Biomol_Revisão_II

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Estudo Dirigido – Área II – Biologia Molecular – 2015/1 
• O que é o operador, encontrado dentro dos promotores? Operon é uma unidade genética 
de expressão coordenada, que compreende um segmento promotor e um segmento operador 
e na sequencia, o gene ou genes cuja expressão é controlada por eles, sendo todos expressos 
em apenas um RNAm. É nessa região que o repressor irá se ligar para regular a transcrição. 
• Descreva a regulação da expressão do operon lac em bactérias: O operon lac é um operon 
requerido para o transporte e o metabolismo da lactose em bactérias entéricas. É regulado por 
diversos fatores, em particular a disponibilidade de glicose e lactose no meio extracelular. 
Quando o operador está ocupado pelo repressor lac, a RNA polimerase não pode se ligar ao 
promotor. O repressor lac, por sua vez, é o produto de um gene que está próximo ao operon, 
porém não faz parte integral dele. Para o funcionamento do operon lac, é necessário que a 
lactose esteja presente no meio, de forma a inibir a atividade da proteína reguladora ao se 
ligar a ela. Entretanto, caso a glicose esteja presente, temos uma situação particular. A glicose 
diminui a concentração intracelular de cAMP. O AMPc é responsável por ativar uma proteína 
relacionada à transcrição de genes do catabolismo celular, a CAP. Em presença de glicose o 
AMPc não é formado e, como consequência, a PAC não é ativada. Assim, a RNA polimerase 
não é capaz de transcrever eficientemente os genes relacionados ao catabolismo. Isto 
interfere no operon lac, que está relacionado à degradação da lactose. Assim, em presença de 
glicose e ausência de lactose, o operon lac está inativo devido a 2 motivos: a proteína 
repressora está funcionando e a proteína PAC não. Em presença de lactose e ausência de 
glicose, o operon lac está ativo, pois a proteína repressora está inibida e a proteína PAC ativa. 
Por final, em presença de ambos os açúcares, a transcrição será baixa, pois, apesar da proteína 
PAC estar inativa, a proteína repressora encontra-se inibida, liberando o promotor para 
eventuais ligações da RNA polimerase. 
• Como funciona o controle da expressão gênica por atenuação? Atenuação é o principal 
mecanismo de regulação da expressão em bactérias, controlando o término da transcrição. 
Regula a expressão de alguns genes pelo controle da capacidade da RNA polimerase em 
continuar o alongamento além de determinados sítios. Os transcritos são terminados 
prematuramente. Um repressor e um corepressor (triptofano). Quando Trp está presente, liga-
se ao repressor e induz uma conformação que promova ligação ao operador e prevenção da 
transcrição. Quando os níveis de Trp estão baixos, o repressor está livre do corepressor e não 
se liga ao operador. Quando a polimerase se liga ao promotor, a transcrição é iniciada. No 
entanto, os transcritos são terminados prematuramente = ATENUAÇÃO. 
• Quais as classes de RNA que são reguladoras da expressão gênica? Descreva cada uma 
delas. Duas classes: RNAs estruturais: estruturas secundárias no próprio RNA. sRNAs: 
pequenos RNAs que se ligam a proteínas ou a outros RNAs. 
Controle da expressão gênica por ribocomutadores - Como exemplo de RNAs estruturais, tem-
se os ribocomutadores. Os ribocomutadores são responsáveis pela transdução de sinal entre 
metabólitos e expressão gênica. Estrutura secundário do mRNA: regula terminação da 
transcrição (grampos de terminação) e regulação do início da tradução (acessibilidade ao sítio 
de ligação ao ribossomo). Sem mediação de proteínas intermediárias: interagem diretamente 
com os metabólitos e todos os fatores necessários para a regulação estão contidos no mRNA a 
ser regulado. Ativam ou inibem a expressão dos genes. Duas regiões distintas: domínio sensor 
(ligação do metabólito) e plataforma de expressão (altera a transcrição o tradução do gene). 
Os pequenos RNAs podem regular a expressão gênica por meio de pareamento com o mRNA 
alvo, inibindo a ligação da subunidade 30s do ribossomo, impedindo o início da transcrição. 
São RNA antisenso (bloqueia a tradução, término da transcrição e degradação do mRNA). A 
maioria dos sRNAs são repressores da tradução; fazem a ativação de genes e regulam a 
replicação de alguns plasmídeos. 
 
