativas pela presença de uma espessa camada de peptidoglicano e pela 
ausência de uma membrana externa. Esta diferença de constituição da parede 
celular é a base da coloração de Gram, uma técnica primordial no diagnóstico 
microbiológico, visto que através dela se definem características morfológicas e 
tintoriais da bactéria em pesquisa. 
A coloração de Gram consiste em tratar bactérias sucessivamente com cristal 
violeta, lugol, álcool-acetona e fuccina (ou safranina). O cristal vioeta e o lugol 
formam um complexo denominado iodopararosanilina, o qual confere coloração 
roxa tanto pelas bactérias Gram-positivas, quanto as Gram-negativas. Com a 
adição de álcool-acetona, as bactérias Gram-negaticas liberam o complexo 
formado, pois a camada de peptidoglicano é de pequena espessura, enquanto 
que as Gram-positivas retêm o complexo, permanecendo roxas. A adição de 
fuccina (ou safranina) não altera a cor das Gram-positivas, mas confere a cor 
avermelhada as bactérias Gram-negativas, que foram descoloridas pelo álcool-
acetona. 
 
PROCEDIMENTO PRÁTICO: 
Esfregaço da cultura bacteriana líquida (IOGURTE): 
1- Flambe uma alça, deixe esfriar, mantendo-a próximo a chama. 
2- Retire uma amostra da cultura com a alça e deposite no centro da lâmina. 
3- Espalhe o material com a alça em movimento circular, obtendo um esfregaço 
de forma oval, uniforme e fino. 
4- Fixe o esfregaço, passando a lâmina na chama do bico de Bunsen, como se 
cortando a chama, repetindo este procedimento 3 vezes, para que o material 
fique bem aderido. 
 
- Adição de Corantes (IGUAL ANTERIOR). 
 47 
 
 
 
4 CONTROLE DE MICRORGANISMOS 
 
O controle dos microorganismos é um assunto abrangente e de inúmeras 
aplicações práticas envolvendo toda a microbiologia e suas aplicações em 
Saneamento Ambiental e em Medicina. 
O método mais empregado para matar microorganismos é o calor, por ser 
eficaz, barato e prático. Os microorganismos são considerados mortos quando 
perdem a capacidade de multiplicar. Porém podemos utilizar os agentes 
químicos neste controle. Estes são apresentados em grupos que tenham em 
comum, ou as funções químicas, ou elementos químicos, ou mecanismo de 
ação. 
Nesta aula apresentaremos algumas formas de controle de crescimento de 
microorganismos: 
- Capela de Fluxo laminar 
- Agentes Químicos: álcool absoluto e detergente 
 
Algumas Terminologias importantes: 
• Esterilização: Processo de destruição de todas as formas de vida de um 
objeto ou material. É um processo absoluto, não havendo grau de 
esterilização. 
• Desinfecção: Destruição de microorganismos capazes de transmitir 
infecção. São usadas substâncias químicas que são aplicadas em 
objetou os materiais. Reduzem ou inibem o crescimento, mas não 
esterilizam necessariamente. 
• Anti-sepsia: Desinfecção química da pele, mucosas e tecidos vivos, é 
um caso da desinfecção. 
• Germicida: Agente químico genérico que mata germes. 
CURSO DE TECNOLOGIA EM SANEAMENTO AMBIENTAL 
DISCIPLINA: MICROBIOLOGIA 
AULA 04 : CONTROLE DE MICRORGANISMOS 
Profª.: JOSIANA LAPORTI 
 
TURMA: ________ DATA: ________ 
ALUNO: __________________________________________________ 
 48 
• Bacteriostase: A condiçãona qual o crescimento bacteriano está inibido, 
mas a bactéria não está morta. Se o agente for retirado o crescimento 
pode recomeçar 
• Assepsia: Ausência de microorganismos em uma área. Técnicas 
assépticas previnem a entrada de microorganismos. 
• Degermação: Remoção de microorganismos da pele por meio de 
remoção mecânica ou pelo uso de anti-sépticos. 
A cabine de segurança biológica possui modernos mecanismos de controle de 
contaminação. Este equipamento tem como principal funcionalidade criar uma 
área de trabalho estéril para a manipulação segura de materiais biológicos ou 
estéreis, sendo recomendada para manipulação de materiais classificados de 
risco moderado, objetivando evitar o escape de gases tidos como perigosos e 
partículas dentro do laboratório, garantindo desta forma a Classe ISO5 na área 
de trabalho. 
Adequada para utilização em todo tipo de operação que necessite de proteção 
ao produto, ao operador e ao meio ambiente contra a contaminação por 
agentes biológicos. Esses agentes biológicos representam um alto risco para 
o homem e para o ambiente, podendo causar sérios problemas à saúde 
humana. Os contaminantes externos não entram na área de trabalho, 
assegurando proteção ao produto e os contaminantes do produto não saem 
para o ambiente, protegendo o operador e o ambiente. 
O equipamento está em pressão negativa, forçando o ar contaminado a passar 
pelo filtro HEPA, evitando a fuga do ar contaminado para o laboratório. 
Aproximadamente 70% do ar é recirculado e os outros 30% são exauridos para 
o ambiente (externo), já filtrados por filtro HEPA. Possui adicionalmente uma 
caixa de exaustão que direciona os 30% de ar exauridos para o meio ambiente, 
o que requer um levantamento prévio das características do local de instalação. 
A cortina frontal existente no equipamento protege o operador. 
O Fluxo laminar interno protege o produto manipulado e o filtro HEPA de 
exaustão protege o ambiente. O ar liberado é lançado filtrado para fora do 
laboratório. 
 
 
 
 49 
 MATERIAL 
-Capela de Fluxo Laminar (OU BICO DE BUNSEN) 
-Placas de petri esterilizadas com -Agar nutriente 
-Bico de Bunsen, tripé e tela de amianto 
-Álcool absoluto 
-Detergente neutro 
-Caneta de retroprojetor 
 
MÉTODO 
1- Observação da Capela de Fluxo Laminar e compreender o seu 
funcionamento 
2- Dividir a Placa de Petri em quatro regiões com auxílio de caneta de 
retroprojetor 
3- Identificar as regiões embaixo da placa com os números 01, 02 , 03 e 04, 
sendo que: 
a. Nº 01- Mão comum 
b. Nº 02- Mão após passar sobre diversas superfícies do ambiente 
c. Nº 03- Mão lavada com detergente neutro 
d. Nº 04- Mão lavada com álcool absoluto 
4- Passar a mão (conforme indicação acima) levemente sobre a superfície do 
ágar (usando a zona de chama azul para abertura da placa) 
5- Levar as placas para estufa bacteriológica durante 48 h à 37º C; 
 
Após 48h fazer a análise e comparação dos resultados e responder as 
questões abaixo. 
 
