RESUMO DIANA

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1. O QUE É A ESPECTROMETRIA DE MASSAS? 
 Técnica analítica que tem como objetivo identificar, quantificar e elucidar a estrutura 
molecular de compostos químicos. A IUPAC define a espectrometria de massas como o estudo de 
sistemas pela formação de íons em fase gasosa, com o sem fragmentação, que são caracterizados 
por suas relações massa/carga e abundâncias relativas. 
O principio básico da espectrometria de massas é gerar íons a partir de compostos 
orgânicos é inorgânicos em função da sua massa/carga (m/z) e detectar os mesmos quantitativa ou 
qualitativamente considerando a sua abundância relativa e respectiva m/z. O analito pode ser 
ionizado termicamente por campos elétricos ou por impacto energético com elétrons, prótons ou 
fótons. Os íons podem ser espécies atômicas individualmente carregadas, clusters, moléculas ou 
seus fragmentos. 
As aplicações da espectrometria de massas incluem identificação e quantificação de 
pesticidas em amostras de água e alimentos, identificação de esteroides em atletas, detecção de 
metais em ppq (partes por quadrilhão), datação pela técnica do Carbono 14 e identificação, 
quantificação e caracterização de compostos orgânicos e biomoléculas como carboidratos, lipídios 
e proteínas. 
 
1.1 O ESPECTROMETRO DE MASSAS 
O espectrômetro de massas consiste de uma fonte de íons, um analisador de massas e um 
detector os quais operam em condições de vácuo (Fig.1). 
 
Figura 1. Esquema geral de um espectrômetro de massas. Usualmente diferentes 
mecanismos de inserção de amostra podem ser acoplados à fonte de ionização. A 
transferência dos íons da pressão atmosférica à região de alto vácuo é realizado por 
ação de um sistema de vácuo fechado 
 
O espectrômetro opera em condições de vácuo devido a que os íons formados na fonte de 
íons devem atingir o detector, a distancia livre media para que um íon sofra colisão em condições 
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de pressão atmosférica é de 10-8 m e, por conseguinte é improvável que os íons atinjam o detector. 
Uma vez que a distância livre média é inversamente proporcional à pressão, uma redução da 
pressão a 10-6 torr pode incrementar a distância livre média em até 10 m, permitindo que os íons 
atinjam o detector. Adicionalmente o vácuo minimiza reações íon-molécula, espalhamento e 
neutralização de íons. 
 
 Inserção da amostra 
A seleção para a inserção da amostra vai depender da matriz da amostra, tipo de ionização 
e tipo de amostra a ser inserida. Várias técnicas de ionização estão desenhadas para fazer a 
transferência de cargas em fase gasosa pelo que a amostra deve ser inserida em estado gasoso. 
Amostras líquidas ou solidas também podem ser inseridas e usualmente se utilizam sistemas de 
transferência de calor que incrementam a pressão de vapor para realizar a análise. Por outro lado 
se se trata de moléculas lábeis (que sofrem degradação a temperaturas elevadas) ou não tem 
suficiente pressão de vapor, a amostra pode ser ionizada na fase condensada. Alguns mecanismos 
de inserção da amostra incluem: 
-Inserção direta: com ajuda de um seringa e uma bomba de pressão que vai empurrando a amostra 
para dentro do espectrômetro ao mesmo tempo que retira o ar da amostra 
-Sondas de inserção direta: é o mecanismo mais amplamente utilizado para inserção de amostras 
líquidas ou sólidas. Neste caso a amostra é colocada em um tubo capilar em cuja extremidade há 
um sleeve aquecido. Uma vez posicionada a sonda, o sleeve é diretamente inserido na região de 
vácuo do espectrômetro e a temperatura do tubo capilar é aumentada a fim de favorecer a 
evaporação da amostra. 
-Cromatografia Gasosa (GC): é uma das técnicas de inserção de amostra mais amplamente 
utilizados em MS, na que misturas complexas de analitos são separados por cromatografia gasosa e 
posteriormente identificados e quantificados por MS. Resulta uma metodologia útil para análise de 
compostos voláteis, usualmente utilizada com ajuda de colunas capilares cujo fluxo de entrada e 
muito baixo e o final da coluna pode ser inserido diretamente na região de ionização do 
espectrômetro. 
-Cromatografia Liquida (LC): é uma metodologia utilizada para inserir amostras termicamente lábeis 
e nas quais a ionização acontece diretamente na fase condensada. 
-Ionização direta da amostra: algumas amostras são instáveis a altas temperaturas ou não possuem 
pressão de vapor significante, neste caso as amostras precisam são inseridas ao MS por ionização 
direta na fase condensada, estas técnicas são usadas para LC/MS e remoção por laser. 
 
 Formação de ions 
Impacto eletrônico (Electron Ionization-EI). É a técnica de ionização mas comumente 
utilizada em espectrometria, especialmente utilizada para moléculas em fase gasosa, porém 
apresenta algumas limitações, embora os espectros que produça sejam altamente reprodutiveis, 
fáceis de interpretar e úteis para bibliotecas de espectros, este tipo de ionização pode causar 
fragmentação extensiva ocasionando a perda dos íons moleculares de vários compostos. O 
principio da EI consiste na inserção de uma espécie neutra à região de vácuo do espectrômetro, 
que é impactada por elétrons energéticos que possuem várias dezenas de electro-volts (eV) de 
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energia cinética (usualmente 70 eV), parte da energia do elétron é transferida para a espécie 
neutra. Se o eletron colide com a espécie netura, a quantidade de energia transferida pode causar 
a ejeção de um elétron de valencia da espécie neutra, tornando-o um radical catiônico chamado de 
íon molecular (M+• ) : 
 
M + e- ---M+• + 2 e- 
 
Por outro lado se o elétron passa proximo da molécula, a carga negativa do elétron repele e 
distorciona a nuvem de elétrons que rodeam a molécula. Esta distorção causa um aumento na 
energia cinética do elétron de rápido movimento à nuvem eletrônica, se suficiente energia é 
transferida a molécula expulsa um életron de valencia e forma um radical catiônico (M+•) (Fig.6): 
 
 
 
Figura 6. Processo de impacto eletrônico (Electron Ionization- EI). A- elétron ionizante se 
aproximando da molécula. B, C Deformação causada na nuvem eletrônica da molécula pela 
aproximação do elétron ionizante. D- Elétron ionizante passando através da molécula. E- nuvem 
eletrônica da molécula expulsando um elétron de valência e F- formação do radical catiônico. 
 
Dependendo do analito e da energia do elétron primário, íons dupla o triplamente 
carregados podem ser observados, em geral estes são menos abundantes: 
M + e- ---M2+ + 3 e- 
 
M + e- ---M3+• + 4 e- 
 
A energia de ionização pode ser definida como a quantidade mínima de energia que deve 
ser absorvida por um átomo ou uma molécula em seu estado eletrônico e vibracional, necessária 
para formar um íon por ejeção de um elétron. Usualmente a energia de ionização é denominada 
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potencial de ionização (PI) e é expressa em unidades de eV (1 eV = 96,4152206 KJ/mol). Na maioria 
das moléculas a energia de ionização está entre 7-15 eV. Devido a que os espectros de massas são 
gerados partir de várias moléculas ionizadas, o espectro é uma distribuição de produtos iônicos. 
Íons moleculares intactos são observados a partir de íons produzidos com pouco excesso de 
energia, por outro lado íons moleculares com maior energia sofrem fragmentação. A abundância 
de fragmentos resultantes (produtos iônicos) é determinada pela cinética das vias de fragmentação 
e a energia de ionização. Mudanças na energia de ionização podem causar mudanças na 
distribuição dos fragmentos de íons. 
Ionização Química (Chemical Ionization-CI). Técnica de ionização suave que produz íons 
com pouco excesso de energia e como resultado menos picos de fragmentação são observados no 
espectrode massas. Uma vez que esta técnica permite um aumento na detecção do íon molecular, 
resulta complementária à técnica de impacto eletrônico de 70 eV, assim esta técnica resulta útil na 
verificação da massa molecular de uma substância desconhecida. Na ionização química a fonte se 
encontra localizada em uma câmara de colisão com aberturas para a o feixe de elétrons, o gás 
reagente e a amostra. O gás é introduzido na câmara a uma pressão de aprox. 10 Pa o que garante 
pouca distância entre as moléculas do analito e as do gás (10-4 m) (Fig.7). 
 