• Qual o papel dos modificadores (modeladores) da cromatina na regulação da expressão 
gênica? Como eles cumprem este papel? Proteínas de remodelamento ligam-se ao DNA, 
desagregando o nucleossomo, liberando as histonas e permitindo que o complexo de iniciação 
possa se ligar e iniciar a transcrição. Um segundo complexo de remodelamento pode se ligar 
ao complexo DNA-histona, permitindo a transcrição sem a desagregação. Ocorre a ativação de 
genes inacessíveis, devido ao empacotamento da cromatina. Os modificadores de cromatina 
remodelam o nucleossomo, adicionando grupos à cauda das histonas (grupos acetil) e ajudam 
a ligação de componentes da maquinaria de transcrição. 
 
• Como agem os repressores da transcrição em eucariotos? Não agem por bloqueio da 
ligação da RNA polimerase, recrutam modificadores de nucleossomos, qe realizarão a 
compactação da cromatina e remoção de grupos reconhecidos pela maquinaria de transcrição. 
 
• Quais outros passos da expressão gênica, além do início da transcrição, podem ser 
regulados em eucariotos? Explique e exemplifique. Alongamento da transcrição (Gene HSP70 
em Drosophila: controlado por dois ativadores (Fator GAGA, recruta maquinaria da transcrição 
– início da transcrição) e HSF), Splicing, estabilidade (pode ser modificada em resposta à sinais 
extracelulares, como hormônios esteroides) e transporte do mRNA (processamento é 
necessário para exportação ao citoplasma), tradução (proteínas que se ligam ao mRNA e 
impedem a ligação dos ribossomos e por consequência inibem a tradução; mediada por ma 
proteína ligadora de RNA sequência-específica que atua como um repressor de tradução) e 
atividade da proteína (após a síntese de proteínas ainda existem eventos regulatórios: 
modificações pós-traducionais e interações para formação de complexos ativos). 
 
• Descreva as principais classes de enzimas utilizadas na biologia molecular (de maneira 
detalhada). Enzimas que atuam sobre ácidos nucléicos • Nucleases: rompem ligações 
fosfodiéster (fragmentam ácidos nucléicos) • Ligases: unem moléculas de ácidos nucléicos • 
Polimerases: sintetizam novas cadeias de ácidos nucléicos • Enzimas modificadoras: removem 
ou adicionam grupamentos aos nucleotídeos. Nucleases: Exonucleases – Removem 
nucleotídeos (um a um) a partir das extremidades; podem retirar nucleotídeos de uma fita ou 
de ambas as fitas. Endonucleases – quebram ligações fosfodiéster no interior da molécula. As 
endonucleases podem ser tanto específicas quanto inespecíficas: Inespecíficas – DNAse 1 cliva 
tanto DNA fita simples quanto DNA fita dupla; ataca qualquer ligação fosfodiéster interna 
(independente da sequencia). ESPECÍFICAS – enzimas de restrição: reconhecem e clivam o DNA 
em pontos específicos (seq. De 4, 6 e 8 bases – palíndromos). São 3 tipos: 1 e 3 não são 
amplamente usadas (inespecificidade). Tipo II: seq. De reconhecimento é palíndrômica; 
hidrólise ocorre dentro ou nas extremidades da seq. Reconhecida. Ligases: reparam quebras 
de fita simples; podem unir dois fragmentos isolados (DNA recombinante). 
 
