Aula 5 Patogênese viral 2

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Patogênese viral
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Replicação do Genoma Viral
Especificas de acordo com o tipo de vírus (DNA ou RNA)
Vírus DNA
dependente da estrutura celular para codificação das proteínas
replicação do genoma ocorre no núcleo celular
Exceções – replicação do genoma no citoplasma
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Replicação do Genoma Viral
Vírus RNA
Replicação no citoplasma e mediado por enzimas polimerases de RNA (transcriptase ou replicases). 
Polaridade positiva - tradução ocorre CITOPLASMA
Polaridade negativa - a enzima RNA é transportada até o genoma e auxiliará na transcrição do RNA mensageiro
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POLARIDADES DO RNA E INFECÇÃO
Os vírus RNA de polaridade negativa não são considerados infecciosos.
A enzima polimerase de RNA deve ser carreada para dentro do genoma - ocorre a transcrição do RNA mensageiro e posterior tradução.
Os vírus RNA de polaridade positiva são considerados infecciosos. 
A fita de RNA positiva é suficiente para que ocorra tradução.
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Etapas da Replicação Viral
Durante a formação do capsídeo - incorporação do genoma no seu interior
Vírus Envelopado
Lipídios e fosfolipídio – célula hospedeira
Proteínas – codificadas genoma viral
Morfogênese
Formação do capsídeo logo após a replicação genoma.
formado pela união de subunidades proteicas (protômeros) - a unidade morfológica do capsídeo (capsômeros)
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Etapas da Replicação Viral
Vírus Envelopado
Membrana do retículo endoplasmático 
Membrana plasmática (brotamento)
Maturação e Egresso da progênie viral
Inicia com finalização da morfogênese da estrutura viral e egresso para o meio extracelular
Locais da maturação depende:
Tipo de vírus – ENVELOPE/ SEM ENVELOPE
Classe viral – DNA/ RNA
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Etapas da Replicação Viral
Partícula vírica adquire o envelope na membrana plasmática
egresso correrá em seguida do brotamento
Vírus sem envelope
egresso por lise celular
Mecanismos do Egresso
Lise
 Exocitose e associado com o brotamento 
Brotamento nas membranas celulares internas
egresso - exocitose
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Diagnóstico Virológico
Diagnóstico Laboratorial
Etapa complementar da investigação clínica e epidemiológica da enfermidade 
Sucesso depende:
Ação do profissional de campo
investigação clinico-patológica, epidemiológica
Material para diagnóstico
coleta
identificação 
envio
Diagnóstico Laboratorial
Laboratório:
Qualificação técnica
Método de diagnóstico adequado
Isolamento e identificação viral
Quantidade de material para pesquisa
Interpretação dos resultados 
Informações de epidemiologia, patogenia e imunologia da doença suspeita
Diagnóstico Laboratorial
Diferentes métodos podem detectar o agente viral
Métodos Detecção Viral
Direta – isolamento do agente ou material genético
Indireto - propriedades biológicas ou produtos decorrentes da multiplicação viral
Diagnóstico Laboratorial
Diferentes métodos podem detectar o agente viral
Em determinados casos:
utilização de dois ou mais métodos de eleição para um diagnóstico definitivo
Diagnóstico Laboratorial
Compreender a cinética da infecção viral em conjunto com a resposta imunológica do organismo animal é importante para estabelecer o exame laboratorial mais adequado e o tipo de material biológico nas diferentes fases da infecção viral.
Infecção viral, resposta imunológica e indicação do momento de coleta de material para diagnóstico laboratorial
Coleta de amostras
Escolha do tipo de amostra biológica
Quantidade suficiente para a técnica laboratorial
Procedimentos colheita
Assepsia antes, durante e após coleta
Evitar contaminação
Protocolo de coleta
Conservação adequada
Recipientes corretos
Soluções para manter integridade do agente
Temperaturas adequadas
Identificação correta
Transporte adequado
evitar ruptura ou quebra do recipiente
Conservação e Transporte Amostra
Manter armazenadas em condições de baixa temperatura 
Encaminhar ao laboratório de forma mais rápida
Entre 2 a 3 dias - transportadas sob refrigerado a 4ºC
>3 dias - congelamento das amostras -20ºC ou -70ºC
Amostras sanguíneas
Não congelar
Transporte à 4ºC
Transporte
Caixas isotérmicas com revestimento interno impermeável
Protocolo amostra –relatório técnico
Informações para auxiliar laboratório
Procedimentos adotados para encaminhamento de diferentes materiais biológicos para análise laboratorial - Fonte: adaptado de Flores (2012).
De acordo com o tipo de material biológico: 
Procedimentos variam para adequarem ao método de diagnóstico de eleição.
Interpretações dos resultados
em conjunto com o histórico clínico gerado pelo profissional de campo.
MÉTODOS DE DIAGNÓSTICOS
Importância Diagnóstico
Confirmação da presença do agente viral
Direcionar ações adequadas no tratamento da enfermidade 
Prevenção de futuras infecções virais
Classificação Métodos Diagnósticos
DIRETOS
Microscopia eletrônica
Isolamento em cultivo celular
Detecção de antígenos “imunofluorescência”
Imunoperoxidase
Imunoenzimáticos
Cromatográficos
Detecção de ácidos nucleicos “reação da polimerase em cadeia”
Classificação Métodos Diagnósticos
Testes sorológicos
Imunodifusão em gel de ágar
ELISA 
Soroneutralização
INDIRETOS
Fixação do complemento
Inibição da hemoglutinação
Imunofluorescência para anticorpos 
Cromatografia
CRITÉRIOS NA ESCOLHA DO MÉTODO DIAGNÓSTICO
Sensibilidade 
Especificidade
 Rapidez
Simplicidade
 
