Biomol estudo dirigido 2

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Observe as ilustrações dos géis abaixo e identifique o tamanho aproximado dos fragmentos de DNA (bandas) analisados usando como base o marcador de tamanhos moleculares de fragmentos de DNA (M = Marcador de peso molecular).
Eletroforese
 
1:
1 - M = 200 pb
-
 
pb
-
 
pb e
 
_
 
__
pb 
4 -
 
pb
5 -
 
pb
Eletroforese 2:
1 - M = 100 pb
-
 
pb
-
 
pb
-
 
pb
-
 
pb e
 
pb 
6 -
 
pb
7 -
 
pb e
 
pb 
8 -
 
pb
9 -
 
pb e
 
pb
O que é PCR? Quais os princípios da técnica da reação de PCR. Passo por passo. Quais são os reagentes adicionados no PCR? Qual o nome do aparelho utilizado para fazer uma PCR? Cite uma aplicação da técnica.
A PCR é uma técnica para amplificação de uma determinada região do DNA, criando múltiplas cópias, usando elementos de replicação do DNA mesmo com pequenas quantidades da amostra de DNA. Seus reagentes adicionados são Taq polimerase, um par de primers para início da síntese de DNA, deoxinucleotídeos trifosfato, cátion divalente, tampão para manter o pH, cátions monovalentes e DNA molde. 
Já seus princípios são: 
1 - Desnaturação do DNA molde (separa a dupla fita), 
2 - Anelamento ou hibridização (liga os primers) e 
3 - Extensão ou polimerização dos iniciadores pela DNA polimerase termostável (a DNA polimerase adiciona as bases complementares, formando a nova fita) e então duplica-se a fita de DNA em uma temperatura de 72ºC. Utiliza-se o termociclador para a execução da PCR. Pode ser aplicada em investigação forense criminais. 
Explique cada passo da extração de DNA. O que acontece em cada etapa? 
Etapa de Lise – o primeiro passo consiste em realizar a lise (quebra) da célula para expor o DNA.
Ligação – uma membrana de sílica retém e concentra o DNA.
Etapa de Lavagem – quebrar e emulsionar a gordura e as proteínas que formam a membrana da célula. Isto normalmente é feito utilizando soluções detergentes e por centrifugação. As etapas de lavagem removem estes resíduos contaminantes, restando apenas a membrana com o DNA.
Etapa de Eluição – por fim ocorre a liberação dos ácidos nucléicos (DNA/ RNA) da membrana. Isto proporciona o DNA purificado pronto para ser utilizado em diferentes aplicações. 
Explique o que é eletroforese? Quais são os princípios da técnica
A técnica consiste na migração de moléculas em função da aplicação de um campo elétrico.
A princípio a mostra é aplicada em gel e a fonte de eletroforese cria a corrente elétrica que ocasiona a sua migração, quanto maior a molécula, mais lento é este processo, assim, moléculas de diferentes tamanhos realizam este trajeto de um pólo a outro em tempo e velocidades distintos.A distância que o fragmento percorreu é comparada a um padrão e as bandas irão guiar o pesquisador durante a análise. Para a visualização, é utilizado um corante que sob a luz UV de um transiluminador emite fluorescência e permite a leitura das bandas.
Como são separados os fragmentos de DNA? Como podem ser observadas as bandas após a corrida do gel? Em que equipamento?
Os fragmentos de DNA são separados por meio da técnica de eletroforese através de géis de agarose. Para realizar uma eletroforese, um gel de agarose é preparado, o DNA é introduzido em pequenos poços de gel, e então uma corrente elétrica é aplicada através do gel. Como o DNA é negativamente carregado, ele é atraído pelo eletrodo positivo.Entretanto, para chegar ao eletrodo positivo, o DNA deve migrar através do gel de agarose.
Os fragmentos de DNA menores podem migrar através de um gel de agarose mais rapidamente que os fragmentos de DNA maiores. A velocidade de migração de fragmentos de DNA lineares através da agarose é inversamente proporcional a log10 de seus pesos moleculares. É possível calcular o tamanho exato de um dado fragmento com base na sua razão de migração. Após a eletroforese em gel, os fragmentos de DNA normalmente são corados com brometo de etídeo, que possui afinidade pelo DNA e fluorece (torna-se visível) vivamente em contato com a luz ultravioleta