Questões: 
01- A Capela de Fluxo Laminar faz parte do protocolo de controle por agentes 
físicos ou químicos? Que tipo de agente é utilizado? 
02- Cite outras formas de controle de microorganismo da mesma classe do 
utilizado pela capela. 
03- Houve diferença no padrão de crescimento de microorganismo nos campos 
01, 02, 03 e 04 nas placas de petri? Que diferença você observou? 
04- O álcool é um agente químico orgânico. Quais os tipos de atuação ele tem? 
 50 
05- O que são agentes químicos esterilizantes? Cite exemplos. 
06- Quais os fatores que influenciam a ação antimicrobiana? 
 
 
 
 51 
Informações teóricas sobre controle de microorganismos 
Fundamentos; Agentes físicos e químicos 
O controle dos microorganismos é um assunto abrangente e de inúmeras 
aplicações práticas envolvendo toda a microbiologia e não só aquela aplicada à 
medicina. 
Métodos Físicos de controle: 
O método mais empregado para matar microorganismos é o calor, por ser 
eficaz, barato e prático. Os microorganismos são considerados mortos quando 
perdem a capacidade de multiplicar. 
• Calor úmido: A esterilização empregando calor úmido requer temperaturas 
acima de fervura da água (120º). Estas são conseguidas nas autoclaves, e este 
é o método preferencial de esterilização desde que o material ou substância a 
ser esterilizado não sofra mudanças pelo calor ou umidade. A esterilização é 
mais facilmente alcançada quando os organismos estão em contato direto 
como vapor, nestas condições o calor úmido matará todos os organismos. 
• Calor seco: A forma mais simples de esterilização empregando o calor seco 
é a flambagem. A incineração também é uma forma de esterilizar, empregando 
o calor seco. Outra forma de esterilização empregando o calor seco é feita em 
fornos, e este binômio tempo e temperatura deve ser observado atentamente. 
A maior parte da vidraria empregada em laboratório é esterilizada deste modo. 
• Pasteurização: consiste em aquecer o produto a uma dada temperatura, 
num dado tempo e a seguir, resfria-lo bruscamente, porém a pasteurização 
reduz o numero de microorganismos presentes mas não assegura uma 
esterilização. 
• Radiações: As radiações têm seus efeitos dependentes do comprimento da 
onda, da intensidade, da duração e da distância da fonte. Há pelo menos dois 
tipos deradiações empregadas no controle dos microorganismos: ionizantes e 
não-ionizantes. 
• Indicadores biológicos: São suspensões-padrão de esporos bacterianos 
submetidos a esterilização juntamente com os materiais a serem processados 
 52 
em autoclave, estufas e câmera de radiação. Terminado o ciclo, são colocados 
em meio de cultura adequada para o crescimento de esporos, se não houver 
crescimento, significa que o processo está validado. 
• Microondas: Os fornos de microondas são cada vez mais utilizados em 
laboratórios e as radiações emitidas não afetam o microorganismo, mas geram 
calor. O calor gerado é responsável pela morte dos microorganismos. 
• Filtração: A passagem de soluções ou gases através de filtros, retêm os 
microorganismos, então pode ser empregada na remoção de bactérias e 
fungos, entretanto, passar a maioria dos vírus. 
• Pressão Osmótica: A alta concentração de sais ou açúcares cria um 
ambiente hipertônico que provoca a saída de água do interior da célula 
microbiana. Nessas condições os microorganismos deixam de crescer e isto 
tem permitido a preservação de alimentos. 
• Dessecação: Na falta total de água, os microorganismos não são capazes 
de crescer, multiplicar, embora possam permanecer viáveis por vários anos. 
Quando a água é novamente reposta, o microorganismo readquirem a 
capacidade de crescimento. Esta peculiaridade tem sido muito explorada pelos 
microbiologistas para preservar microorganismos e o método mais empregado 
é a liofilização. 
Agentes Físicos 
Altas Temperaturas : calor úmido, calor seco, incineração 
1. Calor Úmido 
• mais eficiente que o calor seco para destruir os microrganismos - leva 
menos tempo e a temperaturas menores 
• causa desnaturação e coagulação das proteínas vitais, as enzimas, 
enquanto o calor seco causa oxidação dos constituintes orgânicos da 
célula (queima lentamente) 
• os endosposporos bacterianos são as formas mais resistentes de vida 
o células vegetativas de bactérias - mortas de 5-10 min a 60-70 oC 
o células vegetativas de fungos - mortas de 5-10 min a 50-60 oC 
o esporos de fungos - mortas de 5-10 min a 70-80 oC 
 53 
• o calor úmido utilizado para matar os microrganismos pode ser na forma de 
: vapor, água fervente, água aquecida a temperaturas abaixo do seu ponto 
de ebulição (100 oC) 
(a) Vapor d'água• o vapor d'água sob pressão é a mais prática e segura aplicação do calor 
úmido. O aparelho destinado a este fim é a AUTOCLAVE, desenvolvida no 
século XIX 
 
1 - vazão; 2 - cano de saída; 3 - saída; 4 - câmara de exaustão; 5 - vapor para 
a câmara; 6 - válvula de segurança; 7 - manômetro; 8 - válvula operadora; 9 - 
porta; 10 - maçaneta; 11 - fecho de segurança; 12 - tela removível; 13 - 
termômetro; 14 - regulador de pressão; 15 - injetor de ar de condensação 
automática; 16 - revestimento de vapor; 17 - vapor; 18 - ar. 
Procedimento do funcionamento da autoclave : 
1. a câmara de parede dupla da autoclave é primeiramente lavada com 
vapor fluente para remover todo o ar 
2. é então preenchida com vapor puro e mantida a uma determinada 
temperatura e pressão por um período específico de tempo. É essencial 
que todo o ar residual inicialmente presente na câmara seja 
completamente substituído por vapor d'água - se o ar estiver presente 
reduzirá a temperatura interna da autoclave , e é a temperatura e não a 
pressão no interior da câmara que mata os microrganismos 
 54 
3. uma autoclave é usualmente operada à uma pressão de 15 lb/pol2, na 
qual a temperatura de vapor é de 121 oC. Leva mais tempo para um 
calor penetrar em um material viscoso ou sólido do que em um matterial 
fluido. Quanto maior o volume mais tempo para o calor penetrar 
Recipiente Tempo de exposição (min, a 121 - 123 oC) 
Tubos de ensaios 
18 x 150 mm 
32 x 200 mm 
38 x 200 mm 
12 - 14 
13 - 17 
15 – 20 
Frascos Erlenmeyer 
50 ml 
500 ml 
1.000 ml 
2.000 ml 
12 - 14 
17 - 22 
20 - 25 
30 – 35 
Garrafas de diluição, 100 ml 13 – 17 
Frascos de soro, 9.000 ml 50 – 55 
(b) Água Fervente 
• água levada ao ponto de ebulição : 100 oC 
• mata microrganismos vegetativos presente no líquido 
• os materiais ou objetos contaminados não são esterilizados com 
seguraça pos alguns endosporos bacterianos podem resistir a 100 oC 
por mais de 1 hora 
• água em ebulição não é considerado um método de esterilização 
(c) Temperaturas abaixo do seu ponto de ebulição (100 oC) - 
Pasteurização 
• aquecimento lento a baixas temperaturas 
• mata as células vegetativas de patógenos, mais não esteriliza 
 