• Descreva em detalhe uma reação em cadeia da polimerase (PCR). Quais os passos e os 
componentes da reação? • A amplificação pela PCR – Algumas poucas moléculas de um alvo 
específico do DNA (que não poderiam ser analisadas/utilizadas diretamente) – Muitas cópias 
específicas deste alvo – Primers definem a região a ser amplificada e servem de ponto de início 
para a síntese pela polimerase. Passos da PCR – Desnaturação – Anelamento – Extensão. 
Componentes da reação: DNA molde – Sequência a ser amplificada • Oligonucleotídeos 
(primers) – Definem a sequência a ser amplificada • dNTPs (desoxinucleotídeostrifosfato) – 
Unidades para construção do DNA • DNA polimerase – Catalizar a reação • Mg2+ (MgCl2 ) – 
Cofator da polimerase • Tampão (pH e força iônica). 
Para a realização deste procedimento, o primeiro passo é extrair o material genético 
da célula ou do local a ser estudado com cuidado para que o mesmo não seja danificado e nem 
sofra contaminação. Habitualmente, o material coletado é o DNA; todavia, pode-se utilizar o 
RNA em uma RT-PCR que consiste em um desdobramento do PCR e apresenta outras 
aplicações. 
A técnica da reação em cadeia da polimerase (PCR, Polymerase Chain Reaction) foi 
desenvolvida por Kary Mullis nos anos 80 e lhe propiciou o prêmio Nobel de Química em 1994. 
A PCR permite amplificar um gene de cópia única em milhões de cópias, a partir de uma 
pequena quantidade do DNA original (DNA molde). O pré-requisito essencial é a determinação 
da região do gene que será amplificada. Em seguida, são desenhados e sintetizados um par de 
oligonucleotídeos iniciadores (primers) complementares às regiões flanqueadoras da 
sequência a ser amplificada em cada fita do DNA. Geralmente, primers específicos possuem 
tamanho entre 17 a 30 nucleotídeos, teor de GC entre 40 a 60% e não são auto-
complementares ou complementares entre si. O processo é composto de três etapas: 
desnaturação, hibridização (“anelamento”) e extensão, que juntas correspondem a um ciclo da 
reação. Normalmente são realizados de 25 a 35 ciclos para cada reação na qual a taxa de 
amplificação é exponencial, 2 nº de ciclos . 1) Desnaturação: a 94 °C, as fitas do DNA são 
separadas. 2) Hibridização: geralmente entre 45 a 65 °C, os primers hibridizam com suas 
sequências complementares no DNA molde desnaturado. 3) Extensão: a 72 °C, a DNA 
Polimerase, na presença íons Mg2+ e dNTPs (desoxinucleotídeos), sintetiza uma nova fita de 
DNA a partir da extremidade 3’ OH do primer que se encontra hibridizado ao DNA molde. A 
descoberta da enzima Taq DNA Polimerase, oriunda da bactéria Thermus aquaticus, que vive 
em fontes hidrotermais, permitiu automatizar o processo utilizando-se os termocicladores. A 
enzima Taq possui uma atividade ótima a 72 °C, mas permanece estável até 94 °C. Além da 
amplificação para clonagem molecular, a técnica de PCR possui outras aplicações como: teste 
de paternidade, diagnóstico de doenças genéticas e infecciosas, medicina forense, testes de 
organismos transgênicos, análise de polimorfismo de DNA, sequenciamento de DNA e várias 
aplicações no uso das metodologias do DNA recombinante. 
 
• Descreva a metodologia de eletroforese em gel de agarose. Agarose: polímero linear 
extraído de algas. Brometo de etídeo. Os fragmentos de DNA formados com a ação das 
enzimas de restrição possuem tamanhos diferentes. A técnica de separação dos fragmentos de 
DNA mais utilizada é a eletroforese através de géis de agarose. 
A agarose é um polissacarídeo (como ágar e pectina) que dissolve em água fervente e 
então gelifica quando esfria como a gelatina. Para realizar uma eletroforese, um gel de agarose 
é preparado, o DNA é introduzido em pequenos poços de gel, e então uma corrente elétrica é 
aplicada através do gel. Como o DNA é negativamente carregado, ele é atraído pelo eletrodo 
positivo. Entretanto, para chegar ao eletrodo positivo, o DNA deve migrar através do gel de 
agarose. Os fragmentos de DNA menores podem migrar através de um gel de agarose mais 
rapidamente que os fragmentos de DNA maiores. 
Após a eletroforese em gel, os fragmentos de DNA normalmente são corados com 
brometo de etídeo, que possui afinidade pelo DNA e fluorece (torna-se visível) vivamente em 
contato com a luz ultravioleta. Dessa forma pode-se localizar as bandas que correspondem ao 
DNA. Os fragmentos de DNA podem, então, ser isolados e purificados a partir dos géis de 
agarose. 
 