O que são regiões minissatélites? Para que tipo de investigação pode ser utilizado? 
Regiões minissatélites são regiões dispersas no genoma, que contém um numero variável de sequencias de 6 a 100 nucletoideos repetidos e enfileirados de DNA.
São utilizados em investigações genéticas com diversas finalidades, como por exemplo: linhagens, paternidade, parentesco e mapas genéticos.
O que é mutação? Quais as classes de mutação?
Mutação é qualquer mudança permanente do DNA, podendo ocorrer tanto em células da linhagem germinativa como em células somáticas e envolvem as mutações gênicas e as mutações cromossômicas
Há diversas classes de mutações como transições, transversões, inserções, deleção, tranlocações e inversões. 
Quais os efeitos da mutação?
Pode resultar em síndromes, doenças, mas há também mutações sem efeito que não ocasiona alterações significativas. 
Explique qual é o tipo de mutação que ocorre nos pacientes com anemia falciforme. Quais são os sintomas e o que ocorre nas hemácias.
A anemia falciforme é uma mutação gênica, onde há a substituição (no cromossoma 11), de um nucleotídeo por outro (Timina por Adenina). É codificado o aminoácido valina em vez do ácido glutâmico. Deforma-se, tornando a hemácia rígida e com uma aparência de foice (desta razão deriva o nome falciforme). Deste modo, as hemácias apresentam formato de foice, não conseguem atravessar os vasos sanguíneos do corpo, conduzindo a bloqueios na circulação sanguínea, produzindo danos nos tecidos (por falta de oxigenação e nutrição, ou seja, a quantidade de oxigênio nos tecidos e nos órgãos diminui), e intensa dor. Esta doença tem como alguns sintomas o atraso no crescimento, esplenomegalia e maior susceptibilidade a infecções. 
Explique o que são os mecanismos de reparo do DNA. Quais os tipos de reparo?
São mecanismos especializados que possuem a função de corrigir diferentes tipos de alterações do DNA. Os processos de reparo que ajudam a corrigir o DNA, incluem:
DNA polimerase: reconhece pareamentos errados e retira, reduzindo o número de mutações.
Reparo pela excisão de bases: encontro de U e substituição por T.
Reparo pela excisão de nucleotídeos (NER): se há quebra de nucleotídeo ou formação de dímeros, um ou vários nucleotídeos podem ser retirados e corrigidos. 
Dê um exemplo de agente mutagênico
Brometo de etídio, carcinogênico, mutagênico e teratogênico. 
Utilizado para a leitura de eletroforese. 
O que são enzimas de restrição? O que elas reconhecem?
Enzimas de restrição são proteínas que tem capacidade de reconhecer na fita dupla hélice do DNA, sítios de clivagem, geralmente em seqüências de 4 ou 6 bases. 
As enzimas de restrição ou endonucleases de restrição como também são conhecidas, são enzimas que cortam a molécula de DNA através do reconhecimento de seqüências nucleotídicas específicas.
As enzimas de restrição reconhecem e atuam sobre sequências específicas de DNA, catalisando a destruição de uma ligação fosfodiéster entre dois nucleotídeos consecutivos ligados a determinadas bases. Os nucleotídeos entre os quais a enzima corta, ou seja, entre os quais promove a hidrólise, encontram-se no interior dessas mesmas sequências específicas de reconhecimento
Explique como as enzimas de restrição não degradam o DNA da própria bactéria que a produziu.
Isso não ocorre devido à existência de outras enzimas protetoras, que impedem a ação das enzimas de restrição no material genético da bactéria.
O que você entender por diagnóstico molecular? Qual a sua importância? Cite alguns exemplos de técnicas utilizadas.
