AVALIAÇÃO DE MÉTODOS DE QUANTIFICAÇÃO

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AVALIAÇÃO	DE	MÉTODOS	DE	QUANTIFICAÇÃO
RELATIVA	DE	EXPRESSÃO	GÊNICA	EM	RT-PCR
EM	TEMPO	REAL
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Sandro	Sperandei
Fundação	Oswaldo	Cruz
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Marcelo	Ribeiro-Alves
Fundação	Oswaldo	Cruz
88	PUBLICATIONS			363	CITATIONS			
SEE	PROFILE
Manoel	Odorico	Moraes
Federal	University	of	Pará
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 1/4 XXII CBEB 2010 
AVALIAÇÃO DE MÉTODOS DE QUANTIFICAÇÃO RELATIVA DE 
EXPRESSÃO GÊNICA EM RT-PCR EM TEMPO REAL 
 
S. Sperandei*, M. Ribeiro-Alves** e M. O. Moraes* 
 
*Laboratório de Hanseníase/FIOCRUZ, Rio de Janeiro, Brasil 
**Centro de Desenvolvimento Tecnológico em Saúde/FIOCRUZ, Rio de Janeiro, Brasil 
e-mail: ss@ioc.fiocruz.br 
 
 
 
Abstract: The aim of this study was to evaluate six 
different methods of relative quantification of real-
time RT-PCR on simulated data. We conducted four 
experiments where we simulate changes in efficiency 
and scale. We calculated the limits of agreement 
between the simulated and quantified data by 
different methods. The CpD1 method proved to be 
the best option, while the CQ method had the worst 
performance. The Ct method showed greater 
variability of performance for the experiments. 
 
Palavras-chave: real-time RT-PCR; Quantification 
methods; limits of agreement. 
 
Introdução 
 
A transcrição reversa do RNA codificante 
combinada à amplificação via reação da cadeia de 
polimerase (RT-PCR) de alvos moleculares (genes) 
específicos é um método sensível e específico na 
quantificação relativa de expressão gênica [1]. 
Recentemente, a automação de métodos de 
acompanhamento da cinética da reação de amplificação 
pela mensuração do acúmulo de fluorescência em 
tempo-real (RT-PCR em tempo real) aumentou ainda 
mais sua sensibilidade e ampliou significativamente seu 
emprego na quantificação de transcritos mesmo em 
amostras com número limitado de células, substituindo 
métodos clássicos, como o northern-blot, na validação 
de resultados de experimentos de larga-escala, como os 
de microarranjos de DNA. Independente da química de 
detecção empregada (sondas taqMan, beacons 
moleculares, SYBR Green I, entre outros, responsáveis 
pela emissão de fluorescência específica do produto de 
amplificação do alvo molecular), a quantificação 
relativa usando a RT-PCR em tempo real exige algumas 
equações, pressupostos e a confirmação desses para a 
análise adequada e obtenção dos resultados. 
Inicialmente, Livak & Schmittgen [2], propuseram 
que a amplificação em tempo real seguia o seguinte 
modelo: 
 
)1(,20
n
n NN ⋅= 
 
onde, após n ciclos de amplificação, para uma 
concentração inicial de transcrito alvo desconhecida, N0, 
e uma eficiência de amplificação máxima e igual a dois, 
temos a produção de N amplicons após correção do 
background. Esse modelo só é válido quando o 
pressuposto de eficiência máxima, ou a duplicação do 
número de amplicons por ciclo, é observado. Um 
afrouxamento desse pressuposto foi proposto por Liu & 
Saint [3] e aperfeiçoado por Rebrikov & Trofimov [4] 
com a hiperparametrização do modelo em (1), para: 
 