 
• Quais as características de um plasmídeo que é utilizado como vetor de clonagem? 
Vetores: Veículos que permitem que os fragmentos de DNA a serem clonados sejam 
introduzidos e propagados em uma célula hospedeira adequada. • Características básicas – 
Replicação autônoma – Marcadores de seleção – Sítios únicos de restrição. • Plasmídeos: 
moléculas de DNA – Circular – Dupla-fita – Auto-replicativo – Extracromossomal. 
Os plasmídeos são pequenos fragmentos de DNA bacteriano de forma circular. Podem 
ser modificados por adição de novos fragmentos de DNA e são facilmente inseridos em 
bactérias, sendo utilizados para o transporte de DNA para o interior de células alvo (vectores). 
Os fragmentos inseridos nos plasmídeos não podem exceder os 10000 pares de bases (10 Kb). 
Quando utilizados como vectores, os plasmídeos contêm pelo menos um gene de 
resistência a antibióticos para selecçnao das bactérias transformadas, um local onde a 
replicação se inicia e sítios específicos para reconhecimento de enzimas de restrição que 
cortam e abrem a molécula circular. O fragmento de DNA a ser inserido é preparado de forma 
a que tenha extremidades coesivas que sejam complementares às criadas pela enzima de 
restrição. Os plasmídeos abertos e os fragmentos de DNA a inserir são misturados, e pela 
acção de uma enzima (ligase do DNA) são unidos. Nem todos os plasmídeos se ligam aos 
fragmentos, alguns tornam a fechar a molecular sem qualquer inserção de novo DNA. 
Os plasmídeos com o novo fragmento DNA inserido são introduzidos nas células 
bacterianas hospedeiras através de um processo denominado por transformação. As bactérias 
e os plasmídeos são misturados num meio contendo cloreto de cálcio, que torna a parede 
celular das bactérias permeável, permitindo a passagem do plasmídeo através da parede 
celular para o citoplasma no interior da célula. Nem todas as bactérias irão receber plasmídeos 
embora muitas recebam mais de um no seu interior. 
Os plasmídeos contêm um gene que lhes confere resistência a antibióticos para além 
do gene que se introduziu. Adicionando um antibiótico ao meio de cultura vai-se matar 
qualquer célula que não tenha adquirido plasmídeos, possibilitando uma identificação directa 
das bactérias modificadas por plasmídeos (caso o gene tenha sido introduzido na zona de 
resistência ao antibiótico, reconhecem-se as células modificadas pela sua morte na presença 
do antibiótico). No interior das células hospedeiras, o DNA da bactéria replica-se 
independentemente dos plasmídeos que também se replicam. Estes mecanismos de 
replicação independente permite a amplificação de um elevado número de cópias de clones 
de DNA (em condições óptimas cada célula poderá efectuar cerca de 200 cópias de um 
plasmídeo). 
 
