Roteiro Diluiçao

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Unicesumar – Centro Universitário Cesumar
	
Aula prática de Imunologia
Prof. Juliana Cogo Capriolli
Unicesumar – Centro Universitário Cesumar
	
Amostras biológicas utilizadas na imunologia
Soro
Plasma
Sangue total (fenotipagem e testes rápidos)
Outros: 
Urina – determinação hormonal ou de drogas.
Líquido cefalo raquidiano (LCR) – pesquisa de antígenos bacterianos, virais e parasitários, pesquisa de anticorpos.
Líquido amniótico – pesquisar a presença de patógenos no estudo de infecções congênitas
Sêmen – pesquisa de anticorpos antiespermatozoides
Saliva – determinação de hormônios
Fatores que podem interferir no resultado
Idade, sexo, etnia, gravidez, exercício físico, uso de medicamentos e janela imunológica.
Dieta, jejum, fumo, álcool.
Idade - Importante na determinação de hormônios, proteínas e imunoglobulinas. Em amostras de idosos se observam com maior frequência gamopatias, ativação policlonal de linfócitos B, doenças auto-i munes, e com isso há maior frequência de resultados falso positivos.
Gravidez - Ocorrência de interações inespecíficas maior em gestantes do que para a população não gestante. Há um aumento de hCG, lactogênio placentário, cortisol e hormônios tireoidianos.
Jejum recomendado
4 a 8 horas. Quilomícrons (moléculas grandes de lipoproteína) e amostra hiperlipêmicas podem interferir nos resultados.
Soro e Plasma
Várias dosagens imunológicas podem ser realizadas no SORO (obtido a partir de sangue sem anticoagulantes) ou no PLASMA (obtido de sangue com anticoagulantes). A única diferença analítica entre soro e plasma é que o primeiro não contém fibrinogênio, o qual foi utilizado para a formação do coágulo (fibrina). 
Estas amostras podem ser refrigeradas por até 3 dias ou congeladas por vários meses até a sua análise, sem que haja prejuízo no resultado dos testes.
Para as análises bioquímicas do sangue, quando se trata de análise de soro, são utilizados tubos de ensaio de 5mL ou 10mL sem anticoagulante. Para obtenção de plasma, os tubos de ensaio de 5mL ou 10 mL já devem conter o anticoagulante. 
Antes da centrifugação, as amostras de sangue devem ser contrabalançadas com tubos preenchidos com água para depois serem centrifugadas por 15 minutos a 2500 rpm em centrífuga clínica. O soro ou plasma das amostras é separado com a ajuda de uma pipeta e colocado em microtubo tipo eppendorf identificado.
Diluição de amostras
	Os métodos de laboratório nos quais uma quantidade de uma substância é adicionada a outra para reduzir a concentração de uma das substâncias são conhecidos como diluições.
Uma solução diluída contém soluto (ou alíquota) e um solvente (chamado diluente).
Esses dois componentes proporcionalmente combinados criam a diluição. 
Você pode identificar uma diluição de solução pela quantidade de soluto no volume total, expresso como uma proporção. Por exemplo, uma substância química pode ser preparada em uma diluição de álcool de 1/10 (1:10), indicando que um frasco de 10 mL contém 1 mL da substância (soluto) e 9 mL de álcool (diluente). 
	