 55 
2. Calor Seco 
• calor seco ou ar quente em temperaturas suficientemente altas levam os 
microrganismos à morte. Leva mais tempo que o calor úmido 
• há materiais que não podem ser esterilizados por calor úmido, neste 
caso o calor seco é o preferido 
3. Incineração 
• é uma prática de rotina : alça ou agulhas de semeaduras bacteriológicas 
no bico de Bunsen 
Baixas Temperaturas 
• temperaturas abaixo de 0 oC inibirão o metabolismo dos microrganismos 
em geral. Não mata, preserva-os como forma de latência 
• Ex. freezer doméstico: - 20 oC; freezer: - 70 oC; nitrogênio líquido: -196 
oC 
Radiações 
• energia na forma de ondas eletromagnéticas transmitidas através do 
espaço ou através de um material 
• as radiações magnéticas são classificadas de acordo com seus 
comprimentos de onda : Quanto maior, menos energia (conteúdo 
energético) 
• radiações de alta energia (comprimento de onda baixo) podem matar as 
células, inclusive microrganismos - raios X, gama e luz UV 
Formas de Radiações : 
1. Radiação Ionizante 
as radiações de alta energia tem energia suficiente para causar 
ionização das moléculas - rompendo as moléculas em átomos ou grupo 
de átomos (H2O ---- H+ + OH-) - e os radicais hidroxilas por exemplo são 
altamente reativos e destroem compostos celulares como o DNA e 
 56 
proteínas exemplos: raios X e raios gama. Além de microbicidas os raios 
de alta energia são capazes de penetrar em pacotes de produtos e 
esterilizar seus interiores são mais utilizados para esterilizar alimentos e 
equipamentos médicos 
2. Radiação Não-Ionizante 
a radiação UV tem um comprimento de onda entre 136 a 400 nm, que 
ao invés de ionizar uma molécula excita os elétrons - resultando em uma 
molécula que reage diferente das moléculas não-irradiadas. O DNA 
sofre a maior avaria a maior atividade bactericida ocorre no comprimento 
de onda próximo de 260 nm (mais fortemente absorvido pelo DNA) 
lâmpadas especiais que emitem luz UV com comprimento de onda 
microbicida são utilizadas para matar microrganismos - apenas os 
microrganismos da superfície de um objeto são mortos 
Filtrações 
• as membranas filtrantes são úteis para esterilização, e separação de 
diferentes tipos de microrganismos e para coletar amostras microbianas 
• tamanho dos poros que retem ou não os microrganismos : 
bactérias - 0.5 a 1.0 µm (geral) 
leveduras - 1.0-5.0 µm x 5-30 µm 
• alguns tamanhos de poros comerciais : 0.25 µm ; 0.45 µm ; 0.5 µm ; 1 
µm 
Dessecação 
• células microbianas vegetativas quando dessecadas interrompem suas 
atividades metabólicas, levando a um declínio na população total viável 
• no processo chamado liofilização os microrganismos são submetidos à 
desidratação extrema em temperaturas de congelamento mantidas em 
ampolas fechadas à vácuo 
• 
 57 
Métodos Químicos de controle 
Os agentes químicos são apresentados em grupos que tenham em comum, 
ou as funções químicas, ou elementos químicos, ou mecanismo de ação. 
• ·Álcoois: A desnaturação de proteínas é explicação mais aceita para a ação 
antimicrobiana. Na ausência de água, as proteínas não são desnaturadas 
tão rapidamente quanto na sua presença. Alguns glicóis podem ser 
usados, dependendo das circunstâncias, como desinfetantes do ar. 
• ·Aldeídos e derivados: Pode ser facilmente solúvel em água, é empregado 
sob a forma de solução aquosa em concentrações que variam de 3 a 8%. A 
metenamina é um anti-séptico urinário que deve sua atividade à liberação 
de aldeído fórmico. Em algumas preparações, a metenamina é misturada 
ao ácido mandélico, o que aumenta seu poder bactericida. 
• Fenóis e derivados: O fenol é um desinfetante fraco, tendo interesse apenas 
histórico, pois foi o primeiro agente a ser utilizado como tal na prática 
médica e cirúrgica, os fenóis atuam sobre qualquer proteína, mesmo 
aquelas que não fazem parte da estrutura ou protoplasma do 
microorganismo, significando que, em meio orgânico protéico, os fenóis 
perdem sua eficiência por redução da concentração atuante. 
• Halogênios e derivados: Entre os halogênios, o iodo sob forma de tintura é 
um dos anti-sépticos mais utilizados na práticas cirúrgicas. O mecanismo 
de ação é combinação irreversível com proteínas, provavelmente através 
da interação com os aminoácidos aromáticos, fenilalanina e tirosina. 
• Ácidos inorgânicos e orgânicos: Um dos ácidos inorgânicos mais populares 
é o acido bórico; porém, em vista dos numerosos casos de intoxicação, seu 
emprego é desaconselhado. Desde a muito tempo tem sido usados alguns 
ácidos orgânicos, como o ácido acético e o ácido láctico, não como anti-
sépticos mas sim na preservação de alimentos hospitalares. 
• Agentes de superfície: Embora os sabões se encaixem nessa categoria são 
compostos aniônicos que possuem limitada ação quando comparada com 
a de substância catiônicas. Dentre os detergentes catiônicos os derivados 
de amônia tem grande utilidade nas desinfecções e anti-sepsias. O modo 
preciso de ação dos catiônicos não esta totalmente esclarecido, sabendo-
 58 
se, porém, que alteram a permeabilidade da membrana, inibem a 
respiração e a glicólise de formas vegetativas das bactérias, tendo também 
ação sobre fungos, vírus e esporos bacterianos. 
• Metais pesados e derivados: O baixo índice terapêutico dos mercuriais e o 
perigo de intoxicação por absorção fizeram com que aos poucos 
deixassem de seremusados, curiosamente alguns derivados mercuriais 
tiveram grande aceitação, embora dotados de fraca atividade bactericida e 
bacteriostática in vivo, como o merbromino. 
Agentes oxidantes: A propriedade comum destes agentes é a liberação de 
oxigênio nascente, que é extremamente reativo e oxida, entre outras 
substâncias o sistemas enzimáticos indispensáveis para a sobrevivência dos 
microorganismos. 
Esterilizantes gasosos: Embora tenha atividade esterilizante lenta o óxido de 
etileno tem sido empregado com sucesso na esterilização de instrumentos 
cirúrgicos, fios de agulhas para suturas e plásticos. 
Terminologias 
• Esterilização: Processo de destruição de todos as formas de vida de um 
objeto ou material. É um processo absoluto, não havendo grau de 
esterilização. 
• Desinfecção: Destruição de microorganismos capazes de transmitir 
infecção. São usadas substâncias químicas que são aplicadas em 
objetou os materiais . reduzem ou inibem o crescimento, mas não 
esterilizam necessariamente. 
• Anti-sepsia: Desinfecção química da pele, mucosas e tecidos vivos, é 
um caso da desinfecção. 
• Germicida: Agente químico genérico que mata germes. 
• Bacteriostase: A condição na qual o crescimento bacteriano está inibido, 
mas a bactéria não está morta. Se o agente for retirado o crescimento 
pode recomeçar 
• Assepsia: Ausência de microorganismos em uma área. Técnicas 
assépticas previnem a entrada de microorganismos. 
 59 
• Degermação: Remoção de microorganismos da pele por meio de 
remoção mecânica ou pelo uso de anti-sépticos. 
Controlar - destruir, inibir ou remover. Vários sao os agentes físicos e 
químicos que podem ser utilizados para manter os microrganismos em 
níveis aceitáveis 
• processos usados : aquecimento, baixas temperaturas, radiação, 
filtração e dessecação. O método de escolha depende do tipo de 
material que contém o microrganismo : (1) meio de cultura; (2) produtos 
farmacêuticos; (3) superfície de instrumentos cirúrgicos; (4) sala de 
cirurgia de um hospital; (5) alimento de consumo humano 
• substâncias químicas que matam os microrganismos, ou previnem o seu 
crescimento são chamados de agentes ANTIMICROBIANOS 
(antibacterianos, antivírus, antifúngicos, antiprotozoários) 
Antimicrobianos : 
• que matam os microrganismos - MICROBICIDA (bactericida, fungicida, 
viricida) 
Esterilização - destruição de todos os microrganismos presentes em um 
material, incluindo esporos 
• que apenas inibem o crescimento dos microrganismos - 
MICROBIOSTÁTICOS (fungistático ou bacteriostático) 
• aspectos fundamentais que se deve aplicar aos agentes físicos e 
químicos : 
1. Padrão de morte em uma população microbiana 
• o critério de morte de um microrganismo em Microbiologia é baseado em 
uma única propriedade : a capacidade de se reproduzir. Assim a morte 
de um microrganismo é definida como a perda da capacidade de 
reprodução 
 60 
• a avaliação da eficiência de um agente microbicida pode ser testada 
cultivando uma amostra do material tratado para determinar o número 
de sobreviventes 
2. Condições que influenciam a atividade antimicrobiana 
• tamanho da população microbiana - quanto maior mais tempo para 
morrer 
• concentração do agente microbicida - quanto menor a concentração 
mais tempo leva para destruir 
• tempo de exposição ao agente microbicida - quanto maior o tempo de 
exposição maior será o número de células mortas 
• temperatura em que são expostos ao agente microbicida - quanto mais 
alta a temperatura mais rapidamente a população é morta 
• natureza do material que contém os microrganismos - tempo de 
exposição menor - meio fluido e pH 5.0 
• características dos microrganismos que estão presentes 
3. Mecanismo de destruição das células microbianas 
• conhecendo o mecanismo de ação de um dado composto é possível 
predeterminar as condições sob as quais atuará mais eficientemente, 
além de também revelar que espécies de microrganismos serão mais 
susceptíveis àquele agente 
• os possíveis mecanismos estão associados com os principais aspectos 
estruturais : alteração do estado físico do citoplasma, inativação de 
enzimas, ou rompimento da membrana ou parede celular - podem levar 
à morte da célula. 
Agentes Químicos 
Aplicação dos compostos químicos 
• redução do número de microrganismos na superfície de material 
inanimado (assoalhos, mesas, e utensilios domésticos) 
• em lesões de pele para prevenir a infecção 
 61 
• eliminação de microrganismos patogênicos da água potável e de 
piscinas 
Não existe um único composto químico que seja ideal para todos os propósitos. 
Assim é importante conhecer algumas propriedades para que se possa 
escolher o mais adequado: 
1. as vantagens que o agente apresenta quando utilizados em 
determinadas situações 
2. as principais categorias de agentes químicos antimicrobianos 
3. algumas de suas características e suas utilizações práticas 
4. e como atuam nos microrganismos 
Características de um agente químico ideal 
1. Atividade antimicrobiana - a capacidade de uma substância de inibir ou 
preferencialmente matar os microrganismos - Esta é sempre a primeira 
exigência 
2. Solubilidade - a substância deve ser solúvel em água ou outros 
solventes (álcool) em quantidades necessária ao seu uso efetivo 
3. Estabilidade - o armazenamento da substância durante um período 
razoável não deve resultar em uma perda significativa de ação 
antimicrobiana 
4. Ausência de toxicidade - não deve prejudicar o homem ou os animais 
5. Homogeneidade - as preparações devem ser uniformes em sua 
composição (os componentes ativos devem estar presentes em cada 
aplicação) 
6. Inativação mínima por material estranho - alguns compostos químicos 
antimicrobianos combinam facilmente com proteínas, diminuindo a 
quantidade de substância química disponível para agir contra os 
microrganismos 
7. Atividade em temperatura ambiente ou corporal - não deve ser 
necessário aumentar a temperatura além daquela normal encontrada no 
ambiente, onde os compostos químicos são utilizados 
 62 
8. Poder de penetração - a ação antimicrobiana é limitada ao local de 
aplicação, entretanto a ação na superfície é algumas vezes necessárias 
9. Ausência de poderes corrosivos e tintoriais - os componentes não 
devem corroer ou desfigurar metais nem corar ou danificar os tecidos 
10. Poder desodorizante - o desinfetante ideal deve ser inodoro ou 
apresentar um odor agradável 
11. Capacidade detergente - um agente antimicrobiano que tem 
propriedades detergente tem a vantagem de ser capaz de remover 
mecanicamente os microrganismos da superfície que esta sendo tratada 
12. Disponibilidade a baixo custo - o produto deve ser facilmente encontrado 
e de baixo custo 
Principais Grupos de Desinfetantes e Anti-sépticos: 
1. Fenol e Compostos Fenólicos: 
• solução de fenol 5% mata rapidamente as formas vegetativas dos 
microrganismos, porém os esporos são muito mais resistentes 
• o fenol por ser tóxico e apresentar odor desagradável não é muito 
utilizado como desinfetante ou anti-séptico. Tem sido substituido por 
vários derivados químicos, os quais são menos tóxicos para os tecidos e 
mais ativos para os microrganismos. Exemplos : lysol - desinfetante 
produzido a partir de uma solução de sabão contendo o-fenilfenol, o-
benzil-p-clorofenol e xilenol, usado para desinfetar objetos inanimados 
(assoalhos, paredes e superfícies de mesa, termômetro retal); 
hexaclorofeno - atua como um bacteriostático em bactérias Gram +, 
particularmente em estafilococos 
• mecanismo de ação : fenol e derivados, alteram a permeabilidade 
seletiva da membrana,desnaturam e inativam proteínas como enzimas, 
causando uma perda de substâncias intracelulares (lisam as células). 
Dependendo da concentração utilizada podem ser bacteriostático ou 
bactericida 
 
