AULA TEORICA 2 (Métodos de estudo em Biologia Celular)[45]

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Prof. Dra. Creucí Maria Caetano
2019
Métodos de estudo em 
Biologia Celular 
• Técnicas e métodos de estudo da
célula: evolução e diversificação
desde a invenção do microscópio,
no século XVII
• Antoine van Leeuwenhoek e Robert
Hooke: anterior à definição do
conceito de célula
Microscópio de Antoine van Leeuwenhoek, século XVII.
Microscópio composto,
de Robert Hooke. a e b:
espelhos; c: fonte de
iluminação (chama); d:
lente convergente da luz
sobre o objeto; f:
imagem de uma película
de cortiça, onde se
identificam as “células”.
Exploração das 
potencialidades do 
microscópio ótico (MO): 
concepção de que os 
seres vivos são 
constituídos por 
unidades morfológicas e 
funcionais – célula 
Microscopia óptica ou fotônica ou de
luz: consiste em um conjunto de técnicas
sequenciais e complementares que visam
não só a observação de células ou tecidos
de seres vivos mas, também a preparação
prévia desses materiais e a captura de
imagens para posterior observação.
O MO é um sistema óptico
capaz de fornecer uma imagem
ampliada de um objeto,
permitindo a observação de
detalhes invisíveis a olho nu. É
constituído basicamente por dois
conjuntos de lentes: o
conjunto objetiva e o
conjunto ocular.
MO - partes mecânicas: platina ou mesa (com
presilhas), pé, braço, charriot ou carro, canhão
e revólver
MO - partes ópticas: ocular e objetiva
(sistemas de lentes em contato com o olho e
com o objeto, respectivamente), condensador,
diafragma e fonte de luz (espelho ou lâmpada -
luz artificial direta)
MO ou microscópio fotônico; esquema óptico de
formação de imagem
MO: unidade de medida é o
micrômetro (µm), que corresponde à
milésima parte do milímetro (1 µm =
0,001 mm)
À microscopia óptica –
microscopia fotônica ou de
luz – invenção de outras
microscopias (microscopia
eletrônica) e de técnicas
complementares
(histológicas, citoquímicas,
histoquímicas): estudo
estrutural da célula até ao
nível macromolecular
Estudo das células
métodos ópticos 
(exame morfológico 
dos componentes 
celulares), 
citoquímicos e 
histoquímicos 
(conhecimento da 
composição de suas 
estruturas)
• Preparações citológicas: várias etapas ou
processos, associados a técnicas que
permitem melhor visualização
• Coleta do material biológico: deve atender à
especificidade de cada célula ou tecido, para
ser devidamente preparado
• Preparação do material
O estudo das células in 
vivo, também chamado 
exame vital, pode ser 
feito observando a 
célula diretamente, sem 
coloração, ou 
empregando um corante 
Exame vital: 
empregado para o estudo 
de células livres em meio 
líquido, de células 
isoladas de fragmentos 
de tecidos, de células de 
membranas, ou de partes 
transparentes de animais 
(ex., larvas de peixes e 
anfíbios) 
• Para a coloração destas células 
usam-se o verde Janus, o vermelho 
neutro e o azul de metileno
• Pelo fato de não matarem a célula, 
são denominados corantes vitais
O estudo das células 
mortas consiste na 
preparação de delgadas 
fatias de tecidos, 
dispostas sobre lâminas 
de vidro e com 
espessura tal que 
permita a passagem da 
luz (células estudadas 
por transparência)
Montagem total: consiste em coletar um material fino ou 
transparente o suficiente (ex. túbulos de Malpighi e glândulas 
salivares de insetos, ricas em células e matriz extracelular) para 
ser depositado diretamente sobre uma lâmina de vidro e se 
proceder a fixação e coloração; vantagem: obtenção de células 
inteiras, para medições e quantificações
Espalhamento: consiste em 
promover uma raspagem das 
camadas superficiais de 
membranas mucosas (ex. bucal) 
com auxílio de uma espátula ou 
palitos e, posteriormente, deslizar 
sobre a superfície limpa de uma 
lâmina de vidro o material aí 
contido. As células permanecem 
inteiras, porém nem sempre 
mantêm sua morfologia intacta 
Pode-se fazer a coloração simultânea, ou realizá-la depois, retirando-
se a lamínula por meio de nitrogênio líquido. Muito eficiente para 
estudos de divisão celular. Também permite estudar núcleos inteiros, 
quantificar DNA e proteínas nucleares. 