 
Figura 7. Esquema da disposição da fonte de íons por ionização química 
 
 
 O gás reagente é ionizado na câmara de colisão por um feixe de elétrons a fim de produzir 
uma nuvem de íons. Estes íons reagem dentro da nuvem e produzem adutos iônicos como o CH5
+, 
que resultam ser excelentes doadores de prótons (Fig. 8) 
 
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Figura 8. Ìon CH5
+ 
 
Quando as moléculas do analito são introduzidas à região da fonte, os íons do gas reagente 
doam prótons à molécula do analito produzindo íons MH+. A energética da transferência de íons é 
controlada com o uso de diferentes gases reagentes. Os gases reagentes mais comuns são metano, 
isobutano e amônia, sendo o metano o doador de prótons mais forte com uma afinidade de 
prótons (PA) de 5,7 eV e para ionizações mais suaves isobutano (8,5 eV) e amônia (9,0 eV) são 
frequentemente usados. A tendência de uma molécula básica (B) a aceitar prótons é 
quantitativamente descrita pela sua PA. 
 A fragmentação é minimizada na ionização química devido a um reduzido excesso de 
energia produzido na reação, isto porque os adutos iônicos possuem menos energia e são 
relativamente mais estáveis. Algumas reações típicas da ionização química são apresentadas a 
continuação: 
 
 
1) Impacto eletrônico do gas reagente para formação de íons: 
 
CH4 + e
-  CH4 
+• + 2 e- 
 
2) Reação dos íons do gás reagente para formar adutos iônicos: 
 
CH4 
+• + CH4  CH5 
+ + CH3
• 
 
ou 
 
CH4 
+• + CH4 C2H5
+ + H2 
 
 
3) Reação dos íons do gás reagente com as moléculas do analito 
 
CH5 
+ + M CH4 + MH
+ 
C2H5
+ + M C2H4 + MH
+ 
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Figura 9. Comparação EI e CI 
 
Métodos de ionização a pressão atmosférica (API) 
Métodos de ionização convencionais empregam fontes que funcionam em alto-vácuo (EI, 
CI, MALDI,FAB), porém existem métodos de ionização em que a fonte opera à pressão atmosférica 
(ESI, APCI e APPI). Estas técnicas têm sido acopladas a MS para facilitar o estudo de compostos de 
alto peso molecular, termo lábeis e polares. Nas técnicas API a região de alto vácuo deve ser 
mantida no analisador de massas e no detector. 
 
Electrospray Ionization (ESI). Técnica que transfere e ioniza analitos da fase líquida para a 
gasosa, permitindo analises por espectrometria de massas. Inicialmente o analito é misturado com 
solução, contendo eletrólito em baixa concentração (aprox. 0,5%), a solução analito-solvente segue 
por um capilar até o interior da câmara de ionização. Uma voltagem de 3-5 kV é aplicada entre a 
extremidade do capilar contida dentro da câmara de ionização e o orifício de entrada do 
espectrômetro. Esta diferença de potencial faz a extremidade do capilar se tornar um dos dipolos 
do campo elétrico gerado. Este campo geralmente de 106 V/m desestabiliza a gota formada na 
extremidade do capilar concentrando íons positivos. Como a solução analito-solvente esta sendo 
constantemente bombeada a extremidade do menisco torna-se um spray eletrolítico. Com auxilio 
de um gás ocorre evaporação acelerada do solvente das micro gotas oriundas do spray, diminuindo 
seu diâmetro e resultando em um aumento das forças eletrostáticas repulsivas, até que é atingido 
o limite de Rayleigh, momento em que a força da atração eletrostática se iguala à força da tensão 
superficial da micro gota. Quando este limite é superado acontece uma explosão de Coulomb, uma 
fissão da gota parental em gotículas altamente ionizadas. A repetição do evento evaporação 
/fissão acontecerá várias vezes em processo simultâneo durante o trajeto das micro gotas no 
transcurso compreendido entre a ponta do capilar e o orifício de entrada do espectrômetro (aprox. 
2cm) ( Fig. 10) 
 
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Figura 10. Esquema do ESI 
 
Posteriormente o analito percorre o túnel de íons, sofrendo uma acelaração secundária por 
um campo elétrico pulsante que geralmente varia entre 4-5 kV. Estes ¨pulsos¨são responsáveis 
pelo percurso de pacotes iônicos do analito no espectrômetro. A necessidade de criação destes 
pacotes ou discretização do sinal de entrada é uma necessidade para que o detector possa 
interpretar o sinal. Devido a que o ESI produz íons de carga múltipla, compostos de alto peso 
molecular são observáveis a em regiões de baixo m/z, o que incrementa a faixa de massa que pode 
ser analisada, por exemplo um íon de 5000 u e carga de +10 é observado a m/z de 500 e pode ser 
analisado facilmente num analisador quadrupolar. Para esta técnica de ionização podem ser 
utilizadas duas formas de inserção de amostra: a primeira, via sistema cromatográfico de micro o 
nanofluxo, e o segundo, por injeção direta utilizando uma seringa acoplada a uma bomba de micro 
ou nanofluxo (Fig. 11). 
 
 
 
Figura 11. Formação de íons mediante a técnica de ESI. 1) formação do spray 
eletricamente carregado, 2) redução do tamanho da gota e 3) liberação dos íons desolvatados 
 
 
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Aplicações do ESI 
ESI é uma ferramenta versátil para a caracterização e sequenciamento de peptídeos e proteínas, 
porém pode resultar útil em outros campos como: 
-ESI de moléculas pequenas: analitos polares entre m/z 100-1500 são frequentemente envolvidos 
em análise farmacêuticos e inclusive estúdios metabólicos. Exemplo, detecção do composto 
funcional da droga BM 50,0341 inibidor do HIV-1 
-ESI de complexos metálicos 
-ESI de surfactantes 
-Oigonucleotideos, DNAe RNA: são melhor estudados no modo negativo 
-Oligossacarídeos e otros compostos relacionados como glicoproteínas, gangliosideos, 
lipossacarideos e oligonucleotideos, requerem solventes polares e ionização suave, especialmente 
quando a estrutura é ramificada. ESI permite determinar massa molecular, e elucidação da 
estrutura. 
 
Atmospheric pressure chemical ionization (APCI). A ionização química a pressão 
atmosférica (APCI) é uma técnica que utiliza reações íon-molécula em fase gasosa, sob pressão 
atmosférica com a finalidade de ionizar o analito. É um método semelhante a CI onde os íons 
primários são produzidos por descarga corona em um spray do solvente. APCI é aplicado tanto 
para compostos polares como para compostos de baixa polaridade com peso molecular de até 
1500 Da e produz íons geralmente monocarregados (APCI não é útil para compostos termolábeis). 
A mistura analito-solvente é inserida em um nebulizador pneumático onde é convertida em uma 
névoa fina por um jato de nitrogênio em alta velocidade. As gotículas são deslocadas pelo fluxo de 
gás para um tubo de quartzo aquecido, denominado câmara de dessolvatação/vaporização. O calor 
transferido para as gotas pulverizadas (entre 350oC - 450oC a fluxos entre 0,1-2mL/min ) permite a 
vaporização da fase móvel e do analito. As moléculas da fase móvel e do analito vaporizadas 
deixam esta câmara e são direcionadas para a região de descarga corona. Um potencial (3-5kV) é 
aplicado na extremidade da agulha de descarga corona para produzir uma corrente de descarga 
corona. A descarga corona forma íons-reagente mediante uma série de reações químicas entre as 
moléculas da fase móvel e o gas de Nitrogênio. A descarga coronasubstitui o filamento de elétrons 
do CI e produz N2+ e O2+ por ionização de elétrons, que são denominados de íons primários. Esses 
íons primários colidem com moléculas de solvente vaporizadas para formar íons secundários 
reativos na fase gasosa como H3O
+ e [(H2O)n] H
+ (Fig. 12 a e 12 b): 
1. Formação de íons primários: 
e- + N2 N2
+ + 2e- 
 
2. Formação de íon secundários: 
N2
+ + H2ON2+H2O
+ 
H20
+ + H20H3O
+ +HO- 
 
3. Transferência de prótons 
H3O
+ +M (M+ +H)+ + H2O 
 
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Descarga corona: descarga elétrica produzida pela ionização de um fluido nas redondezas de 
um condutor. A descarga corona é formada pela emissão de elétrons por eletrodos de alta 
tensão. 
 
 
 
 
 
 
Figura 12. A-esquema APCI e B- visão detalhada da descarga de corona e formação de íons 
primários e secundários 
 