O diagnóstico molecular corresponde a um conjunto de técnicas moleculares que têm como objetivo identificar alterações no DNA que possam ser indicativas de doenças genéticas ou câncer, por exemplo. Além disso, as técnicas moleculares estão sendo amplamente utilizadas para a identificação e confirmação de doenças infecciosas, pois representam um método de diagnóstico mais rápido e preciso, ex:determinação de carga viral (HPV/HIV/HepatiteC)
Com relação ao diagnóstico molecular da anemia falciforme, sabendo-se que essa mutação está localizada no sítio de restrição da enzima de restrição BamHI. Descreva todo procedimento utilizado até a obtenção do gel (Fig. A e B) e o qual o resultado indicando qual indivíduo homozigoto sem a mutação, o indivíduo heterozigoto (portador) e o indivíduo que tem a doença.
No alelo um possui sítio de BamHI e quando se adiciona a enzima de restrição ela reconhece e cliva a fita em 2 lados. 
No alelo dois não possui sítio de BamHI, logo não há corte com a enzima de restrição, então possui a doença. 
Portanto os fica caracterizado como: 
1/1= homozigoto sem mutação 
2/2= portador da doença
1/2= heterozigoto (apenas portador do gene) 
Com relação a seqüência abaixo
CACGAGAATGAGACTCCTAATTCGAGCTAGCTTGGACAACCTGGAACTCTTCTAGGAGATAAATCAAATTTATAATTGCCTTATTACCGCTCATGGTCTATTAATGATATTTTTTGTAGTCCTACCTATTTTAATAGGAGATTAATGAAATTGACTAGTTCCCTTAATACTAGGAGCTCCAGACATGGCTTTTCCCCGGAATAATAATCTTGGATTAATGTTCTGACTTATTCCCCCCGCATTTAAGCGGGCCAATTATTACCTGGTTAGTAACTTCTAGGAGATCAATCAAATTTATAATTGCCTTATTACCGCTCATGGTCTAGTAATGATATTTTTTGTAGTCCTACCTATTTTAATAGGAGATTAATGAAACCGACTAGTTCCCTTAATACTAGGA
Tamanho do gene: 400 nucleotídeos
Cortar a sequência de DNA acima com a enzima VspI (AT/TAAT)
Marque as bandas que serão hibridizadas com as sondas
ATATTAACGGAATAATG- 32P
TTTAACTGATCAAGGGA- 32P
O que é a técnica de FISH (Fluorescent In Situ Hybridization)? Dê um exemplo de que tipo de diagnóstico pode ser feito com essa técnica?
É um método que utiliza recursos moleculares para analisar os cromossomos, ou seja, é o mapeamento do gene por hibridização molecular de uma seqüência de DNA clonada, marcada por fluorescência num cromossomo marcado em lâmina.
Por meio da técnica de FISH é possível investigar tecidos preservados, tecidos fixados em formol, preparações para citogenética convencional, amostras de sangue periférico, medula óssea e as amostras pré-natais como vilosidade coriônica, líquido aminiótico, sangue fetal e material de abortamento.
A técnica de FISH abrange três grandes áreas:
Na onco-hematologia: identificação, rastreamento, e monitoramento de anormalidades cromossômicas em leucemia/câncer;
Na genética constitucional: diagnóstico de indivíduos portadores de síndromes genéticas específicas;
No diagnóstico pré-natal: detecção de aneuploidias cromossômicas.
Explique os passos para ser realizado um diagnóstico molecular, desde a coleta do material até o resultado que será entregue para o paciente.
O diagnóstico molecular pode ser realizado com qualquer amostra, sendo solicitado pelo médico aquela que pode melhor fornecer informações sobre o estado do paciente, (urina, saliva ou, na maioria da vezes, sangue) 
Não é necessário jejum ou qualquer outro preparo para a realização do exame.
A amostra é coletada e encaminhada ao laboratório juntamente com a orientação do médico informando o exame ou tipo de pesquisa que deverá ser feita. A técnica molecular realizada depende do exame solicitado e envolve uma série de procedimentos precisos que tem como objetivo final identificar a presença ou ausência alteração solicitada pelo médico.
Normalmente só é utilizada uma pequena quantidade de amostra enviada, sendo o resto armazenado para que, caso haja necessidade, o exame seja repetido.