 63 
2. Álcoois 
• em concentração entre 70 e 90 % as soluções de etanol são eficientes 
contra as formas vegetativas dos microrganismos 
• não é utilizado para esterilizar um objeto porque não mata os 
endosporos bacterianos (Bacillus anthracis pode sobreviver no álcool 
por 20 anos) 
• o metanol não é utilizado como agente bactericida - é altamente tóxico. 
Quanto maior for a cadeia de carbono do álcool maior suas propriedades 
bactericida, porém os álcoois maiores como o propílico e isopropílico já 
não são mais solúveis em água 
• os álcoois propílicos e isopropílicos 40 a 80% são bactericidas para 
células vegetativas. O álcool etílico 70% e o álcool isopropílico 90% 
(mais eficiente contra vírus) são utilizados como anti-sépticos de pele e 
como desinfetantes de termômetro clínicos de uso oral, e de certos 
instrumentos cirúrgicos 
• Mecanismo de ação : capazes de desnaturar proteínas; como são 
solventes de lipídeos, lesam as estruturas lipídicas da membrana das 
células microbianas 
3. Halogênios 
iodo cloro e bromo - fortes agentes oxidantes e altamente reativos - destruindo 
os componentes vitais da célula microbiana 
(1) Iodo e compostos Iodados : 
• o iodo puro é um elemento cristalino preto azulado com brilho metálico, 
pouco solúvel em água mais altamente solúvel em álcool e iodeto de 
potássio ou sódio 
• tradicionalmente usado como agente anti-séptico. É um agente 
microbicida de alta eficiência contra todos as espécies bacterianas. É 
também esporicida, fungicida, virucida e amebicida 
 64 
• usados principalmente para assepsia da pele. Também desinfecta 
pequenas quantidades de água; na sanitificação de utensílios de 
alimentação; desinfecta o ar (vapores de iodo) 
• mecanismos de ação : destruição de compostos metabólitos essenciais 
dos microrganismos por meio de oxidação. Ex. inativação do aminoácido 
tirosina 
(2) Cloro e Compostos Clorados 
• o cloro na forma gasosa (Cl2) ou em combinações químicas representa 
um dos desinfetantes mais largamente utilizados 
• o gás comprimido em forma líquida é a escolha universal para a 
purificação de águas de abastecimento, pública, piscinas e estações de 
tratamento de água e esgoto. 
• pelo fato da díficil manipulação do cloro gasoso, se utiliza muito os 
compostos inorgânicos clorados, como os hipocloritos e cloraminas, esta 
última é mais estável, mais o cloro é liberado num período maior que 
nos hipocloritos 
• para ser efetivo a concentração do cloro deve atingir 0.5 a 1.0 ppm. Uma 
solução de hipoclorito 1% é usada como desinfetante doméstico; de 5 a 
12% como alvejantes e desinfetantes domésticos e como sanitificantes 
em instalações de laticíneos e indústrias de alimentos 
• mecanismo de ação : 
Cl2 + H2O ------- HCl + HClO 
HClO ------- HCl + O (poderoso agente oxidante que pode destruir subst. 
celulares) 
*o cloro pode também combinar diretamente com as proteínas celulares e destruir suas 
atividades biológicas 
4. Metais Pesados e seus Compostos - Hg, Pb, Zn, Ag, Cu 
 65 
• antigamente a água era armazenada em recipientes de prata (Ag) e 
cobre (Cu) pois as pessoas notavam que ali a água de beber era 
conservada 
• o HgCl2 era amplamente usado. Hoje tem sido substituído por outros 
agentes menos tóxico e e menos corrosivos 
*ação oligodinâmica - a capacidade de quantidade extremamente pequenas de 
certos metais, particularmente a prata de exercer efeito letal sobre as bactérias 
- acredita-se que a atividade desses íons metálicos se deve à inativação de 
certas enzimas que se combinam com o metal 
 