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Atmospheric Pressure Photoionization (APPI): Experimentalmente pode se descrever a APPI 
como uma fonte APCI na qual a agulha de descarga corona tem sido substituída por uma lâmpada 
de Criptônio. Nesta técnica os íons são gerados a partir de moléculas quando estas interagem com 
fótons provenientes de uma fonte luminosa como a lâmpada de Kr. APPI gera íons moleculares a 
partir de moléculas que possuem um potencial de ionização menor que a energia do fóton da luz 
emitida pela fonte luminosa (aprox.10eV). 
Na APPI os íons são produzidos e analisados assim: 
1. O capilar produz um spray da mistura analito-solvente 
2. As gotas são vaporizadas por aumento de temperatura na região de vaporização 
3. As moléculas do analito interagem com a luz proveniente de lâmpada de Kr e a molécula 
do analito M é ionizada em íon molecular se o potencial de ionização do analito é menor do 
que a energia do fóton hv : M + hv M++ e- 
4. Na presença de solventes próticos o íon do analito pode extrair um hidrogênio para formar 
(M+H)+: M++S(M+H)++(S-H) 
5. Os íons do analito passam através do capilar de transferência e entram ao espectrômetro 
para serem analisados 
Moléculas como esteroides, drogas e pesticidas tem potencial de ionização menor que a 
energia dos fótons e moléculas protonadas podem ser geradas. APPI reduz a fragmentação dos 
íons moleculares devido a que pouca quantidade de energia é depositada na molécula. Por outro 
lado moléculas de nitrogênio provenientes do sheath gas e auxiliary gas e solventes usados na 
LC/MS não são ionizados devido a que seu potencial de ionização é superior à energia dos fotons. 
O resultado é uma ionização seletiva do analito. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
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Comparação ESI, APCI e APPI 
 ESI APCI APPI 
1. Mecanismo de ionização Voltagem aplicada à ponta do 
capilar que conduz a mistura 
analito-solvente. 
Voltagem aplicada a uma agulha 
na saída do nebulizador 
pneumático. 
Interação com fótons 
provenientes de uma lâmpada de 
Kr 
2. Formação de íons As moléculas são ionizadas na 
fase condensada por imposição 
de um campo elétrico externo. 
Íons formados por protonação 
Moléculas do solvente em fase 
gasosa são ionizadas pela 
descarga corona. Os íons 
reagentes do solvente ionizam as 
moléculas do analito por 
transferência de cargas. Íons 
formados por protonação 
Moléculas do analito em fase 
gasosa são ionizadas quando 
interagem com fótons da fonte 
luminosa. As moléculas só serão 
ionizadas se o seu potencial de 
ionização e inferior à energia do 
fóton emitido. Íons moleculares 
formados M+ 
3. Formação do spray O spray eletrolítico é formado 
pela deformação da gota 
formada na extremidade do 
capilar devido à diferença de 
potencial e ao fluxo constante da 
mistura analito-solvente que é 
bombeado 
Spray formado por um 
nebulizador assistido 
pneumaticamente 
Spray formado por um 
nebulizador assistido 
pneumaticamente 
4. Íons produzidos São produzidos íons de carga 
múltipla nas polaridades positiva 
e negativa segundo selecionado 
São produzidos principalmente 
íons monocarregados (M+H)+ ou 
(M-H)- dependendo da polaridade 
selecionada 
São produzidos íons do analito 
M+. 
Na presença de solvente próticos 
podem ser produzidos íons 
(M+H)+ 
5. Fragmentação Alguns íons moleculares podem 
sofrer fragmentação devido ao 
excesso de energia 
Devido ao uso de aquecimento 
pode ser observada fragmentação 
de íons moleculares 
Fragmentação reduzida dos íons 
moleculares devido a que pouca 
quantidade de energia é 
depositada na molécula 
6. Aplicações Útil no estudo de compostos 
polares e apolares de alto peso 
molecular, termolábeis. Ex. 
Útil no estudo de compostos de 
baixa polaridade , termoestáveis 
que no possuam elevado peso 
Útil no estudo de compostos 
apolares como esteroides, drogas 
e pesticidas que tem baixo 
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proteínas e peptídeos molecular potencial de ionização. 
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Matrix Assisted Laser Desorption/ Ionization (MALDI): Esta técnica se fundamenta na geração de 
íons em fase gasosa por desorção /ionização de uma matriz cristalina formada de pequenas 
moléculas voláteis. Na análise por MALDI o analito é solubilizado em uma solução de moléculas 
orgânicas conhecida como matriz, usualmente um ácido fraco que absorve na região de UV. Essa 
mistura matriz –analito é aplicada em uma placa metálica que conduz corrente elétrica. Com a 
evaporação do solvente ocorre a formação de um cristal (analito+matriz). A placa é introduzida na 
região de vácuo onde o cristal é irradiado por um laser que inicia o evento de desorção/ionização, 
gerando simultaneamente pacotes de íons de diferentes m/z. As moléculas são dessorvidas da 
placa por evaporação ocorrendo a formação de uma fase gasosa altamente energética atribuída a 
excitação eletrônica das moléculas da matriz ao absorver energia do laser. A formação dos íons 
ocorre mediante transferência de carga das moléculas da matriz para o composto. Os íons 
formados recebem uma alta energia cinética inicial que os impulsiona para o analisador de massas. 
A matriz tem um papel fundamental uma vez que absorve fortemente a energia do laser causando 
indiretamente a vaporização do analito. Adicionalmente a matriz serve como um doador e 
receptor de prótons, ionizando o analito no modo positivo ou negativo respectivamente. 
Algumas caraterísticas do MALDI: 
- Essencialmente são observados apenas íons monocarregados 
-Íons positivos ou negativos podem ser observados dependendo da polaridade selecionada, porém 
espectros de íons positivos ou negativos não são complementares. Sinais obtidos no modo 
negativo são usualmente menos intensos 
-Todas as matrizes usadas contém grupos funcionais (SH, OH ou NH) 
-Baixas concentrações de sais e detergentes podem ser toleradas, porém a qualidade e 
sensibilidade da análise pode ser ver comprometida. 
-É uma técnica de baixa resolução se comparada a outros métodos de ionização 
-A matriz pode gerar um ruído que pode interferir com a observação de picos de íons de baixo 
peso molecular 
-Existe a possibilidade de fotodegradação da amostra durante o evento de desorção/ionização 
 
 Analisadores de massa 
 
Quadrupolos lineares. O quadrupolo é o analisador de massas mais utilizado em espectrometria 
de massas. Em um espectrômetro de massas quadrupolar o quadrupolo é responsável por filtrar os 
íons com base em sua relação m/z. Os íons são separados com base na estabilidade das suas 
trajetórias em um campo elétrico sendo este criado por oscilações elétricas criadas nos cilindros 
metálicos. Um analisador de massas quadrupolar consiste em quatro cilindros metálicos paralelos 
nos quais se aplicam uma corrente elétrica DC e um potencial RF alternante. Os íons produzidos na 
fonte de ionização são focalizadosao centro da região entre os quatro cilindros e atravessam o 
quadrupolo axialmente. Suas trajetórias serão dependentes ao campo elétrico produzido, onde 
apenas ions de uma particular m/z terão uma trajetória estável e chegarão ao detector, gerando 
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assim um espectro de massas. Todos os outros valores de m/z terão trajetórias instáveis e irão 
colidir com os cilindros ou escapar não atingindo o detector (Fig. 13) 
 
 
 
Figura 13. Esquema do analisador quadrupolar 
 
Armadilha de íons. O ion trap pode ser representado como um quadrupolo curvado sobre 
se mesmo de modo a formar um circuito fechado. A heste interna é reduzida para um ponto no 
centro da armadilha, a heste mais externa é um eletrodo circular e as hestes do topo e do fundo 
perfazem as tampas. Estas tampas estão eletricamente conectadas e os potenciais de AC e RF 
entre elas e o eletrodo em anel. O principio do funcionamento de um Ion trap esta baseado na 
criação de trajetórias estáveis para os íons de certa m/z enquanto que os íons indesejáveis são 
removidos por colisão com a parede ou por ejeção axial do trap devido à instabilidade. O ion trap 
difere de todos os outros espectrômetros pois opera a a altas pressões, aprox. 10-1 Pa quando 
para outros quadrupolos é de 10-4 Pa. A pressão de operação adequada é mantida por um fluxo 
contínuo de gás hélio ou gas argônio para o espectrômetro de massa. O uso deste gás tamponante 
esfria os íons por colisão, reduzindo as energias de rotação e vibração, de modo a que sua 
amplitude de deslocação aleatória sobre o eixo z é diminuída, o amortecimento dos movimentos 
dos íons estende a sua m/z permitindo um armazenamento e resolução eficientes (Fig. 14) 
 
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Figura 14. Esquema do Ion trap 
 
Tempo de voo. O analisador TOF possui uma região livre de campo elétrico e baixa pressão 
onde o tempo de voo dos íons pode ser utilizado para determinação da sua m/z. Os íons adentram 
o analisador de forma intermitente (MALDI) ou contínuo (ESI ou APCI) mas são acelerados por um 
pulso de energia ou extração com potencia (V) antes de voar no vácuo por uma distância definida 
(d). o cálculo da sua m/z é efetuado medindo o tempo de deslocamento (t) dos íons até o 
detector. O tempo de deslocamento é proporcional à massa dos íons (Fig. 15) 
 
 
 
Figura 15. Esquema TOF e melhora da resolução com o Reflectron 
 
 
Os problemas de resolução no TOF são causados principalmente por variações na energia 
cinética de íons de m/z igual, levando a uma dispersão no seu tempo de chegada ao detector, 
quando compostos são vaporizados e ionizados, os íons recebem energias cinéticas diferentes 
decorrentes do processo de ionização. A utilização do reflectron ou espelho de íons é um dos 
artifícios mais comuns na melhora da resolução das análises por TOF, a função do reflectron é 
melhorar a resolução do aparelho e intensificar picos, mediante duas abordagens: a primeira, 
extensão do curso do voo do íon, e a segunda, uma ação focalizadora do feixe de íons no detector. 
O reflectron possui uma série de eletrodos anelados com diâmetros internos suficientes para 
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acomodar a trajetória dos íons. Ao trafegar pelo reflectron os íons invertem sua trajetória de voo, 
esta inversão de percurso é realizada por um campo elétrico resultante de vários eletrodos. Em 
teoria os os analisadores TOF não tem imite de massa, portanto são adequados para acoplar com 
técnicas suaves de ionização com ESI e MALDI, que podem ionizar moléculas sem causar 
fragmentação. 
Como o TOF extrai os íons de maneira pulsada, o seu acoplamento com fontes de ionização 
contínua requer algumas adaptações. Uma forma de fazer isto é estocando os íons provenientes da 
fonte em um ion trap e liberá-los para dentro do TOF em intervalos de tempo 
 
 
 