)2(,0
n
n ENF ⋅⋅= α 
 
onde, o sinal de fluorescência Fn, obtido após n ciclos, 
era proporcional à quantidade de amplicons N, Fn = α ∙ 
N, e a eficiência E não era mais máxima e igual a dois, 
mas deveria ser estimada. De fato, a eficiência em uma 
reação de amplificação varia em função de n e, à 
medida que n aumenta, a eficiência diminui em 
conseqüência da redução da atividade enzimática e da 
concentração dos reagentes, motivo pelo qual essa deve 
ser calculada na fase exponencial da amplificação, onde 
apresenta um comportamento relativamente constante. 
Apesar de parecer trivial, uma eficiência de 1,85, por 
exemplo, que seja considerada como 2 (pressuposto da 
Equação 1) implica em um erro superior a dez vezes na 
estimação da quantidade inicial do transcrito-alvo (N0), 
mesmo considerando-se α = 1. 
O método mais comumente utilizado na 
quantificação relativa de reações de RT-PCR em tempo 
real é aquele que se vale da determinação de um limiar 
(threshold) de fluorescência na fase exponencial da 
reação de amplificação. O ciclo em que para o gene de 
interesse (gene alvo) a fluorescência associada à 
amplificação de uma dada amostra alcança este limiar 
(cycle threshold; Ct) é comparado com o Ct de um gene 
constitutivo, geralmente um gene de expressão 
invariante às condições de tratamento, na mesma 
amostra. Este método considera que a eficiência é igual 
a 2, independente do gene. O valor de expressão 
normalizado do gene alvo é, então, expresso por: 
 
)3(22
2
2 )(
0
0 CtCtCt
Ct
Ct
controlealvo
alvo
controle
Controle
alvo
N
N ∆−−− === 
 
Outro método comum na quantificação relativa de 
reações de RT-PCR em tempo real é o método do ponto 
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característico (crossing point; Cp). Após ajuste de 
função (geralmente sigmóide) à curva de acúmulo de 
fluorescência, de posse de uma função paramétrica, 
utiliza-se para a quantificação da reação o ciclo 
correspondente ao ponto de máxima da primeira ou 
segunda derivada da função ajustada, ou outro ponto 
invariante a escala entre diferentes curvas ou mesmo ao 
pressuposto de igual concentração de cDNA 
amplificado em um valor de corte de fluorescência 
arbitrário. De fato, esse método admite diferentes 
cinéticas de amplificação entre amostras de um 
experimento, ou mesmo entre experimentos distintos. A 
normalização neste caso pressupõe que se estime a 
eficiência de cada gene (alvo e controle), modificando a 
equação (3) para: 
 
)4(
0
0
alvo
Controle
Controle
alvo
Ct
Alvo
Ct
Controle
E
E
N
N
= 
 
A impossibilidade de quantificação prévia da 
amostra torna impossível a determinação do melhor 
método de análise em dados reais, tornando a simulação 
dos dados uma interessante alternativa, por permitir o 
controle do valor esperado e, assim, a comparação com 
os resultados dos diferentes métodos de análise. Assim, 
o objetivo deste trabalho foi avaliar diferentes métodos 
de quantificação relativa de reações de RT-PCR em 
tempo real em dados simulados. 
 
Materiais e Métodos 
 
Simulação de curvas de acúmulo de fluorescência 
Desenvolvemos um modelo computacional 
dinâmico e estocástico no ambiente R 
('doRTReaction.R'), com parâmetros (valor default) 
para: (1) quantidade inicial de cDNA do transcrito em 
fg (“tmpl”=10); (2) quantidade de dNTP em µg 
(“dn”=5); (3) quantidade de primers/sondas em ng 
(“pp”=800); (4) número de ciclos de reação (“cs”=40); 
(5) Eficiência de amplificação (“eff”=2); (6) erro de 
detecção do termociclador (“nf”=10); (7) esmaecimento 
do fluoróforo (“bf”=0.01); (8) integridade do RNA 
(“rin”=10); e (9) volume de master-mix em µL 
(“m.mix”=1). A partir desse modelo, simulamos 4 
experimentos com 12 genes (11 alvos e 1 controle), em 
triplicata técnica, em oito condições de tratamento 
distintas, repetidos 3 vezes (total de 864 
amplificações/experimento). No primeiro experimento, 
onde simulamos condições ótimas de amplificação, 
todos os valores default foram mantidos à exceção do 
“tmpl”, selecionado com 128 parao gene controle e 
valores aleatórios entre 2 e 96 para os 11 genes alvo. No 
segundo experimento, onde simulamos eficiências 
distintas para os diferentes genes, usamos os mesmos 
parâmetros da primeira simulação, à exceção de “eff”, 
selecionado aleatoriamente entre 1,75 e 2 para os 12 
genes em cada condição de tratamento. No terceiro 
experimento, onde simulamos reações com diferenças 
de escala, usamos os mesmos parâmetros da primeira 
simulação, à exceção de “m.mix”, selecionado 
aleatoriamente entre 0,75 e 1. No quarto experimento, 
onde simulamos dados reais, com variação de eficiência 
e escala, usamos conjuntamente os parâmetros 
modificados nos dois experimentos anteriores. 
 