• compostos contendo Hg orgânico possuem maior atividade 
antomicrobiana e menos toxicidade que os inorgânicos - mercuriocromo, 
mertiolate 
• o sulfato de cobre é efetivo como um algicida em resíduos abertos de 
água e piscinas, tem também ação fungicida 
• mecanismo de ação : inativam as proteínas celulares combinando-se 
com alguns componentes da proteína 
Detergentes ou Surfactantes 
• compostos que diminuem a tensão superficial, utilizados para a limpeza 
de superfícies 
• a ação umectante deve-se ao fato de serem compostos anfipáticos 
(possuem uma parte polar e outra apolar), como por exemplo os sabões 
Quimicamente os detergentes são classificados em : 
1. Detergentes Aniônicos - a propriedade detergente do composto reside 
na porção aniônica. Ex. sabão - [C9H19COO]-Na+ 
 66 
2. Detergentes Catiônicos - a propriedade detergente do composto reside 
na porção catiônica. Ex. cloreto de cetilpiridínico - [Ar-N C16H33]+Cl- 
3. Detergentes Não-Iônicos - não ionizam quando dossolvidos na água. Ex. 
polissorbato 80; octoxinol. Não são antimicrobianos 
• muitos detergentes antimicrobianos pertencem ao grupo catiônico, dos 
quais os COMPOSTOS QUATERNÁRIOS DE AMÔNIO são mais 
largamente usados 
 