1.2 Espectrometria de massa em sequencia (Tandem MS-MSn) 
 
A MS/MS pode ser considerada um método envolvendo no mínimo duas etapas de análises 
de massas, em conjunto com um processo de dissociação ou reação química que causa uma 
mudança na massa ou carga do íon. Na MS/MS um ou mais estágios da análise de massas são 
combinados em um único experimento, cada estágio adiciona uma dimensão em temos de 
isolamento, seletividade ou informação estrutural. No experimento mais comum de 
espectrometria em tandem o primeiro analisador é usado para isolar o íon precursor, o qual sofre 
fragmentação para render íons fragmento e fragmentos neutros que são analisados em um 
segundo analisador. A fragmentação do íon precursor é realizada mediante técnicas de ativação 
como dissociação induzida por colisão CID, dissociação por transferência de elétrons ETD, entre 
outras. Existem quatro modos de varredura possíveis na MS/MS: product ion scan, precursor ion 
scan, neutral loss scan e Selected Reaction Monitoring (SRM) (Fig. 16) 
 
 Product ion scan: um íon de determinada m/z é selecionado em MS1, fragmentado na 
câmara de colisão em MS2, tendo o MS3 funcionando em modo scan para obter o espectro de m/z 
dos íos fragmento produzidos na câmara de colisão 
 Precursor ion scan: o espectro de m/z obtido fornece informações estruturais 
complementares para um determinado íon fragmento. Neste modo o MS1 funciona em modo scan 
numa determinada faixa do íon precursor, acontece a fragmentação em MS2 e em MS3 é 
selecionado somente o íon fragmento de interesse. Este modo identifica se o produto de 
fragmentação encontrado provém de um único ou mais precursores, confirmando estrutura, 
classes e/ou função química da molécula ou da mistura analisada. Os ion trap e TOF devido ao 
modo que operam são incapazes de realizar este tipo de análise 
 Neutral loss: consiste na seleção de um fragmento neutro ou perda neutra e detecção de 
todos os fragmentos que estão relacionados com seus respectivos precursores, proporcionando a 
perda neutra específica. MS1 e MS3 funcionam em modo scan, onde a diferença da varredura de 
faixa de massa entre MS1 e MS3 é igual à perda neutra 
 SRM: neste modo o sistema de MS/MS é otimizado para obter o máximo de sensibilidade 
na seleção do íon precursor em MS1, fragmentação em MS2 para que o íon fragmento de maior 
intensidade ou especificidade seja selecionado em MS3. No experimento SRM os dois analisadores 
17 
 
de massa são utilizados como filtros estáticos para monitorar um determinado íon fragmento de 
um íon precursor selecionado. O par de valores de m/z associados aos íons precursor e fragmento 
são denominados ¨transições¨ e podem ser escritos como (635,5>534,3). Ao contrario que em 
várias abordagens proteômicas, o experimento SRM não registra nenhum espectro, ao contrario o 
detector funciona como um dispositivo de contagem para os íons que coincidem com a transição e 
retornando assim valores de intensidade ao longo do tempo. No modo MRM múltiplas transições 
SRM podem ser medidas dentro de um mesmo experimento numa escala de tempo cromatográfica 
mediante rápidas alternâncias entre os pares precursor/fragmento. 
 
 
Figura. 16 Espectrometria de massas em tandem e seus principais modos de varredura 
 
 Métodos de Fragmentação (Ativação) 
Collision Induced Dissociation (CID): É o método de ativação mais comumente usado nos 
equipamentos atuais. Consiste na colisão de um íon precursor com as moléculas de um gás inerte. 
Esta reação causa um aumento na energia interna do íon que induz a uma decomposição com alta 
probabilidade de fragmentação. A colisão do íon (com alta energia cinética) com uma espécie 
neutra resulta na conversão de parte da energia cinética em energia interna causando a 
decomposição do íon. 
Higher-energy induced Dissociation (HCD): é uma técnica de CID especificapara espectrometros 
Orbitrap na qual o processo de fragmentação acontece no C-trap 
Electron Transfer Dissociantion (ETD): técnica de ionização química na qual cátions são 
fragmentados por transferência de elétrons a estes. Proteínas ou peptídeos isolados reagem com o 
radical aniônico fluroanteno o que causa uma neutralização da carga levando à formação de um 
radical o que por sua vez induz à quebra da ligação N-Cα. ETD fragmenta randomicamente ao 
longo da cadeia peptídica (entanto que cadeias laterais e modificações ficam intatas) produzindo 
18 
 
principalmente fragmentos tipo z e c que complementam os ions b e y produzidos por CID 
constituindo assim uma técnica complementar a fim de incrementar a cobertura da sequencia. 
Para abordagens top-down esta técnica pode ser combinada com Proton Transfer Reaction (PTR) a 
fim de simplificar o espectro de proteínas intactas. 
 
1.3 O ESPECTRO DE MASSAS 
O espectro de massas é uma representação bidimensional do sinal da intensidade (no eixo 
das ordenadas) versus m/z (no eixo das abcissas). A intensidade do pico, usualmente chamada de 
sinal, reflete a abundância da espécie iônica cuja respectiva razão m/z foi originada a partir da 
ionização do analito. 
A razão m/z é uma unidade adimensional , calculada a partir de m=massa do íon e z= o 
número de cargas. Usualmente o número de cargas elementares é 1 (z=1) e em cujo caso a escala 
de m/z reflete diretamente a escala de m. o valor de m foi calculado a partir da definição de unified 
atomic mass [u] definida como 1/12 da massa de um átomo de 12C. 
Usualmente o pico com a maior m/z resulta da detecção de uma molécula intacta ionizada. 
Esse íon molecular é frequentemente acompanhado de íons de menor m/z (íons fragmentos) que 
resultam da fragmentação do íon molecular. O pico mais intenso no espectro de massas é 
chamado de pico base (base peak) e na maioria dos casos a intensidade do pico base é normalizada 
a 100% (intensidade relativa) (Fig.2). 
 
Figura2. Espectro de ionização do hidrocarboneto metano (CH4). 
 
19 
 
O espectro de massas pode ser representado na forma de grafico de barras ou histograma 
em que a posição da razão m/z se define pelo seu centroide. Esta forma de apresentação do 
espectro significa uma redução dos dados gerados e é para picos bem resolvidos. Por outro lado se 
a forma e comprimento do pico (área) resultam importantes o espectro de massas é representado 
no modo data profile como é normalmente adquirido no espectrometro. Listas tabulares são 
também utilizadas para apresentar os dados de m/z e intensidade de forma mais precisa (Fig.3). 
 
Figura 3. Representação do espectro de um íon molecular. A. profile spectrum. B. 
Centroide e C. Tabular 
 
1.4 Alguns conceitos importantes 
 
 Massa nominal: é definida como a massa total dos isótopos estáveis de um elemento que 
ocorrem naturalmente. A massa nominal de um elemento é usualmente igual a massa total 
da massa do menor isótopo de tal elemento. A massa nominal de um íon resulta da soma 
das massas nominais dos elementos na sua formula empírica. Ex: a massa nominal do 
composto CO2 é calculada de 12u + 2x 16u=44u 
 Massa isotópica ou massa exata: é a massa exata de um isótopo. É próxima mas não igual 
à massa nominal. A única exceção é o isótopo do 12C cuja massa isotópica é 12,0000 u. A 
massa atômica unificada [u] é definida como 1/12 da massa de um átomo de 12C a qual tem 
sido assignada a 12u exatamente, por convecção 1u=1,66055 x10-27 kg 
 Massa atômica relativa (Mr): é calculada a partir da abundância e respectiva massa 
isotópica dos isotopos que naturalmente ocorrem de um elemento. A massa molecular 
relativa é calculada a partir da somatória das Mr dos elementos que contribuem na sua 
fórmula empírica: 
 
20 
 
 Massa monoisotopica: massa exata do mais abundante isótopo de um elemento. A massa 
monoisotopica de uma molécula resulta da somatória das massas monoisotopicas dos 
elementos da sua fórmula empírica 
 Íons isobáricos: íons que tem a mesma massa nominal porém diferente massa isotópica. 
Exemplo: os íons moleculares N2, CO e C2H4 tem a mesma massa nominal 28u, ou seja são 
íons isobáricos. A massa isotópica dos isótopos mais abundantes de hidrogênio, carbono, 
nitrogênio e oxigênio é 1,007825u, 12,0000u,14,003070u e 15,994915u, respectivamente. 
Usando estes valores para calcular a massa iônica o resultado é 28,00559u para N2, 27, 
99437u para CO e 28, 03075u para C2H4. 
 Precisão (Mass accuracy): é definida como a diferença entre a massa precisa medida e a 
massa calculada exata, pode estar dada em unidades absolutas [u] ou realtivas [ppm] 
 Resolução: uma boa acurácia somente pode ser obtida a partir de sinais fortes, e fortes o 
suficiente para ficarem separadas uma da outra. A habilidade de um instrumento de 
realizar esta separação é conhecida como poder de resolução, e obtida da medição da 
largura do pico expressada em função da sua massa. O termo resolução (R) descreve 
essencialmente o mesmo, a razão massa de interesse m a diferença de massa delta m 
(largura do pico a uma fração específica da altura do pico: 
 
 
Figura 4. Ilustração das definições de resolução R10% e FWHM 
Dois picos se consideram distintos quando o vale que os separa não supera o 10% da altura da sua 
intensidade. Com a chegada de analisadores quadrupolares e TOF foi introduzido um outro termo 
full width at a half maximum (FWHM) (Fig.5): 
21 
 