Métodos de quantificação 
Foram avaliados os métodos Ct (cycle threshold) e 
Cp (crossing point) com ajuste de curva sigmóide de 4 
parâmetros [5]. Para o segundo, diferentes pontos 
característicos foram testados: (1) "cpD1", ciclo relativo 
ao ponto de máxima da primeira derivada da curva 
ajustada; (2) "cpD2", ciclo relativo ao ponto de máxima 
da segunda derivada da curva ajustada; (3) "expR", ciclo 
relativo à região exponencial dada por: expR = cpD2-
(cpD1-cpD2); (4) "CQ", ciclo relativo à 20% do valor 
de fluorescência de "cpD2" (comparative quantification, 
Corbett Research); e, (5) “Cy0”, ciclo relativo à 
interseção entre a tangente ao ponto de máxima da 
primeira derivada da curva ajustada e a abscissa 
calculada como em [6]. Indiferente ao ponto 
característico empregado, a eficiência foi calculada em 
cada reação como a razão entre o valor de fluorescência 
relativo ao ciclo do ponto característico e o valor de 
fluorescência um ciclo anterior, como em [3]. Para cada 
gene, em cada condição de tratamento simulada, a 
eficiência gênica estimada equivale à média das 
eficiências calculadas nas reações desse gene/condição. 
 
Análise dos dados 
Para cada método, os valores obtidos foram 
comparados com os valores esperados através do 
método de limites de concordância de Bland & Altman 
[7], para observação de erro sistemático e aleatório. O 
erro sistemático foi considerado significativo sempre 
que p<0,01. Todas as análises foram realizadas no 
software R. Os métodos de quantificação foram 
organizados de acordo com o tamanho do desvio-padrão 
da diferença entre o valor esperado e o observado, que é 
o principal fator do erro aleatório, uma vez que o erro 
sistemático pode facilmente ser removido por subtração. 
 
Resultados 
 
Um exemplo do resultado das simulações pode ser 
visto na Figura 1, demonstrando que o efeito desejado 
pôde ser reproduzido. As Tabelas 1 a 4 apresentam os 
valores de erro médio e os limites de concordância para 
os métodos nos diferentes experimentos. Uma vez que a 
dependência entre o erro (diferença) e a intensidade do 
sinal (média) não pôde ser resolvida por métodos de 
transformação de potências (log, raiz quadrada, etc.), o 
 
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Figura 1: Curvas de acúmulo de fluorescência características dos experimentos simulados 1 a 4 (1 gene controle e 3 
alvos). 
 
Tabela 1: Valores de erro médio (EM), limites de 
concordância e ranking para o experimento 1. 
Método EM Limites de 
Concordância 
Ranking 
cpD1 -0,08 + 0,45x EM ± 0,42 2 
cpD2 -0,37 + 1,09x EM ± 0,63 3 
expR -0,60 + 1,69x EM ± 0,79 5 
CQ -0,74 + 1,97x EM ± 0,87 6 
Cy0 -0,56 + 1,57x EM ± 0,76 4 
Ct -0,07 + 0,22x EM ± 0,25 1 
 
Tabela 2: Valores de erro médio (EM), limites de 
concordância e ranking para o experimento 2. 
Método EM Limites de 
Concordância 
Ranking 
cpD1 -0,06 + 0,34x EM ± 0,37 1 
cpD2 -0,19 + 0,61x EM ± 0,46 2 
expR -0,40 + 1,17x EM ± 0,62 4 
CQ -0,67 + 1,87x EM ± 0,78 6 
Cy0 -0,34 + 1,03x EM ± 0,58 3 
Ct -0,49 + 1,52x EM ± 0,68 5 
 