Esmagamento: 
consiste em esmagar, 
entre lâmina e 
lamínula, o material a 
ser analisado (ex. 
fragmentos de 
anteras para 
observação de 
células-mãe-do-
pólen). 
Esfregaço: consiste em colocar uma gota de um fluido corpóreo
(sangue, linfa, ...) a ser analisado em fina camada sobre uma
lâmina e, com auxílio de outra lâmina, promover o deslizamento
do líquido sobre a primeira, formando uma camada com células
isoladas sobre o vidro
Técnica de cortes histológicos: consiste na 
fixação do material biológico, obtenção de 
cortes extremamente finos e coloração sobre 
uma lâmina
Corte: tecidos vegetais lâmina de corte ou 
bisturi, ou micrótomo; tecidos animais é feito 
com micrótomo
Micrótomo rotativo manual 
é utilizado em cortes 
histológicos para MO
Ultramicrótomo para ME 
Etapas da técnica de cortes 
histológicos
1 Coleta do material biológico
• Etapa de grande importância pois são 
definidas as formas de análises dos preparados 
citológicos
• Os diferentes tipos de matérias exigem 
diferentes métodos; vegetal (pólen, folhas e 
raízes); animal (sangue, espermatozóides, 
tecidos) 
2 Fixação
Fixação
Fixação: física (calor, congelamento) ou 
química (por líquidos fixadores como o 
álcool, o formol e o ácido acético)
3 Desidratação
4 Diafanização ou clareamento 
Diafanização ou clareamento 
Cortes são imersos em parafina líquida a 60oC 
(historresina, gelatina), que penetra nos 
tecidos, dando-lhes, após solidificada, certa 
dureza (*congelamento) 
5 Inclusão
Inclusão
Após, deposita-se no interior de uma caixinha de papel
ou plástico com parafina fundida; em temperatura
ambiente, formará um bloco sólido
6 Microtomia
Microtomia
Microtomia
Bloco de parafina contendo o 
tecido é colocado no aparelho e 
cortado
Cortes depositados em vasilha 
com água morna (para derreter a 
parafina)
7 Colagem do corte na lâmina
Colagem do corte na lâmina
Coleta dos cortes de 
tecido com um pincel 
ou pinça, que são 
colocados em lâmina 
de vidro para a 
coloração
8 Coloração
Aplicação de substâncias corantes aos tecidos 
ou células (azul de metileno, lugol, nitrato de 
prata, verde Janus B, fucsina, tetróxido de 
ósmio, carmim, safranina, vermelho congo, 
hematoxilina e eosina)
Coloração
Coloração
9 Desidratação
10 Montagem
Montagem
Técnicas de coloração não 
diferencial e diferencial 
(bandeamento cromossômico) 
são empregadas na 
Citogenética Clássica
Citogenética 
Molecular: 
fluorocromos
Cultivo de células animais
Conjunto de técnicas que 
permitem cultivar ou manter 
células isoladas fora do 
organismo onde existem, 
mantendo as características 
próprias; 
Podem ser: tecidos humanos, 
animais e vegetais;
Cultivo de células animais
A cultura de tecidos implica a 
prévia desagregação (mecânica 
ou enzimática) do tecido original 
e em que as células são 
cultivadas numa camada 
aderente, num substrato sólido 
ou em suspensão em meio de 
cultura
Dois tipos de cultura celular
Cultura primária: preparada diretamente 
de tecidos de um organismo; um passo 
inicial de fracionamento das células
Cultura secundária: células cultivadas 
foram retiradas de uma cultura primária, 
podendo ser repetidamente subcultivadas 
desta forma, por semanas ou meses.
Usos
• Bioengenharia 
• Diferenciação Celular 
• Metabolismo Celular 
• Interação Celular 
• Transplantes de Tecidos 
• Terapia Celular 
• Produção de Hormônios 
• DiagnósticoLaboratorial 
• Produção de Vacinas 
• Estudos de Biocompatibilidade
Meio de cultura
Conjunto de fatores capazes de reproduzir um 
microambiente capaz de simular as condições 
fisiológicas de um organismo multicelular em 
seu âmbito tridimensional, o que permite o 
cultivo de células
A escolha do meio de cultivo depende do tipo 
celular a ser cultivado
Meio de Cultura
•Conjunto de fatores capazes de reproduzir um microambiente capaz de simular as 
condições fisiológicas de um organismo multicelular em seu âmbito tridimensional, o 
que nos permite o cultivo de células; A escolha do meio de cultivo depende do tipo 
celular a ser cultivado;