 
Figura 5. Pico de m/z 92 em diferentes resoluções 
 
2. High Performance (Pressure) Liquid Cromatography (HPLC) 
A cromatografia líquida é uma técnica analítica que se fundamenta na separação dos 
componentes de uma amostra em função à sua afinidade por um material ativo ou adsorvente. A 
separação da amostra dá-se pela migração da mesma através da fase estacionaria (FE) com ajuda 
de um fluído ou fase móvel (FM). Os componentes da amostra se distribuem entre as duas fases e 
viajam mais lentamente que a FM devido ao efeito retardante da FE. A fase móvel é descrita 
como um fluido que passa através da fase estacionaria em uma direção definida, pode tratar-se de 
um líquido, um gás, enquanto a fase estacionaria pode tratar-se de um sólido, um gel ou um 
líquido, se se trata de um líquido o mesmo deverá estar distribuído sobre um material sólido, o qual 
pode ou não contribuir ao processo de separação. 
As principais etapas da HPLC incluem: 
1- A amostra é dissolvida em um solvente e introduzida na coluna cromatográfica preenchida 
com a FE 
2- A FM contida no reservatório é bombeada com vazão constante e desloca os componentes 
da amostra através da coluna. Esses componentes se distribuem entre as duas fases de acordo 
com a sua afinidade. Assim substâncias com mais afinidade pela FE movem-se mais lentamente 
que aquelas com maior afinidade pela FM 
3- Ao sair da coluna, os componentes passam por um detector que emite um sinal elétrico o 
qual é registrado constituindo um cromatograma 
 
Na HPLC a fase móvel é um líquido injetado a alta pressão (4 x 107 Pa) a fim de garantir um 
fluxo constante, e a fase estacionaria se encontra empacotada na coluna sendo capaz de suportar 
as altas pressões da injeção. São as forças físicas e químicas que atuam entre os solutos e as duas 
fases as responsáveis pela retenção dos solutos na coluna cromatográfica. A diferença na 
magnitude dessas forças determina a resolução e por tanto separação dos solutos individuais. As 
forças elementares que agem sobre as moléculas podem ser: interações de van der Waals, 
interações dipolo induzido, ligações de hidrogênio, interações dielétricas e interações 
22 
 
eletrostáticas. Duassituações extremas podem acontecer: na primeira todos os analitos 
apresentam total afinidade pela fase móvel e não interagem com a fase estacionaria, atingindo 
assim o detector de forma muito rápida sem que aconteça a separação. Na segunda situação todos 
os analitos tem total afinidade pela fase estacionaria e não interagem com a fase móvel, ficando 
retidos na coluna e não atingindo o detector. 
Na HPLC a fase móvel deve ser um solvente no qual os analitos são solúveis, na maioria das 
vezes a separação é feita em cromatografia de fase reversa na qual a fase móvel é mais polar do 
que a fase estacionaria, neste sistema os analitos mais polares eluem mais rapidamente que 
aqueles menos polares. Não sempre é possível realizar uma boa separação usando uma fase móvel 
contendo um único solvente, uma vez que uma amostra complexa pode ter componentes de 
diferentes polaridades, por isso misturas de solventes são usualmente utilizadas, variando a 
composição da fase móvel de forma controlada durante a análise. 
Uma separação envolvendo uma fase móvel de composição constante é denominada de 
eluição isocrática ou fluxo isocrático, enquanto que uma fase móvel de composição variável é 
chamada de eluição gradiente. 
Um sistema cromatográfico possui cinco componentes principais (Fig. 17): 
- Reservatório e sistema de bombeamento da FM 
-Sistema de introdução da amostra 
-Sistema analítico: coluna cromatográfica+termostato 
-Sistema de detecção: composto por um ou mais detectores 
-Sistema de registro e análise de dados 
 
 
 
 
Figura 17. Esquema de um típico sistema de HPLC 
 
1- Reservatório e sistema de bombeamento da FM 
 Filtro do reservatório: capta a A FM e evita que partículas obstruam a coluna 
cromatográfica ou danifiquem as bombas 
 Fase móvel: deve ser de alta pureza, dissolver a amostra sem degradar seus componentes, 
não degradar ou decompor a FE, ter baixa viscosidade, compatível com o tipo de detector, 
polaridade adequada que permita a separação dos componentes 
 Degasificador: a degasificação da FM garante vazão constante e estabilidade da linha de 
base. Existem vários métodos de degasificação. Ex: ultrassom, purga com hélio, vácuo, 
degasificador on-line 
23 
 
 Bomba: tem como finalidade bombear a FM de forma constante através do sistema 
cromatográfico. Algumas características da bomba incluem reprodutibilidade e precisão, vazão 
continuada sem pulsos, vazão constate independente da pressão, operar em alta pressão e 
resistência à corrosão. As bombas podem ser pneumáticas, por deslocamento ou recíprocas. O 
bombeamento pode ser isocratico ou por gradiente. Quando isocratico a composição da fase 
móvel é mantida constante durante toda a análise, nesse caso utiliza-se apenas uma bomba. No 
caso de bombeamento por gradiente a fase móvel sofre alteração durante a análise, isso a fim de 
diminuir o tempo de análise e melhorar a separação dos componentes da amostra. O 
bombeamento por gradiente pode ocorrer a baixa pressão ou a alta pressão. No caso de 
bombeamento a baixa pressão utiliza-se uma única bomba e a seleção do solvente a ser utilizado é 
realizada mediante a válvula de múltiplas vias controladas pelo software do sistema. Já no caso do 
bombeamento a alta pressão cada solvente tem uma bomba específica 
 
2- Sistema de injeção da amostra 
 
A injeção da amostra é realizada com auxílio de válvulas especiais que permitem a 
introdução com grande precisão de volumes pequenos. A amostra é introduzida na válvula com 
auxilio de uma microseringa, a injeção é efetuada pela rotação da válvula da posição ¨carga¨para a 
posição ¨injeção¨. A injeção da amostra pode ser feita manualmente ou mediante um amostrador 
automático, este último mede o volume exato a ser injetado, injeta a amostra e prepara o injetor 
para uma próxima amostra. 
 
Figura 18. Sistema de injeção de amostra nas posições ¨carga¨e ïnjeção¨ 
 
Para aproveitar todos os pratos da coluna o volume injetado não deverá ser superior a 1% do 
volume da coluna vazia, levando em consideração que: 
V= hπr2 
V= volume em microlitros 
h= comprimento da coluna em mm (1mm=1000µm ; 1cm=10mm) 
r= radio interno da coluna em mm 
3- Sistema analítico 
 Colunas analíticas: as colunas capilares usualmente tem comprimento de 10-50 cm e i.d de 
75-100 µm, sendo o tamanho da partícula da FE de aprox. 3µm. As colunas devem ser mantidas 
24 
 
termostatizadas em um forno, devido a que o tempo de retenção e a pressão dependem da 
temperatura. Colunas com menor diâmetro interno operam com fluxos menores e possuem mais 
sensibilidade. 
 Pre-colunas (guard-columns): as colunas capilarares trap, usualmente tem um 
comprimento de 3-5cm e i.d de 100µm, sendo empacotadas com partículas de aprox. 5µm. Estas 
colunas protegem e aumentam a vida útil da coluna analítica, são do mesmo material de 
empacotamento da coluna analítica e são descartáveis. 
 Fase estacionária: existem vários tipos de materiais que podem ser usados como fase 
estacionaria. Sólidos a base de sílica são os mais utilizados atualmente; sólidos semi-rígidos 
constituídos de partículas porosas de poliestireno e usados em troca iônica e exclusão molecular; 
sólidos não rígidos como dextrose ou agarose usados na cromatografia de exclusão. A fase 
estacionaria quimicamente ligada, são as FE mais importantes da cromatografia líquida, obtidas 
pela reação de grupos silanois da sílica com compostos contendo grupos polares ( fase norma) ou 
não polares (fase reversa). Na fase quimicamente ligada, a sílica gel, mediante grupamentos Si-OH, 
se liga fortemente a um grupo funcional que lhe confere grande estabilidade química. A 
cromatografia de fase ligada é subdividida em Fase Normal ou Fase Reversa de acordo com a 
polaridade dos grupos funcionais ligados à sílica gel. 
-Fase NormaL: grupos funcionais polares são ligados à matriz da sílica. A técnica em geral 
substitui com vantagens à cromatografia por adsorção. Os grupos funcionais comumente usados 
são DIOL, CYANO, AMINO. A FM utilizada para esta técnica é de baixa polaridade como hexano, 
clorofórmio ou acetato de etila. Algumas características da fase normal incluem: fase estacionaria 
polar, fase móvel apolar, solutos neutros, quanto maior a polaridade do soluto maior seu tempo de 
retenção e o mecanismo de retenção é por adsorção. Na cromatografia em fase normal o 
componente menos polar elui primeiro, devido a sua maior solubilidade na FM, aumentar a 
polaridade da FM tem o efeito de diminuir o tempo de retenção. 
-Fase Reversa: se fundamenta na separação de moléculas de acordo a sua hidrofobicidade. 
Os grupos funcionais ligados à base de sílica são apolares. Os analitos são atraídos para a superfície 
pelos seus grupos funcionais não polares. O analito mais polar elui primeiro, seguido dos outros 
em ordem decrescente de polaridade. Os grupos butil, octil, octadecil e fenila são os grupos 
funcionais mais utilizados. Algumas características da fase reversa incluem: fase estacionaria 
apolar, fase móvel polar como água, metanol, acetonitrila. Solutos apolares, não iônicos. Quanto 
menor a polaridade da FM menor o tempo de retenção. O mecanismo de retenção envolvido são 
interações hidrofóbicas. Esta fase estacionaria é utilizada em cromatografia também para 
desalinizar e concentrar moléculas de uma amostra, uma vez que sais iônicos passam através da 
coluna enquanto os componentes hidrofóbicos ficam retidos e concentrados na coluna até serem 
removidos por uma única eluição em step. 
 