Tabela 3: Valores de erro médio (EM), limites de 
concordância e ranking para o experimento 3. 
Método EM Limites de 
Concordância 
Ranking 
cpD1 -0,07 + 0,52x EM ± 0,39 2 
cpD2 -0,31 + 1,02x EM ± 0,54 3 
expR -0,56 + 1,63x EM ± 0,69 5 
CQ -0,73 + 1,97x EM ± 0,79 6 
Cy0 -0,51 + 1,51x EM ± 0,66 4 
Ct -0,09 + 0,24x EM ± 0,25 1 
 
erro médio foi apresentado como uma regressão linear 
do erro em função da intensidade, como sugerido em 
[7]. 
Pode ser observado (Figura 2), que o método Ct 
apresentou a maior variabilidade no resultado em 
função da alteração dos parâmetros da simulação. Nos 
casos onde a eficiência da reação é máxima (igual a 2) e 
constante (experimentos 1 e 3), o método se mostra com 
menor erro em relação aos demais, mesmo que haja 
alteração de escala entre as amplificações. Entretanto, 
Tabela 4: Valores de erro médio (EM), limites de 
concordância e ranking para o experimento 4. 
Método EM Limites de 
Concordância 
Ranking 
cpD1 -0,20 + 0,88x EM ± 0,50 1 
cpD2 -0,38 + 1,22x EM ± 0,59 2 
expR -0,58 + 1,70x EM ± 0,72 4 
CQ -0,76 + 1,98x EM ± 0,82 6 
Cy0 -0,55 + 1,60x EM ± 0,70 3 
Ct -0,60 + 1,62x EM ± 0,72 4 
 
nos casos onde a eficiência varia (experimentos 2 e 4), o 
método apresenta grande deterioração do desempenho. 
Nesses, métodos que usam pontos característicos e 
estimam a eficiência nas funções ajustadas às curvas de 
amplificação, à exceção do método “CQ” (de 
desempenho inferior a todos os demais, independente do 
experimento), apresentam desempenho superior, e nessa 
ordem: (1) “cpD1”; (2) “cpD2”; (3) “Cy0”; e, (4) 
“expR”. Em conjunto, esses últimos métodos 
apresentam desvios-padrão da diferença entre os valores 
simulados e quantificados relativamente estáveis, 
independente do experimento. 
 
 
Figura 2: Desvios-padrão das diferenças entre os valores 
simulados e observados em quantificações por 
diferentes métodos nos quatro experimentos simulados. 
 
Discussão 
 
Apesar do método de quantificação relativa de RT-
PCR em tempo real baseado na definição de limiares de 
fluorescência na fase exponencial, Ct, ser ainda o mais 
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empregado na análise de dados reais, mostramos que 
métodos baseados em pontos característicos das curvas 
de amplificação, invariantes a escala dessas curvas e 
que estimam a eficiência de amplificação em funções 
ajustadas aos dados de fluorescência, são mais eficientes 
principalmente quando há variação entre as eficiências 
dos diferentes genes em estudo. 
Baseando-se nos resultados encontrados, podemos 
afirmar que o método de quantificação “cpD1” é o mais 
adequado para a quantificação relativa em dados reais, 
com variação de escala e eficiência de amplificação 
entre reações, sendo também o método “cpD2” uma 
excelente alternativa ao “cpD1” para a quantificação de 
transcritos mais raros, uma vez que a quantificação por 
este método se dá mais precocemente que pelo “cpD1”, 
não havendo a necessidade nesses casos de extensão da 
reação por mais de 40 ciclos, e com isso a quantificação 
em ciclos muito tardios, que sofrem o efeito deletério de 
esmaecimento do fluoróforo e redução de capacidade de 
emissão; efeito que pode ser observado na Figura 1. 
Cabe ressaltar, que apesar de permitirmos a seleção 
estocástica de parâmetros não-“ótimos” para os 
parâmetros de escala e eficiência de amplificação, ou 
ambos, em nossos experimentos simulados, trabalhamos 
sempre dentro de limites bastante razoáveis de variação, 
gerando reações consideradas de boa a excelente 
qualidade. Não obstante, reações com baixa qualidade 
de replicação técnica, efeitos severos de escala e baixa 
eficiência de amplificação devem ser eliminados de 
análises subsequentes, independente do método de 
quantificação empregado. 
 