Para que haja a identificação de uma pessoa através de seu DNA são utilizadas sondas capazes de detectar sequências do DNA humano. Essas sequências de DNA são chamadas de VNTR(Variable Number of Tandem Repeats - número variável de repetições em sequência) e são compostas por sequências curtas de nucleotídeos que se repetem ao longo de trechos da molécula de DNA. Cada pessoa tem um padrão específico de repetição dessas unidades e esse padrão é herdado de seus pais.
Quando amostras de DNA são obtidas através de pelos, sangue, pedaços de pele, esperma etc., é possível o isolamento do DNA utilizando enzimas de restrição. Após o uso das enzimas, o DNA fica fragmentado, ou seja, separado em pequenos pedacinhos. Em seguida, esses pequenos pedaços são separados em um processo chamado de eletroforese, que utiliza corrente elétrica.  Após o término da eletroforese, um equipamento que utiliza luz ultravioleta e corante específico traduz a imagem do DNA, que então poderá ser estudada pelos pesquisadores.
As faixas observadas são únicas para cada pessoa e por isso ela é chamada de impressão digital de DNA ou impressão digital genética.
Quais os tipos de doenças podem ser feitos pelo diagnóstico molecular?
Doenças cuja predisposição pode ser indicada através de testes de DNA. Como por exemplo, a Doença de Huntington, Mal de Alzheimer, Síndrome de Down, Síndrome de Lynch (câncer colorretal hereditário), Fibrose cística e doenças hereditárias 'étnicas'. 
O que é RFLP(Restriction Fragment Length Polymorphism)? Como funciona a técnica? 
O polimorfismo RFLP (Polimorfismo no Comprimento do Fragmento de Restrição) a qual é baseada em mutações que alteram seqüências no DNA de um indivíduo, de modo que enzimas de restrição podem perder a capacidade de clivar aquele DNA em posições ainda susceptíveis à clivagem nos DNAs de outros indivíduos.
Nesta técnica utilizam-se enzimas de restrição que cortam o DNA em pontos específicos, gerando fragmentos de diferentes tamanhos que são separados e visualizados em forma de bandas.
A separação é feita por eletroforese, na qual os fragmentos de DNA são colocados em um gel de agarose e expostos a cargas elétricas, positivas de um lado e negativas do outro, onde eles migram de acordo com seu tamanho. Assim, fragmentos menores migram mais rápido que os maiores. Eles também migram de acordo com sua carga elétrica, o DNA, por possuir carga negativa em pH neutro, migra em direção ao ânodo. Cada individuo apresentará o seu padrão de fragmentos, chamado ‘perfil de digestão’, detectado pelo número e tamanho dos fragmentos gerados.
O que é SSCP (Single Strand Conformation Polymorphism)? Como funciona a técnica? 
Polimorfismo de conformação de filamento único ou polimorfismo de conformação de fita simples (SSCP, do inglês Single Strand Conformation Polymorphism) é definida como uma técnica de diferenciação de filamentos únicos de DNA de comprimentos idênticos como induzidos por diferenças nas seqüências sob certas condições experimentais. Esta propriedade permite distinguir as seqüências por meio de eletroforese em gel, que separa as diferentes conformações. 
Como funciona a técnica Finger Print, utilizado no teste de paternidade?
Fingerprint é um método de identificação que compara fragmentos de ácido desoxirribonucléico (DNA). Às vezes é chamado de tipagem de DNA. DNA é o material genético encontrado no núcleo das células de todos os seres vivos. Com exceção de gêmeos idênticos, o DNA completo de cada indivíduo é único. 
No teste de paternidade abaixo identifique as bandas correspondentes dos filhos e dos pais pelo teste VNTRs (Variable Number of Tandem Repeats Regiões de Minissatélites). Sendo que a maior banda tem 6 repetições e a menor tem 3 repetições.
Pai	Mãe