Reprodutibilidade
 
Automação 
 Baixo custo 
Dois métodos empregados na rotina de laboratório e que emitem resultados confiáveis: 
Imunocromatografia
Reação em cadeia pela polimerase.
Imunocromatografia
Apresentados em dispositivos portáteis em material plástico – VÁRIOS FORMATOS
Imunocromatografia de fluxo lateral
Imunocromatografia de dupla migração
Imunoconcentração ou de fase sólida
Imunocromatografia
Princípio do teste:
Reação antígeno-anticorpo
A amostra suspeita coma partícula vírica reagirá com o anticorpo específico
Positivo - parecimento de bandas ou focos de coloração diferenciada. 
Imunocromatografia
Vantagens:
simplicidade 
baixo custo
Reação em cadeia pela polimerase PCR
Princípio do teste:
Amplificação do número de moléculas de ácidos nucleicos existente na amostra.
Aplicado para diagnóstico de qualquer agente viral em qualquer fase da infecção viral
contenha moléculas ou fragmentos de ácido nucleico
Reação em cadeia pela polimerase - PCR
Vantagens:
Obtenção dos resultados em poucas hora
Alta sensibilidade e especificidade
Aplicabilidade em amostras 
processos inadequados de armazenamento 
pouco material biológico
Características do PCR
Depende de um gradiente de temperatura em três etapas: 
Desnaturação - 95ºC
Anelamento - 57ºC
Extensão- 72ºC
Materiais do processo de amplificação são:
Amostra - material biológico
Primers – indicadores de oligonucleotídeos
Taq DNA polimerase - enzima
Nucleotídeos (dNTPs– Adenina, citosina, guanina e tamina)
Quantidade suficiente da sequência alvo - 36 ciclos
Primers: indicadores inicias constituídos de oligonucleotídeos que delimitam a região-alvo a ser amplificada na fita do ácido nucleico.
Etapas do PCR
Primeira etapa:
 Amostra submetida a um processo de desnaturação à 95ºC
separação da hélice da molécula de ácido nucleico 
Segunda etapa:
Temperatura é reduzida - anelação dos primers à 57ºC
delimita a região-alvo que irá ocorrer a amplificação 
Etapas do PCR
Terceira etapa: 
Temperatura é elevada a 72ºC 
Enzima termoestável (Taq DNApolimerase) insere os nucleotídeos na região-alvo - formação das cadeias complementares
Realização do primeiro ciclo - total de 36
Características do PCR
Avanços tecnológicos:
 
PCR aperfeiçoado com novos procedimentos
nested-PCR, multiplex-PCR, RT-PCR ereal-time PCR. 
PCR em tempo real
executado a campo 
utilização de termocicladores portáteis - acoplados em computadores e com auxílio de um software capta e quantificao sinal emitido de cada ciclo. 
detecta, quantifica e amplifica a molécula do ácido nucleico no decorrer do processo – presença primer e substâncias (fluoróforos)
1. O _______________________ é uma etapa complementar da
investigação clínica e epidemiológica da enfermidade em auxilia na detecção do agente viral.
Assinale a alternativa correta que completa as lacunas:
a) Tipo de animal.
b) Diagnóstico laboratorial.
c) Processo de desnaturação das amostras.
d) Processo viral.
e) Processo incompleto de penetração.
2. O profissional de campo deve possuir conhecimentos suficientes para determinar a escolha do _________________ a ser encaminhado, bem como os procedimentos adotados de __________________ e_________________ das amostras.
Assinale a alternativa correta que completa as lacunas:
a) Material biológico, acondicionamento e conservação.
b) Tipo de partícula vírica, acondicionamento e conservação.
c) Tipo de frasco, acondicionamento e conservação.
d) Processo de higiene, conservação e material biológico.
e) Tipo de processo de conservação, acondicionamento e material
biológico.
3. Para a coleta de plasma sanguíneo pode-se utilizar tubos com________, _______ e/ou ________, e para coleta de soro utiliza-se tubos ___________________.
Assinale a alternativa correta que completa as lacunas:
a) EDTA, citrato ou heparina e sem anticoagulantes.
b) EDTA, citrato ou heparina e com anticoagulantes.
c) Hepariana, citrato ou EDTA e com anticoagulantes.
d) Citrato, EDTA ou citrato e com anticoagulantes.
e) Dióxidos de carbono, EDTA ou heparina e sem anticoagulantes.