 
25 
 
4- Detectores 
O detector é um dispositivo conectado na saída da coluna que percebe a presença de 
componentes e emite um sinal elétrico a ser registrado na formade pico, cuja área é proporcional à 
quantidade do componente analisado. Um detector ideal deve possuir as seguintes características: 
-Estabilidade frente a mudanças de pressão e vazão 
-Sensibilidade 
-Resposta lineal em relação à concentração do analito 
-Não contribuir com o alargamento do pico 
-Resposta rápida ao analito 
-Facilidade de manuseio 
-Não destrutivo, deve permitir coletar o eluato e ainda utilizar um segundo detector 
-Seletividade, habilidade de medir um composto e outro não 
-Reprodutibilidade 
Existem diversos tipos de detectores: 
 Índice de Refração (IR): Quando um feixe de luz passa de um meio a outro, este muda de 
velocidade. Se o feixe atinge o segundo meio em um ângulo (ângulo de incidência) que não é 
perpendicular à superfície do meio a luz é refratada. Os detectores de IR usam uma luz 
monocromática de comprimento de onda fixo e detectam a posição do feixe de luz refratada 
(ângulo de refração), criando um sinal que difere do sinal da linha de base. A medição em que um 
meio refrata a luz é o índice de refração (IR). Uma vez o analito passa pelo detector pode acontecer 
uma alteração no índice de refração em relação ao valor detectado da fase móvel livre do analito, 
só sendo possível quando o valor do IR do analito é diferente do IR da FM. Este detector é usado 
quando o analito não absorve na região UV-VIS, é utilizado na análise de lipídeos, carboidratos e 
açúcares em geral. As desvantagens deste detector incluem, baixa sensibilidade, não permite 
análises por gradiente pois a mudança na concentração da FM causa mudanças no IR, a 
temperatura e pressão devem ser constantes, pois causam variações do IR. 
 UV-VIS: baseiam-se na absorbância da luz pelo analito ao passar pelo detector. É um tipo 
de detector seletivo uma vez que só detecta analitos que absorvem no comprimento de onda em 
que o detector foi ajustado. É importante que a FM utilizada seja de alta pureza pois impurezas 
podem absorver no comprimento de onda selecionado. Os detectores UV-VIS estão compostos por 
uma fonte de luz (lamapadas de deutério-D2 ou tugstenio-W), um monocromador que permite 
selecionar o comprimento de onda, um célula de fluxo por onde passará a amostra, o detector e 
um processador de sinias. 
26 
 
Existem três tipos de detectores UV-VIS, os fotométricos (detectam em λ fixo), os 
espectrofotométricos (detectam em λ variável) e a rede de diodos ou Photodiode array PDA. Nos 
espectrofotométricos o comprimento de onde pode variar entre 190-800nm. Com ajuda do 
monocromador é selecionado o comprimento de onda desejado do feixe de luz emitido pelas 
lâmpadas (UV 210-380nm=lâmpada de deutério e VIS 380-800nm=lâmpada de tungstênio). O feixe de luz 
emitido pela lâmpada de deutério ou tungstênio incide na cela por ondem passam os componentes 
da amostra que absorve parte da luz dependendo de sua absortividade e concentração. A luz não 
absorvida é detectada pela fotomultiplicadora que amplia o sinal e o envia para um sistema de 
registro de dados. No caso dos PDA é possível realizar análises em diferentes comprimentos de 
onda simultaneamente devido ao arranjo de grande número de fotodiodos que permitem 
determinar o espectro de absorbância de uma amostra durante sua eluição. 
 Eletroquímicos (DEC): medem a corrente elétrica gerada por eletrólitos eletroativos 
presentes na amostra. Em um processo eletroquímico um par de eletrodos é colocado na cela e 
um potencial é aplicado provocando uma reação de redução ou oxidação gerando uma corrente 
que é medida em um detector eletroquímico. A corrente gerada é proporcional à concentração do 
composto. Os DEC podem ser amperométricos ou coulométricos. 
 Detector de condutividade (DC): soluções contendo componentes iônicos conduzem 
eletricidade. O DC mede a resistência elétrica e o valor obtido é diretamente proporcional à 
concentração de íon na solução. Este tipo de detector se usa especialmente em cromatografia 
iônica. 
 Detector de fluorescência (DFL): Em um λ específico os átomos de uma amostra são 
excitados emitindo um sinal luminoso (fluorescência). A intensidade dessa luz emitida é 
monitorada para quantificar a concentração do analito. A maioria dos fármacos, produtos naturais, 
amostras clínicas e derivados do petróleo apresentam absorção fluorescente, aqueles que não 
apresentam ou tem baixa absorbância podem ser tratados com cloreto de dansila (DNSC), um 
reagente fluorogênico que reage com aminas primárias e secundárias, formando derivados 
fluorescentes relativamente estáveis. A reação é alcançada normalmente em pH alcalino e o 
reagente deve ser aplicado em excesso para garantir uma reação com todos os grupamentos 
amina, o coeficiente de exintação molar é de 3300. 
 Detector de quimiluminescência (DQ):semelhante ao detector de fluorescência, mas ao 
invés de utilizar uma fonte de luz para excitar os átomos do analito a excitação é iniciada por uma 
reação química. 
 
Detector Principio Sensibilidade Aplicações Seletividade Quant. Min. 
detectável 
Inidice de 
Refração 
Mudança no IR da FM -sensível a 
mudanças de 
temperatura, 
mudanças na 
concentração da FM 
-Não é útil em 
eluição por 
gradiente 
Detecção de 
carboidratos e 
açúcares 
Não seletivo Micrograma 
UV-VIS Absorbância da luz na -Não é sensível à detecta de Média: compostos Nanograma 
27 
 
região UV-VIS temperatura nem a 
mudanças da 
concentração da FM 
-Útil para uso de 
gradientes 
-sensível a presença 
de impurezas na FM 
compostos que 
absorvem no λ 
selecionado. Ex: 
peptídeos e 
alguns 
aminoácidos, 
compostos 
aromáticos 
policíclicos e 
dupla ligação 
que não absorvem 
na UV-VIS não serão 
detectados 
Eletroquímico Oxidação ou redução 
por aplicação de um 
potencial fixo 
-sensibilidade media 
à temperatura e a 
mudanças da FM 
-Não é útil com 
gradientes 
Espécies que 
oxidam ou 
reduzem 
Seletivo: depende 
das propriedades do 
composto 
Fentograma 
Condutividade Condutividade elétrica 
devida à presença de 
íons 
-sensibilidade media 
à temperatura e 
mudanças da FM 
-Não é útil com 
gradientes 
Cromatografia 
por troca iônica 
Seletividade media: 
amostra deve 
conter espécies 
iônicas 
 
Fluorescência Excitação com luz e 
emissão de 
fluorescência 
-não apresenta 
sensibilidade à 
temperatura nem 
mudanças da FM. 
-Útil com gradientes 
Derivados de 
petróleos, 
amostras 
clínicas e 
produtos 
farmacêuticos 
Altamente seletivo: 
apenas compostos 
que emitem 
fluorescência 
poderão ser 
detectados 
<Picograma 
Quimiluminescên
cia 
Excitação gerada por 
uma reação química e 
consequente emissão 
de fluorescência 
-mudanças de 
temperatura podem 
impedir a reação 
química de 
excitação 
 Altamente seletivo <Picograma 
 
2.1 Processos de interação em análise cromatográficos 
 
 Adsorção: também chamada de cromatografia líquido-sólido se baseia na competição que 
existe entre as moléculas da amostra e as da FM pelos sítios ativos na superfície da FE. Para que 
a molécula do soluto possa ser adsorvida na FE, primeiro uma molécula da FM precisa ser 
deslocada da superfície. É importante que as partículas da FE apresentem grande área 
superficial, ou seja, grande número de sítios ativos. Supondo um adsorvente que possui uma 
superfície polar, os grupos não polares terão pouca afinidade pela coluna e não irão deslocar as 
moléculas da fase móvel, por isso não serão retidos. Porém grupos polares capazes de formar 
pontes de hidrogênio terão forte afinidade pela superfície e serão retidos, assim o grau de 
retenção depende da polarização ou grupo funcional. Muitas vezes devido a uma forte 
adsorção de alguns componentes da amostrana superfície ativa, é necessário aumentar a 
polaridade da FM de maneira constante e uniforme, com o qual se consegue o deslocamento do 
analito devido à competição da FM com o mesmo pelos sítios ativos da FE, ao mesmo tempo 
que ocorre um incremento da solubilidade dos componentes da amostra na FM. Na adsorção se 
tem seguinte equilíbrio 
 
Kads=[adsorvido na FE]/[desorvido da FM] 
 