Compostos Quaternários de Amônio 
Estrutura Geral 
 
• são bactericidas (Gram-positivas e Gram-negativas) mesmo em 
concentrações muito baixas 
• apresentam uma combinação de propriedades que fazem dele um 
excelente anti-séptico, desinfetante e sanificante : 
1. baixa toxicidade 
2. alta solubilidade em água 
3. alta estabilidade em solução 
4. não são corrosivos 
• largamente aplicados em assoalhos, paredes e outras superfícies em 
hospital, enfermarias e outros estabelecimentos públicos. E também em 
equipamentos em instalações de processamento de alimentos 
• mecanismo de ação : desnaturação de proteínas das células, 
interferências com os processos metabólicos, e lesão da membrana 
citoplasmática 
Alguns desinfetantes, antisépticos e detergentes mais comumente usados 
 67 
Agente 
Químico 
Concentração 
(%) 
Aplicações 
Nível 
de Atividade 
Compostos 
Fenólicos 
0.5 - 3.0 desinfecção de objeto inanimado intermediário 
Álcoois 70 - 90 
antisepsia da pele, desinfecção 
de instrumento cirúrgico 
intermediário 
Iodo 1 
antisepsia da pele, pequenos 
cortes, desinfecção da água 
intermediário 
Compostos 
Clorados 
0.5 - 5.0 
desinfecção de água, superfícies 
não metálicas, equipamento de 
laticínios, materiais domésticos 
baixo 
Compostos 
Quaternários 
0.1 - 0.2 
saneamento ambiental de 
superfícies e equipamentos 
baixo 
Compostos 
Mercuricos 
1 
antisepsia da pele, desinfecção 
de instrumentos 
baixo 
* alta - mata todas as formas de vida microbiana, inclusive os esporos 
bacterianos intermediário - mata o bacilo da tuberculose, fungos e vírus, mais 
não os esporos bacterianos baixo - não mata esporos bacterianos, nem o 
bacilo da tuberculose ou os vírus em um tempo aceitável. 
Avaliação do poder antimicrobiano dos desinfetantes e anti-sépticos 
• o agente químico é testado contra um microrganismo específico 
(organismo-teste) - usualmente Staphylococcus aureus representando 
os Gram + ou Salmonella representando as Gram - 
• os 3 procedimentos amplamente usados no laboratório são : (1) técnica 
de diluição em tubo; (2) técnica de inoculação em placa; (3) técnica de 
coeficiente fenólico 
Esterilizantes Químicos 
• são particularmente utilizados para a esterilização de materiais medido 
sensíveis ao calor. Os principais são: 
1. Óxido de Etileno 
 68 
• líquidos a temperaturas abaixo de 10.8 oC, acima disso torna-se gás; 
• seus vapores são altamente irritantes para os olhos e a mucosa . 
• são inflamáveis mesmo a baixa concentração 
• tem um grande poder de penetração; atravessa e esteriliza o interior de 
grandespacotes com objetos, roupas e mesmo certos plásticos - as 
seringas descartáveis p. ex. 
• apresenta a desvantagem de agir a baixa velocidade, necessitando de 
várias horas de exposição para ser eficiente 
• utilizados rotineiramente para a esterilização de materiais médicos e 
laboratoriais. No programa espacial pelos cientistas americanos e russos 
para a descontaminação dos compostos das naves espaciais 
• mecanismos de ação : inativa as enzimas e outras proteínas que tem 
átomos de hidrogênio lábeis (grupos sulfidrilas 
2. ß-Propiolactona 
• líquido incolor em temperatura ambiente; p.e = 155 oC; não é inflamável; 
e causa bolhas quando em contato com a pele e irritação nos olhos 
• é bactericida, esporicida, fungicida e viricida 
• não apresenta poder de penetração, mais é considerado mais ativo 
contra os microrganismos que os óxidos de etileno. Ex. é necessário 2 a 
5 mg/l de ß-propiolactona para fins de esterilização de material, contra 
400 a 800 mg/l do óxido de etileno 
• desvantagem: além de seu baixo poder de penetração provavelmente 
apresente propriedades carcinogênica, o que torna seu uso como 
esterilizante restringido 
3. Glutaraldeído 
• líquido oleoso, incolor; e 2% já tem um largo espectro de atividade 
antimicrobiana 
• efeito contra vírus, células vegetativas e esporuladas de bactérias e 
fungos 
• utilizado na medicina para esterilizar instrumentos urológicos, 
equipamentos respiratórios 
 69 
4. Formaldeído 
• um gás que se mostra estável somente em alta concentração e 
temperatura 
• extremamente tóxico e seus vapores intensamente irritantes à mucosa 
• em temperatura ambiente polimeriza-se formando uma substância sólida 
incolor (paraformaldeído) que libera o formaldeído pelo aquecimento 
• o formaldeído em solução é utilizado para desinfecção de certos 
instrumentos. Na forma gasosa pode ser utilizado para desinfecção e 
esterilização de áreas fechadas 
• mecanismo de ação : inativação de constituintes celulares (proteínas e 
ácidos nucleícos) 
Mecanismos de ação de vários compostos químicos antimicrobianos em célula 
bacteiana : 
 
 
 
 
 
 70 
 
 
 
5 DILUIÇÃO EM SÉRIE 
 
A semeadura em placas ou plaqueamento revela o número de células capazes 
de se multiplicarem e formarem colônias em meios de cultivo apropriados e sob 
condições de incubação adequadas. Cada colônia desenvolvida é suposta ter 
sido originada a partir de uma unidade viável, a qual pode ser um organismo ou 
muitos. 
Como para uma maior precisão da análise somente deverão ser contadas as 
placas com número de colônias entre 30 e 300, uma diluição da amostra 
deverá ser feita antes de se proceder a sua mistura com o meio de cultura para 
obter um crescimento adequado na placa. 
 
PROCEDIMENTO PRÁTICO: 
 
1- Preparar a amostra de solo (macerado): com 5g de solo diluído em 50ml 
de água destilada; 
2- Tomar 1ml da amostra e transferir para um tubo de cultura com 9ml de 
água destilada (diluição 1:10 ou 10-¹); 
3- Homogeneizar o tubo; 
4- Pipetar 1ml da diluição anterior para outro tubo com 9ml de água 
destilada e ter-se-á uma diluição 1:100 ou 10-²; 
5- Pipetar 1ml da diluição anterior para outro tubo com 9ml de água 
destilada e ter-se-á uma diluição 1:1000 ou 10-³; 
6- Aplicar 1ml de cada tubo a uma placa respectiva contendo ágar. Levar a 
estufa e observar crescimento de colônias (24 a 48h). 
 