IMPORTANTE: Uma diluição é uma expressão de concentração, não de volume. Expressa de outra forma, uma diluição indica a quantidade relativa de substâncias em uma solução. 
Quando a palavra diluição é usada, ela deve significar o número de partes que foram diluídas em um número total de partes. Em outras palavras, uma diluição deve significar o volume de concentrado no volume total da solução final. O menor número corresponde ao número de partes da substância que está sendo diluída; o maior número refere-se ao número total de partes da solução final.
Considere as seguintes frases:
Faça uma diluição 1 para 10 de soro em salina.
Faça uma diluição 1 em 10 de soro em salina.
Faça uma diluição 1 para 10 de soro com salina.
Faça uma diluição 1/10 de soro com salina.
Faça uma diluição 1:10 de soro usando salina.
Faça uma diluição de 1 parte de soro e 9 partes de salina.
Faça uma diluição de 1 parte de soro para 9 partes de salina.
Qual é a diferença entre essas frases? Nenhuma! Todas significam exatamente a mesma coisa.
Por tanto, diluir é acrescentar solvente a uma solução mantendo-se inalteradas as quantidades de soluto existentes.
1 parte de soro 
+ 9 partes de salina
 10 partes de solução final
COMO CALCULAR O FATOR DE DILUIÇÃO
Qual o fator de diluição se você adicionar 2 mL de uma amostra a 18 mL de diluente?
Calcule o volume final da solução (volume de diluente + volume da alíquota)
Divida o volume final da solução pelo volume da alíquota.
COMO PREPARAR UMA DILUIÇÃO
Qual o volume de amostra (alíquota) e diluente a ser adicionado para preparar uma diluição 1:10 em um volume final de 50 μL ?
Determine o volume de alíquota necessário 
Modo 1 - multiplique o volume final da solução pelo fator de diluição
Modo 2 – utilizando a regra de 3 simples
1 μL --- 10 μL
X μL --- 50 uL 
Determine o volume necessário de diluente necessário, para isto, subtraia o volume de alíquota do volume total da solução.
• Então, em uma diluição de 1:10 com volume final de 50 μL, você usará 5 μL de alíquota (amostra) e 45 μL de diluente.
COMO REALIZAR DILUIÇÃO SERIADA
	Diluição seriada é um método de diluição sucessiva com razão constante. Nesta técnica, transferem-se volumes sucessivos de um tubo para o tubo seguinte, ao qual se adicionou previamente a quantidade adequada de diluente.
Como realizar a diluição seriada de razão 1:2 de uma amostra de soro em que o volume final seja 200 μL.
Determine o volume de diluente e de alíquota para preparar uma diluição 1:2 em um volume final de 200 μL.
Complete a tabela abaixo
	Tubo
	1
	2
	3
	4
	5
	6
	7
	8
	Diluente
	
	
	
	
	
	
	
	
	Amostra
	
	
	
	
	
	
	
	
	Fator de diluição
	
	
	
	
	
	
	
	
	Diluição final
	
	
	
	
	
	
	
	
Identifique os tubos de 1 a 8.
Adicione a todos os tubos o volume de diluente calculado.
Adicione ao tubo 1 o volume de alíquota calculado e homogeneíze a solução.
Transferir uma alíquota (mesmo volume de alíquota utilizado no preparo do tubo 1) do tubo 1 para o tubo 2 e homogeneíze a solução.
Prosseguir da mesma maneira até o tubo 8.
Descartar o volume excedente do último tubo.
Exemplo:
Para diluições seriadas, ao se calcular o título, é necessário multiplicar o fator de diluição do tubo inicial pela diluição realizada no próximo tubo.
TÍTULO
É a concentração de uma solução determinada por titulação. É a menor quantidade ou concentração que produzia um efeito particular ou produto. O título é a recíproca da diluição. Então, em uma reação de pesquisa de anticorpos positiva na diluição ½ e ¼ e negativa na diluição 1/8 e 1/16, o título é 4.
PARA QUE DILUIR EM REAÇÕES IMUNOLÓGICAS?
Para diminuir a concentração de anticorpos inespecíficos.
Para determinar uma concentração de anticorpos em testes semi-quantitativos – Título.
  
EXERCÍCIOS
Quanto de uma amostra de sangue é necessário para se preparar 10 mL de uma diluição de 1/10 e quanto de diluente você precisaria?
Qual o fator de diluição quando 0,2 mL de alíquota é adicionado a 3,8 mL de diluente?
Como você prepararia 20 mL de uma diluição de 1/400? 
Como você prepararia 350 mL de uma diluição 1:22 de soro em salina?
Qual o fator da diluição quando se adiciona 2 mL de alíquota em 8 mL de diluente?
Uma alíquota de 0,2 mL de soro do paciente é adicionada a 0,8 mL de salina. Transfere-se 0,5 mL para um tubo 2 que possui 0,5 mL de salina. Este procedimento é feito até o tubo 10. As diluições foram utilizadas para testar um anticorpo de um agente infeccioso. 
Qual é o fator de diluição em cada tubo?
Qual é o título de cada tubo?
Do tubo 1 ao 8, a reação foi positiva para o anticorpo testado. Qual o título que deve ser apresentado ao anticorpo?
PRÁTICA
Fazer diluições seriadas do soro (amostra) na razão de 1:2 > (100 μL de cadadiluição). Pipetar 50 ul de cada diluição em placas escavadas. Adicionar 1 gota (50 μL) do reagente e determinar o título da amostra.
Av. Guedner, 1610, (44) 3027-6360 // 87.050-390 – Maringá – PR - www.cesumar.br
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