Conclusão 
 
O desenvolvimento de um modelo de simulação de 
reações de amplificação de RT-PCR em tempo real 
permitiu a comparação entre métodos de quantificação 
relativa de expressão gênica em dados de diferentes 
características: “ótimos”,com eficiência de 
amplificação variante, em diferentes escalas, e uma 
combinação entre os dois últimos, que em muito se 
aproximou a dados reais. Essa abordagem foi eficiente 
em mostrar que o método de quantificação mais 
empregado, o Ct, é inferior a métodos que se valem de 
pontos característicos, mas que demandam maior 
computação por dependerem de ajuste de curva aos 
dados de fluorescência e interpolação de função para 
estimação de eficiência de amplificação. Desses, 
destacamos o cpD1 e, eventualmente para a 
quantificação de transcritos mais raros, o cpD2. 
Como pretendíamos apenas comparar os métodos de 
quantificação, não abordamos dois outros problemas 
bastante relevantes na análise de dados de RT-PCR em 
tempo real. Não avaliamos a influência do número de 
reações de amplificação desejadas para se estimar a 
eficiência gênica, apontada com crítica por [8], usamos 
sempre a média entre a eficiência média estimada para 
triplicatas técnicas simuladas, ou um total de nove 
reações. Também não avaliamos o impacto do uso de 
um único gene normalizador, ao invés da média 
geométrica entre diversos genes controle, como em [9]. 
Apesar disso, entendemos que os resultados 
apresentados são de extrema importância para o uso 
mais adequado da técnica e da obtenção de dados 
biológicos relevantes. 
 
Agradecimentos 
 
CAPES e CNPq, respectivamente pelas bolsas de Pós-
doutorado de MRA (Programa Pró-Doc) e de doutorado 
de SS. 
 
Referências 
 
[1] Heid, C.A., Stevens, J., Livak, K.J., Williams, P.M. 
(1996), "Real Time Quantitative PCR" Genome 
Res., v.6, n.10, p.986-994. 
[2] Livak, K.J., Schmittgen, T.D. (2001), "Analysis of 
Relative Gene Expression Data Using Real-Time 
Quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) 
Method" Methods, v.25, n.4, p.402-408. 
[3] Liu, W., Saint, D.A. (2002), "A New Quantitative 
Method of Real Time Reverse Transcription 
Polymerase Chain Reaction Assay Based on 
Simulation of Polymerase Chain Reaction Kinetics" 
Anal.Biochem., v.302, n.1, p.52-59. 
[4] Rebrikov, D.V., Trofimov, D.Y. (2006), "Real-
Time PCR: a Review of Approaches to Data 
Analysis" Appl.Biochem.Microbiol., v.42, n.455-
463. 
[5] Spiess, A.N., Feig, C., Ritz, C. (2008), "Highly 
Accurate Sigmoidal Fitting of Real-Time PCR Data 
by Introducing a Parameter for Asymmetry" 
BMC.Bioinformatics., v.9, n.221- 
[6] Guescini, M., Sisti, D., Rocchi, M.B., Stocchi, L., 
Stocchi, V. (2008), "A New Real-Time PCR 
Method to Overcome Significant Quantitative 
Inaccuracy Due to Slight Amplification Inhibition" 
BMC.Bioinformatics., v.9, n.326- 
[7] Bland, J.M., Altman, D.G. (1986), "Statistical 
Methods for Assessing Agreement Between Two 
Methods of Clinical Measurement" Lancet, v.1, 
n.8476, p.307-310. 
[8] Cikos, S., Koppel, J. (2009), "Transformation of 
Real-Time PCR Fluorescence Data to Target Gene 
Quantity" Anal.Biochem., v.384, n.1, p.1-10. 
[9] Vandesompele, J., De, P.K., Pattyn, F., Poppe, B., 
Van, R.N., De, P.A., Speleman, F. (2002), 
"Accurate Normalization of Real-Time Quantitative 
RT-PCR Data by Geometric Averaging of Multiple 
Internal Control Genes" Genome Biol., v.3, n.7, 
p.RESEARCH0034- 
ISSN 2179-3220 1282