• Em um experimento de clonagem molecular, descreva a função: 
a. da(s) endonuclease(s) de restrição: cliva e produz extremidades compatíveis durante a 
clivagem do DNA a ser clonado (inserto) e a do DNA receptor (vetor). Endonucleases de 
restrição fazem o reconhecimento da sequencia específica do DNA e clivam ambas as fitas da 
hélice em lugares determinados. É encontrada em procariotos e só agem em DNA exógeno, 
sítio de reconhecimento da enzima é metilado. Enzima reconhece a sequencia e hidrolisa 
ligação fosfodiéster em cada fita. Os sítios de clivagem possuem sequencias de 
reconhecimento palindrômica. 
b. da DNA-ligase: fragmentos de DNA com extremidades coesivas ou cegas podem ser unidas 
pela DNA ligase, que catalisa a formação de uma ligação fosfodiéster entre duas moléculas. 
Requer extremidade OH livre em uma das cadeias e um grupamento fosfato na outra. 
c. do vetor de clonagem: devem ter capacidade de replicar na célula hospedeira (replicação 
autônoma), possuir sítios de clonagem, tamanho pequeno. Ex: plasmídeos, cosmídeos, 
bacteriófago, BACs, YACs. Transportam genes que conferem resistência a antibióticos. 
d. dos antibióticos utilizados: antibióticos são adicionados ao meio da cultura para selecionar 
somente as linhagens que portam os vetores. As células transformados com tais vetores são 
capazesde crescer num meio contendo o antibióticos, enquanto que as células não 
transformadas acabam morrendo. 
 
• Descreva os principais métodos utilizados para a transformação de células bacterianas. 
Choque térmico – Comumente chamado transformação com cloreto de cálcio, é um método 
fácil e relativamente barato de transformação. Consiste na preparação das células, para torná-
las competentes, por tratamento com cloreto de cálcio ou outro íon divalente (cloreto de lítio 
ou magnésio). Os íons atuam neutralizando as cargas negativas da membrana e do DNA. Após 
um choque térmico na temperatura de 37º a 42ºC, criam-se poros na membrana e o DNA pode 
alcançar o interior da célula. 
Eletroporação - É um método mais eficiente para transformação de células com DNA 
plasmidial. Consiste, inicialmente, na preparação das células com uma solução aquosa para 
torná-las competentes e aptas a receber o DNA. As células são submetidas a alta voltagem 
(choque elétrico) que provoca uma desestabilização da membrana externa e a formação de 
poros, possibilitando a entrada do DNA para o interior da célula. Esse tipo de transformação, 
que requer um equipamento - denominado eletroporador - pode ser utilizado para a 
transformação de bactérias gram positivas e negativas, leveduras, fungos filamentosos, células 
animais e vegetais. O eletroporador deve ser ajustado para cada tipo celular, considerando os 
seguintes parâmetros: capacitância, intensidade e duração do pulso elétrico. 
 
• Descreva como podem ser separadas as células geneticamente transformadas das células 
não transformadas. E como diferenciamos células transformantes de células recombinantes? 
Dê um exemplo de sistema de seleção. As células que recebem o tratamento adequado para 
realizar a introdução do material genético são chamadas células recombinantes. As células 
transformantes são as células recombinantes onde se introduziu o material genético, ao qual 
se recuperou a permeabilidade da membrana e estão em condições ótimas de crescimento. 
 
• O que são bibliotecas de genes? Qual a diferença entre biblioteca de cDNA e biblioteca 
genômica? Coleção de clones recombinantes que contém parte ou todo o DNA presente em 
um organismo. Qualquer gene deste organismo pode ser recuperado da biblioteca e estudado. 
Biblioteca genômica: coleção de clonas que representam a totalidade do genoma de um 
determinado organismo. São usados principalmente em procariotos, em eucariotos utiliza-se a 
biblioteca genômica para estudo de regiões reguladoras e é independente do tipo de célula 
utilizada para obtenção de DNA. Biblioteca de cDNA: É o conjunto de clones das sequências 
codificadoras que estão sendo expressas pela célula naquele momento, obtido através da 
clonagem de moléculas cópias do mRNA (cDNA). É usada principalmente em células 
eucarióticas e varia de acordo com o tecido utilizado. Ocorre o isolamento de RNA, a síntese 
do DNA complementar (cDNA) pela transcriptase reversa e a síntese do DNA fita dupla. 
 
• Quais as principais estratégias para screening de bibliotecas de genes? Existem 4 
estratégias mais comuns: a hibridização de DNA por complementariedade de bases, screening 
imunológico através de anticorpos, atividade da proteína e complementação funcional. 
 