CURSO DE TECNOLOGIA EM SANEAMENTO AMBIENTAL 
DISCIPLINA: MICROBIOLOGIA 
AULA 05 : DILUIÇÃO EM SÉRIE 
Profª.: JOSIANA LAPORTI 
 
TURMA: ________ DATA: ________ 
ALUNO: __________________________________________________ 
 71 
OBS: diluições maiores podem ser obtidas tomando-se 1ml de cada diluição 
sucessiva e colocando em tubos com 9ml de água destilada, até se atingir a 
diluição desejada. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 72 
 
 
 
 
 
6 ANÁLISE BACTERIOLÓGICA DA ÁGUA 
Introdução 
O reconhecimento da importância sanitária da qualidade da água e a 
consequente aplicação de medidas de tratamento tem trazido inestimáveis 
benefícios para a saúde do homem. A qualidade microbiológica da água pode 
ser determinada por análises bacteriológicas. Microorganismos patogênicos 
(Salmonella typhi, Vibrio cholerae, Shigella dysenteriae, vírus da hepatite, entre 
outros) podem ser isolados de águas contaminadas, usando- se procedimentos 
trabalhosos e demorados. É impraticável pesquisar, rotineiramente, todos os 
patógenos que possivelmente são veiculados pela água. Assim, o controle 
microbiológico da qualidade da água é feito determinando-se a presença de 
microorganismos de origem fecal cuja presença indica poluição da água por 
dejetos humanos e animais. 
 
Dos indicadores de contaminação fecal, o que tem maior aceitação é o grupo 
das bactérias coliformes. Esse grupo é definido pelas seguintes 
características: bastonetes, Gram-negativos, não formadores de esporos, 
aeróbios ou anaeróbios facultativos, com capacidade de fermentar a lactose 
com produção de ácido e gás em 48 horas a 35° C. O grupo coliforme é 
heterogêneo e representado pelos gêneros Escherichia, Enterobacter, 
Klebsiella e Citrobacter. 
 
Para identificar contaminação fecal recente utilizam-se como indicadores de 
contaminação os coliformes termotolerantes (fecais), que possuem como 
habitat exclusivo o intestino de animais homotérmicos, e cujo representante 
mais importante é Escherichia coli. Os coliformes termotolerantes são aqueles 
que fermentam a lactose com produção de gás quando incubados à 44,5 - 45° 
C por 24 horas. 
CURSO TECNÓLOGO EM SANEAMENTO AMBIENTAL 
DISCIPLINA: MICROBIOLOGIA 
AULA PRÁTICA 6: ANÁLISE BACTERIOLÓGICA DA ÁGUA 
Profª.: Josiana Laporti 
TURMA:____________ DATA: ________ 
 
73 
 
 
A análise padrão de água consiste de teste presuntivo, pesquisa de coliformes 
totais, coliformes termotolerantes e Escherichia coli. A observação de resultado 
positivo ou negativo obtidos em cada teste é essencial para evidenciar a 
presença ou a ausência de contaminantes numa amostra de água. 
74 
 
OBJETIVO 
Executar teste presuntivo de análise bacteriológica da água. 
 
Procedimentos para o exame de Coliformes totais 
 
Método dos tubos múltiplos 
 
Material necessário: 
 
a) tubo de ensaio. 
b) estante para tubo de ensaio. 
c) tubo de Durhan. 
d) pipeta graduada de 10 mL. 
e) pipeta graduada de 1 mL. 
f) bico de Bunsen. 
g) caldo Lactosado. 
l) estufa bacteriológica. 
 
EXECUÇÃO DO TESTE 
 
 
Procedimentos para coleta em residências 
a) lavar as mãos com água e sabão; 
b) limpar a torneira do usuário com um pedaço de algodão em bebido em álcool; 
c) abrir a torneira e deixar escorrer a água durante 1 ou 2 minutos; 
d) fechar e flambar a torneira; 
e) abrir novamente a torneira e deixar escorrer por mais 2 ou 3 minutos; 
f) coletar a amostra de água; 
g) encher com pelo menos ¾ de seu volume; 
h) tampar o frasco Identificá-lo, anotando endereço, à hora e a data da coleta, o 
estado do tempo, o nome do coletor, etc; 
75 
 
i) marcar o frasco com o número da amostra, correspondente ao ponto de coleta; 
j) preencher a ficha de identificação da amostra de água; 
k) colocar o frasco da amostra na caixa de isopor com gelo; 
l) lacrar, identificar e enviar a caixa para o laboratório. 
 
OBS: O tempo de coleta e a realização do exame não devem exceder 24 horas. 
 
Nota: Além de residências as amostras podem ser coletadas em hospitais, escolas, torneiras públicas, etc, o 
procedimento é o mesmo acima. Segundo a CETESB antes dacoleta, a torneira pode ser flambada, se 
necessário. Entretanto, esse procedimento não é muito aconselhável, pois além de provocar danos às 
torneiras, comprovou-se não ter efeito letal sobre as bactérias. Atualmente o processo de flambagem é 
opcional. A CETESB e o Standard Methods recomendam utilizar solução de hipoclorito de sódio a 
100 mg/l e utilizando esse procedimento deve-se remover completamente o hipoclorito, antes da coleta. 
 
 
Fases do procedimento 
 
OBS: Coletar cerca de 400 ml. 
 
 
76 
 
Teste presuntivo 
a) tomar uma bateria contendo 15 tubos de ensaio distribuídos de 5 em 5; 
b) nos primeiros 5 tubos, (os que contêm caldo lactosado de concentração dupla) 
inocular com pipeta esterilizada, 10 ml da amostra de água a ser examinada, em 
cada tubo. (Diluição 1:1); 
c) nos 10 tubos restantes (os que contêm caldo lactosado de concentração 
simples), inocular-nos 5 primeiros, 1ml da amostra (Diluição 1:10) e nos 5 últimos 
tubos, inocular 0,1 ml da amostra, em cada tubo. (Diluição 1:100). Ver página 15; 
d) misturar; 
e) incubar a 35 ± 0,5º C durante 24/48 horas; 
f) se no final de 24/48 horas, houver a formação de gás dentro do tubo de Durhan, 
significa que o teste Presuntivo foi Positivo. Neste caso, fazer o teste confirmativo. 
Se não houver a formação de gás durante o período de incubação, o exame 
termina nesta fase e o resultado do teste é considerado negativo. 
 
Teste confirmativo 
a) tomar o número de tubos do Teste Presuntivo que deram Positivos (Formação 
de gás) nas 3 diluições 1:1; 1:10 e 1:100; 
b) tomar igual número de tubos contendo o meio de Cultura Verde Brilhante Bile a 
2%; 
c) com a alça de platina, previamente flambada e fria, retirar de cada tubo positivo 
uma porção de amostra e inocular no tubo correspondente contendo o meio Verde 
Brilhante. Este procedimento chama-se repicagem; 
d) identificar os tubos; 
e) incubar durante 24/48 horas a 35 ± 0,5ºC; 
f) se no final do período de 24/48 horas houver a formação de gás dentro do tubo 
de Durhan o teste é considerado Positivo. Caso não haja formação de gás, o teste 
é considerado negativo. 
 