28 
 
 Partição: conhecida como cromatografia líquido-líquido, o mecanismo de partição ou 
distribuição deste tipo de cromatografia baseia-se nas diferentes solubilidades que apresentam 
os componentes da amostra na FM e na FE. Assim os componentes mais solúveis na FE serão 
seletivamente retidos por ela, enquanto os menos solúveis serão transportados mais 
rapidamente pela FM. Assim compostos com diferentes constantes de partição são separados. 
O maior inconveniente desta técnica é a solubilidade da FM na FE. Isto pode ser resolvido 
saturando a FM com a FE ou utilizando materiais que contenham a FE quimicamente ligada a um 
soporte sólido. 
Kpart= [dissolvido na FE]/[dissolvido na FM] 
 Troca iônica: baseia-se a interação eletrostática dos componentes da amostra com os grupos 
funcionais da FE,e permite separar moléculas em função à sua diferença de carga neta 
superficial. As moléculas da amostra podem apresentar diferentes graus de interação com a 
coluna devido à densidade de cargas, carga total e distribuição de cargas na superfície. Os 
grupos carregados que contribuem com a carga superficial neta possuem diferentes valores de 
pKa dependendo da sua estrutura e ambiente químico. Nesta técnica a FE possui grupos iônicos 
quimicamente ligados que podem funcionar com trocadores de cátions ou ânions. Esses 
grupamentos apresentam contra-íons que são deslocados pelos íons da amostra, ex: 
M+ + R-SO3
-Na+  Na+ + RSO3
-M+ 
M+= amostra 
SO3
-=trocador catiônico 
Na+=contra-íon 
Uma proteína que não tem carga neta a um determinado pH é equivalente ao seu ponto 
isoelétrico, não irá interagir com a coluna, porém a um pH acima do seu pI, a proteína irá 
interagir com uma coluna de troca aniônica e a um pH abaixo do seu pI a coluna irá interagir 
com uma coluna de troca catiônica. O pH e força iônica do tampão de equilíbrio são 
selecionados de modo a garantir que quando a amostra seja aplicada a proteína de interesse se 
ligue à coluna e a maioria das impurezas não se ligue. Uma vez que toda a amostra termina de 
ser aplicada a coluna é novamente lavada para retirar todas aquelas moléculas que não se 
ligaram. As condições então são mudadas a fim de eluir a amostra que ficou retida na coluna. 
Frequentemente as proteínas são eluidas por um incremento na força iônica (concentração de 
sal) ou por mudança do pH. Como a força iônica se incrementa, os íons (Na+ e Cl-) compitem 
com as moléculas ligadas pelas cargas da superfície da coluna e uma ou mas espécies ligadas 
começam a ser eluidas. As proteínas com menos cargas em um determinado pH eluirão 
primeiro conforme aumenta a foça iônica. Da mesma forma proteínas com mais numero de 
cargas serão mais fortemente retidas e eluirão por último. Assim quanto maior a carga da 
proteína maior a força iônica necessária para sua eluição. 
Os materiais de recheio usados para a TI apresentam grupos iônicos quimicamente ligados 
a partículas porosas de resinas poliméricas ou não porosas, com partículas de 3-200µm. 
29 
 
Algumas das mais utilizadas são a MiniBeads e Sepharose. Os grupos funcionais ligados à matriz 
da coluna são os que determinam a carga da coluna, alguns trocadores aniônicos são: amônio 
quaternário (Q), DEAE e ANX, e alguns torcadores catiônicos são sulfopropil (SP), metilsulfonato 
(S) e carboximetil (CM). Os termos ¨forte¨e ¨fraco¨ se referem a variação que os grupos 
funcionais podem sofrem em diferentes pHs, assim trocadores iônicos fortes não apresentam 
variação na troca de ions quando muda o pH, estes trocadores não doam nem recebem protons. 
Por outro lado trocadores fracos podem ganhar ou perder prótons com mudanças de pH e sua 
capacidade de troca iônica varia, porém uma vantagem é que eles oferecem diferente 
seletividade se comparados aos trocadores fortes. 
A capacidade da IEX é uma medida quantitativa da sua habilidade de reter contra-íons, e a 
capacidade iônica total corresponde ao número de grupos funcionais carregados por mL do 
material de empacotamento. A capacidade de ligação, ou seja a quantidade de proteína que 
pode ser retida pela coluna depende do tamanho molecular da proteína (que afeta a sua 
habilidade de penetrar nos poros da matriz) e sua relação carga/pH. 
 
 
A separação por IEX inclui as seguintes etapas: 
1-Equilibrar a coluna com 5-100 volumes da coluna (VC=1mL) do tampão até estabilizar a linha de 
base 
2-Ajustar a amostra ao pH do tampão de equilíbrio e aplicar a amostra 
3-Lavar a coluna com 5-10 VC até estabilizar a linha de base, isto a fim de retirar todo o material 
que não ficou ligado na coluna 
4-Começar a eluição usando um gradiente de 10-20 VC incrementando a força iônica até 0,5 M de 
NaCl (50% de B) 
5-Lavar a coluna com 5CV de 1M de NaCl (100% B) para eluir o material remanescente 
6-Reequilibrar a coluna com o tampão inicial 
Os processos de IEX dependem muito da temperatura, uma vez que o valor de pKa dos 
tampões utilizados pode ser ver afetado pelas mudanças de temperatura portanto é necessário 
ter algum sistema de controle térmico quando for empregada este tipo de FE. 
30 
 
A eluição dos analitos da coluna cromatográfica pode ser feita por gradiente ou por step. A 
eluição por gradiente linear é útil para realizar separações com alta resolução de amostras 
desconhecidas ou seja quando a maior quantidade de analitos deve ser retida na coluna e 
eluidos diferencialmente para ver o perfil total da amostra. Eluição por gradiente e usando 
tamanhos de partícula menores são também úteis em etapas finais de purificação de um 
composto. Por outro lado a eluição por step é feita para fazer separação por grupos (analitos 
alvo e contaminantes) uma vez que as condições tem sido previamente padronizadas em 
eluições por gradiente, a separação é feita em menos tempo e há menor consumo de tampões. 
 Exclusão: tem sua resolução baseada no tamanho efetivo das moléculas dos componentes da 
amostra em solução, e existem limites que determinam o intervalo de tamanhos em que o 
material é útil. O primeiro é o limite inferior ou de permeação, abaixo do qual todas as 
moléculas de menor tamanho são igualmente difundidas dentro dos poros do material. O 
segundo é o limite superior ou de exclusão, acima do qual as moléculas serão muito grandes 
para penetrar os poros. Moléculas de tamanho intermediário serão separadas com resolução, e 
serão eluidas sem resolução moléculas menores ao limite de permeação e maiores que o limite 
de exclusão. A filtração em gel é uma técnica cromatográfica que usa o principio de exclusão 
para separar moléculas de diversos tamanhos. As colunas de Sephadex G-10, G-25 e G-50 são 
usadas frequentemente para separação por grupos usando uma eluição isocrática pois não há 
necessidade de eluição por gradiente uma vez que as moléculas de interesse não interagem com 
a matriz. Moléculas maiores não entram na matriz e eluem no volume vazio (Vo) uma vez que 
passam pela coluna na mesma velocidade do fluxo do tampão. Este Vo para uma coluna bem 
empacotada é normalmente 30% do seu volume total. Moléculas com acesso parcial à matriz 
eluirão em ordem descrescente do tamanho, por último moléculas menores como sais que tem 
total acesso aos poros da matriz eluirão sem se separar um pouco antes do volume total da 
coluna (Vt). 
 
 
 Bioafinidade:isolamento seletivo de macromoléculas biológicas devido à sua propriedade de se 
ligar reversivelmente a um ligante específico unido covalentemente à matriz cromatográfica. A 
interação biológica entre a substância de interesse e o ligante pode resultar de interações 
eletrostáticas, hidrofóbicas, forças de van der Waals ou pontes de hidrogênio. Para eluir o 
analito a interação deve ser revertida de forma específica (usando um ligante competitivo) ou 
não específica (mudanças de pH, força iônica ou polaridade). 
 
Substância a ser isolada Ligante 
Enzimas Substrato, co-fatores, inibidores competitivos 
Ac. Nucléicos Sequencias complementares, histonas, enzimas 
específicas 
Hormônios e vitaminas Proteínas transportadoras e receptores 
Anticorpos Antígenos, células 
Glicoproteínas, polissacarídeos Lectinas 
Células Lectinas e proteínas da superfície celular 
Proteínas Corantes, íons metálicos 
31 
 
 
As etapas na cromatografia de afinidade, incluem: 
1- Matriz de afinidade é equilibrada 
2- Amostra aplicada em condições que favorecem a ligação da molécula de interesse ao 
ligante 
3- A molécula de interesse é recuperada mudando as condições para favorecer a sua eluição 
4- O meio de afinidade é reequilibrado 
 
 
2.2 Quantificação usando HPLC 
Envolve a comparação da intensidade da resposta de um analito (altura e área do pico) na 
amostra investigada com a intensidade de resposta de quantidades conhecidas de um composto 
padrão medido nas mesmas condições experimentais. Na quantificação podem ser usados três 
métodos de emprego do composto padrão: padrões externos, adição de padrões e padrões 
internos. 
 