• Quais as principais características de um vetor de expressão? Os vetores de expressão são 
vetores de clonagem que possuem todos os elementos genéticos que permitem a expressão 
de proteínas recombinantes. Se os elementos genéticos permitem a expressão em células 
bacterianas, este é um vetor de expressão procarioto. Os vetores de expressão são utilizados 
quando a busca de uma determinada seqüência se faz por meio da detecção da proteína por 
ela codificada. Para isso, o sítio múltiplo de clonagem é inserido próximo à região promotora. 
 Vetores de expressão tem: promotores (que dirigem a síntese de grande quantidade 
de mRNA do gene que se quer expressar); sequencias que permitam a replicação autônoma 
em bactéria (origem de replicação); sequencias que codificam traços genéticos que 
possibilitam reconhecer as células que contem o vetor; sequencias que aumentam a eficiência 
da tradução do RNA. 
 
 
 
• Explique sucintamente as duas principais técnicas para geração de plantas 
geneticamente modificadas. TRANSFORMAÇÃO MEDIADA POR AGROBACTERIUM 
TUMEFACIENS: 
 
As agrobactérias são microorganismos que tem capacidade de penetrar em algumas 
espécies vegetais. 
Agrobacterium tumefaciens é uma das espécies que pode penetrar em plantas, 
principalmente nas dicotiledôneas, causando a galha-da-coroa. Esta bactéria possui um 
plasmídeo indutor de tumor denominado Ti, parte do qual é incorporado nas células da planta 
hospedeira, que passa a produzir hormônios vegetais e opinas. 
Para se fazer a transformação genética mediada por Agrobacterium tumefaciens o 
plamídeo Ti é modificado, de forma que ele deixe de expressar genes não-essênciais para 
transformação, por genes de interesse, transformando, então, o plasmídeo Ti em um vetor 
natural de transformação de plantas. Essas linhagens passam a ser incapazes de produzir 
tumores nas plantas hospedeiras. 
A técnica consiste em colocar o explante na presença do vetor de transformação 
(Agrobacterium) contendo o gene de interesse onde eles são co-cultivados. As bactérias então 
infectam o tecido vegetal iniciando o processo de transferência e transformação do genoma da 
planta. A seguir o tecido é cultivado em meio de regeneração contendo antibiótico para 
eliminação da Agrobacterium e um agente seletivo para identificar as células transformadas. 
TRANSFORMAÇÃO POR BIOBALÍSTICA 
 
Este método foi desenvolvido por Sanford e colaboradores na Universidade de Cornell, 
e foi designado biolística em razão da alta velocidade imprimida aos microscópicos projéteis 
revestidos com DNA. 
Essa técnica consiste no uso de partículas diminutas (1,0 a 1,5 mm) de tungstênio ou 
ouro, que são revestidas com DNA a ser transferido. 
As partículas podem ser acelerados por ar comprimido (Hélio), onda de choque 
elétrico e pólvora entre outros; com força suficiente para atravessar a parede e membrana 
celular, mas não danificar a célula. Com isto, uma quantidade de DNA das partículas localiza-se 
no núcleo das células do tecido utilizado, o qual passa incorporar o novo DNA. O aparelho 
responsável por gerar a onda de choque é denominado de acelerador de micropartículas. Todo 
o processo ocorre no interior de uma câmara sob vácuo, para evitar a desaceleração das 
partículas causadas pelo ar. 
 
• Descreva as estratégias para geração de animais transgênicos. Sucesso na transferência de 
genes para células de mamíferos. Possibilidade de criação de animais geneticamente idênticos 
(clonagem nuclear). Gene clonado é injetado no núcleo de um óvulo fertilizado, implantação 
numa fêmea. Alguns membros da progênie carregam o gene clonado em todas as suas células. 
Faz-se o cruzamento para estabelecimento de novas linhagens genéticas. 
 Ex: Camundongos transgênicos: introdução de DNA em camundongos. DNA exógeno é 
inserido em vetores retrovirais que serão microinjetados em óvulos fertilizados. Ocorre a 
introdução de células tronco manipulados em embriões (estágios iniciais do desenvolvimento). 
• Retrovírus são compostos por genomas de RNA, Transcriptase reversa e ocorre integração do 
DNA ao genoma do hospedeiro.