 
 
77 
 
 
 
 
 
Sequência de execução de Análise Bacteriológica 
Amostra 
 
 
 
 
Teste Presuntivo 
Caldo LST (35°C/48h) 
Produção de gás: 
Evidência de coliformes 
	
  
 
Análise continua 
 
Caldo LST (35°C/48h) 
Gás ausente: 
Ausência de coliformes 
	
  
 
Análise concluída 
 
 
Detecção de Coliformes totais 
Caldo Lactose – Bile Verde Brilhante (BGLB) 
Incubar a 35 ± 2° C/ 48h 
Produção de gás: 
Coliformes presentes 
Meio inibe outros fermentadores de lactose. 
Detecção de Coliformes Termotolerantes e 
Escherichia coli 
Coliformes Termotolerantes 
Tubos LST positivos 
Repicados em Caldo EC 
Incubar a 44,5 ± 0,1°C/24h 
Produção de gás 
Escherichia coli 
Tubos EC positivos repicados em 
ágar EMB (estrias) 
Incubar a 35°C/48 Horas 
Colônias escuras de 2 a 3 mm, 
com brilho verde metálico 
78 
 
 
 
 
6.1 COLIFORMES TOTAIS 
 
Material necessário: 
 
a) tubo de ensaio. 
b) estante para tubo de ensaio. 
c) tubo de Durhan. 
d) pipeta graduada de 10 mL. 
e) pipeta graduada de 1 mL. 
f) bico de Bunsen. 
g) caldo Lactosado de concentração dupla. 
h) caldo Lactosado de concentração simples. 
i) caldo Lactosado Verde Brilhante Bile a 2%. 
j) água de diluição. 
k) alça de platina. 
l) estufa bacteriológica. 
 
Procedimento prático: 
 
Teste presuntivo 
a) tomar uma bateria contendo 15 tubos de ensaio distribuídos de 5 em 5; 
b) nos primeiros 5 tubos, (os que contêm caldo lactosado de concentração dupla) 
inocular com pipeta esterilizada, 10 ml da amostra de água a ser examinada, em 
cada tubo. (Diluição 1:1); 
CURSO DE TECNOLOGIA EM SANEAMENTO AMBIENTAL 
DISCIPLINA: MICROBIOLOGIA 
AULA 06/1 : TUBOS MÚLTIPLOS – COLIFORMES TOTAIS 
Profª.: JOSIANA LAPORTI 
 
TURMA: ________ DATA: ________ 
ALUNO: __________________________________________________ 
79 
 
c) nos 10 tubos restantes (os que contêm caldo lactosado de concentração 
simples), inocular nos 5 primeiros, 1 ml da amostra (Diluição 1:10) e nos 5 últimos 
tubos, inocular 0,1 ml da amostra, em cada tubo. (Diluição 1:100); 
d) misturar; 
e) incubar a 35 ± 0,5º C durante 24/48 horas; 
f) se no final de 24/48 horas, houver a formação de gás dentro do tubo de Durhan, 
significa que o teste Presuntivo foi Positivo. Neste caso, fazer o teste confirmativo. 
Se não houver a formação de gás durante o período de incubação, o exame 
termina nesta fase e o resultado do teste é considerado negativo. 
 
Observação: No lugar do caldo Lactosado pode ser usado o caldo Lauril Triptose. 
 
Teste confirmativo 
a) tomar o número de tubos do Teste Presuntivo que deram Positivos (Formação 
de gás) nas 3 diluições 1: 1; 1:10 e 1:100; 
b) tomar igual número de tubos contendo o meio de Cultura Verde Brilhante Bile a 
2%; 
c) com a alça de platina, previamente flambada e fria, retirar de cada tubo positivo 
uma porção de amostra e inocular no tubo correspondente contendo o meio Verde 
Brilhante. Este procedimento chama-se repicagem; 
d) identificar os tubos; 
e) incubar durante 24/48 horas a 35 ± 0,5ºC; 
f) se no final do período de 24/48 horas houver a formação de gás dentro do tubo 
de Durhan o teste é considerado Positivo. Caso não haja formação de gás, o teste 
é considerado negativo. 
 
Expressão dos resultados: 
 
a) os resultados são expressos em N.M.P (Número Mais Provável) /100 ml de 
amostra. 
80 
 
b) para se determinar o N.M.P, verifica-se a combinação formada pelo número de 
tubos positivos que apresentaram as diluições 1:1; 1:10 e 1:100 no Teste 
Confirmativo. 
 
Exemplo: 
a) nos 5 tubos da diluição 1:1, obtiveram-se 3 tubos positivos; 
b) nos 5 tubos da diluição 1:10, obtiveram-se 2 tubos positivos; 
c) nos 5 tubos da diluição 1:100, obteve-se 1 tubo positivo; 
d) formou-se, portanto, a combinação 3-2-1; 
d) determina-se o N.M.P consultando a tabela 1 (pág. 22 Manual FUNASA). 
Se não quiser trabalhar com 15 tubos para determinar o NMP fazer apenas 5 
tubos na diluição 1:1 (10 ml do meio de cultura + 10 ml da amostra) e calcular o 
N.M.P consultando a tabela 2 (pág. 23 Manual FUNASA). 
 
 
81 
 
 
 
 
 
7 COLIFORMES TERMOTOLERANTES 
 
Material necessário: 
a) tubos de ensaio com Meio EC; 
b) bico de Bunsen; 
c) alça de platina; 
d) banho-maria. 
 
Procedimento prático: 
a) tomar todos os tubos do Teste Presuntivo que deram Positivos (Formação de 
gás) e todos os tubos negativos em que houve crescimento após 48 horas, nas 3 
diluições (1:1; 1:10 e 1:100); 
b) transferir, com alça de platina flambada e fria, uma porção para os tubos de 
ensaio contento o meio EC; 
c) misturar e deixar todos os tubos em banho de água durante 30 minutos; 
d) incubar em banho-maria a 44,5 ± 0,2º C durante 24 ± 2 horas; 
e) se no final de 24 horas ou menos houver a formação de gás, está indicado a 
presença de coliformes de origem fecal; 
f) calcular o N.M.P consultando a tabela 1 (pág. 22 Manual FUNASA). 
 
Nota: Este ensaio deve ser realizado simultaneamente com o Teste Confirmativo 
para Coliformes Totais. 
CURSO DE TECNOLOGIA EM SANEAMENTO AMBIENTAL 
DISCIPLINA: MICROBIOLOGIA 
AULA 07 : TUBOS MÚLTIPLOS – COLIFORMES TERMOTOLERANTES 
Profª.: JOSIANA LAPORTI 
 
TURMA: ________ DATA: ________ 
ALUNO: __________________________________________________ 
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Observação: Fazer sempre este exame toda vez que forem realizados testes 
confirmativo para coliformes totais.