 Padrão externo: nesta metodologia uma solução de diferentes concentrações conhecidas do 
analito padrão é preparado e analisado. A intensidade do sinal analítico destes padrões é 
plotado contra a concentração conhecida do analito utilizado, e um gráfico de calibração é 
obtido. É importante que a faixa das concentrações da solução padrão inclua a concentração 
encontrada na amostra a fim de fazer uma interpolação dos dados e não uma extrapolação. 
Mesmo sendo a técnica mais usada o uso de uma solução padrão não leva em consideração a 
interação da matriz com o analito nem o efeito da mesma sobre o sinal analítico, também não 
considera possíveis perdas do analito durante o processo de amostragem, armazenamento 
e/ou manuseio. 
 Adição de padrões: é usada para determinar a influencia da matriz da amostra no analito de 
interesse. Nesta caso o padrão é também uma solução de concentração conhecida do próprio 
analito. Uma primeira medição analítica da amostra é realizada e posteriormente uma 
quantidade conhecida do analito é adicionada na amostra e é realizada uma segunda medição, 
a fim de determinar o incremento no sinal analítico ou fator de resposta (sinal por unidade de 
concentração). A concentração do analito na amostra estudada é determinada pela divisão do 
sinal inicial pelo fator de resposta, ou pode ser obtido por extrapolação a partir de um gráfico 
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de calibração. É importante notar que este método assume que a matriz tem o mesmo efeito 
na solução padrão do que no analito presente na amostra original. 
 Padrão interno: o padrão interno é um composto apropriado adicionado à amostra numa 
etapa inicial do procedimento analítico, idealmente na etapa de amostragem, isto a fim de 
garantir que possíveis perdas do analito que acontecem durante o processamento da amostra 
também aconteçam com o padrão interno. O PI deve ter as seguintes características: não 
estar presente na amostra original, ser estável e não reativo, não volátil, eluir próximo do 
analito estudado, pureza elevada e concentração conhecida. Determina-se a curva de 
calibração da solução padrão do analito adicionadas com o PI. Nessa curva utiliza-se a relação 
entre a área do padrão e a área do PI em função das suas concentrações. Posteriormente é 
analisada a amostra contendo o PI e obtém-se a concentração do analito mediante a curva de 
calibração. 
 
2.3 Técnicas de preparo de amostras para análises cromatográficas 
Estas técnicas permitem que a análise dos componentes da amostra se torne possível, o 
objetivo é a obtenção de uma subfração da amostra original enriquecida com as substancias de 
interesse analítico. O preparo da amostra envolve procedimentos de extração e pode também 
incluir uma etapa de purificação. Esta etapa também objetiva trazer os analitos num nível de 
concentração adequado para a detecção. O preparo de amostras representa vários benefícios: 
-Tornar a matriz da amostra compatível com o sistema cromatográfico e o detector 
-Aumento da vida útil da coluna 
-Diminuição de gastos de manutenção e problemas operacionais 
-Remoção de interferentes: diminuição do tempo de análise, aumentando o limite de 
carga/sensibilidade 
-Concentração dos componentes de interesse 
 Extração Líquido-Líquido (ELL): é um processo de separação de compostos que consiste em 
transferir uma substancia da fase na qual se encontra para outra fase líquida. Quando um soluto 
¨a¨ contido em um solvente 1 é agitado com um segundo solvente 2 imiscivel no primeiro, o soluto 
se distribui entre as duas fases líquidas. Após a separação das duas fases, estabelece-se uma 
situação de equilíbrio em que a relação das concentrações do soluto nas duas fases é uma 
constante K (coeficiente de partição ou distribuição). O coeficiente de partição depende da 
natureza do solvente usado em cada caso e da temperatura. O soluto passa para o segundo 
solvente em uma quantidade determinada porque segue sendo solúvel no solvente 1 e porque 
pode saturar o solvente 2 dependendo da sua solubilidade no mesmo. Geralmente se escolhe 
como solvente extrator um que solubilize o soluto muito mais que o solvente original. A eficiência 
da extração esta diretamente relacionada à quantidade de solvente empregado e principalmente 
ao número de ciclos em que a extração é repetida. A ELL baseia-se na afinidade da forma lipofílica 
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do analito por um solvente orgânico. Neste tipo de extração ocorre a partição dos analitos da 
amostra em fase aquosa e o solvente extrator orgânico. A quantidade do analito extraído é 
dependente do volume da amostra, volume do solvente extrator, número de extrações, da 
afinidade do soluto pelo solvente e da constante de distribuição K. 
KD= C2/C1 concentração do analito na fase superior/fase inferior 
Importante! Aumento do volume extrator incrementa a fração extraída de um analito em um 
determinado volume de amostra, mas pode comprometer o efeito de pre-concentração do analito, 
assim quanto maior o volume do solvente extrator for utilizado, maior a eficiência da extração e 
menor a concentração do analito. 
 η=β=Vol. Amostra/Vol. Extraído 
 
Para escolher o agente extrator deve se considerar a maior compatibilidade do solvente 
com o analito, baixo ponto de ebulição e baixa viscosidade. A ELL pode ser feita em condições 
ácidas ou básicas, assim em pHs ácidos as substâncias de caráter ácido prevalecem na forma não 
ionizada, lipofílica entanto que em pH básico as substâncias de caráter básico prevalecem na forma 
não ionizada, lipofílica. O ajuste do pH por tanto aumenta o valor da constante de distribuição 
(KD). 
Vantagens da ELL: 
-Configuração simples 
-Diversidade de solventes puros disponíveis comercialmente 
Desvantagens da ELL: 
-Adição de sais neutros diminui solubilidade de compostos orgânicos pela fase aquosa 
-Amostras com alta afinidade pela agua são parcialmente extraídas 
-É necessário o uso de solventes ultra puros 
-Formação de emulsões (sistemas dispersos constituídos de duas fases líquidas imiscíveis (oleosa eaquosa)) 
-Consumo de volumes grandes de amostra e solvente extrator 
-Alguns solventes utilizados na ELL são tóxicos 
-Decomposição de compostos termicamente instáveis 
 Extração líquido-sólido (ELS): o objetivo da técnica consiste na extração de compostos 
orgânicos solúveis de uma matriz sólida como solo, alimentos, fibras. Ex: hidrocarbonetos de 
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carvão mineral, alcaloides de plantas, resíduos de pesticidas em alimentos. Na ELS acontecem três 
eventos: 
-Contato do solvente com o sólido 
-Separação do sólido insolúvel 
-Destilação e evaporação do solvente 
 
Neste tipo de extração a separação da fase líquida é realizada pela adição de um solvente 
conveniente. Para que essa extração seja satisfatória o sólido deve estar bastante triturado assim o 
solvente terá maior contato com seus constituintes. Alguns métodos utilizados na ELS incluem, 
sonicação, agitação mecânica e soxhlet. A ELS é uma técnica de extração rápida e exaustiva porém 
grandes volumes do solvente extrator são necessários e resulta pouco eficiente. 
Soxhlet: esta técnica baseia-se na vaporização do solvente que quando condensado cai sobre a 
substância sólida que se encontra dentro do aparelho de Soxhlet. Posteriormente quando o 
volume do líquido enche o corpo da fração do aparelho de Soxhlet, o líquido desce para o balão 
onde se encontra o solvente e o processo se repete. As vantagens desta técnica é que é eficiente e 
exaustiva, a extração permite a análise de compostos voláteis e termolábeis, pois o solvente usado 
geralmente possui baixo ponto do ebulição. As desvantagens é que utiliza um volume fixo de 
solvente e pode ser um processo demorado (ate 72 h). 
 
 Extração em fase-sólida (EFS): permite a separação seletiva, purificação e concentração de 
compostos presentes em matrizes complexas. Esta técnica emprega materiais sorventes 
empacotados em cartuchos de polipropileno na forma de barril ou seringa. Normalmente um 
cartucho contém entre 50 a 500mg do sorvente fixado ao cartucho mediante dois filtros. A EFS 
envolve cinco etapas: 
1- Ativação do sorvente para deixar os sítios ativos disponíveis 
2- Condicionamento do sorvente com o solvente adequado para ajustar as forças do solvente 
de eluição com o solvente da amostra 
3- Introdução da amostra, quando ocorre a retenção do analito 
4- Limpeza da coluna para retirar interferentes=clean up 
5- Eluição e coleção do analito 
Os grupos mais frequentemente usados como sorventes à base de sílica podem ser divididos 
em três categorias: fase reversa, fase normal e troca iônica. 
O segundo formato de EFS mais utilizado é a extração em disco (ou membrana carregada de 
partícula). Neste caso as partículas ativas são imobilizadas em uma matriz inerte e estável de 
microfibrilas de PTFE ou vidro. Os discos possuem uma série de vantagens devido ao seu formato, 
como leito homogêneo, pressões menores durante a aplicação da amostra e eluição, ausência de 
caminhos preferenciais, maior capacidade para o analito, menores volumes do eluente e maior 
repetitibilidade e reprodutibilidade. Algumas regras no uso da EFS: 
-Analito deve ser adsorvido no sorvente na EFS 
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-Tempo suficiente de contato entre o analito e o sorvente 
-Interferentes endógenos devem ser seletivamente separados 
-Analitos devem ser eficientemente removidos do sorvente 
Algumas desvantagens da EFS: 
-Maior dificuldade de otimização 
-Varias etapas e maior tempo requerido 
-Maior custo por amostra 
Vantagens da EFS: 
-Uso de pequenos volumes do solvente de eluição 
-Pouco manuseio da amostra 
-Ausência de emulsão 
-Facilidade de automação 
-Baixo consumo de vidrarias 
 Extração contínua: visa facilitar o processo de extração tornando-o mais prático, mais 
econômico, mais seguro e com maior rendimento do material extraído. Geralmente são 
empregados quando o composto a ser extraído é pouco solúvel no solvente utilizado, quando o 
solvente tem um custo elevado ou quando o soluto de interesse encontra-se em baixa 
concentração na amostra. Os principais processos contínuos são líquido-líquido e líquido-sólido