Postulados de Koch para Duranta erecta aurea

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[teste de patogenecidade]
Faculdade de Agronomia e Engenharia Florestal
Departamento de Proteção Vegetal
Licenciatura em Engenharia Agronómica
Fitopatologia
Grupo 1; Bancada 9; Turno quarta-feira(9-11horas)
Trabalho Semestral
Tema: Aplicação dos Postulados de Koch na Planta Ornamental (Duranta erecta aurea)
Discentes:						Docentes:
Cumba, Raimundo António				Profa Doutorara Ana Monjana(PhD)
Magul, Rodrigues Armando				Prof. Doutor João Bila(PhD)
Mavulula, Aires Adriano				Eng. AmandioMutambe(Msc)
Peu, Beldino Júlio					Enga. Julieta Gove(Msc)
Monitora: Vanessa Simão					Técnicos:
							Fernando Rodrigues
							Lucrécia Pereira
Maputo, Maio de 2019
Introdução
Antecedentes
Doença é o mau funcionamento de células e tecidos do hospedeiro que resulta da sua contínua irritação por um agente patogénico ou fator ambiental e que conduz ao desenvolvimento de sintomas (AGRIOS, 1988).
De acordo com Bergamin (1997), as doenças de plantas são diagnosticadas maioritariamente pelos seus sintomas que provocam e pelos sinais do agente causador presentes no hospedeiro.
O diagnóstico das doenças das plantas é um dos mais importantes procedimentos técnicos em Fitopatologia, o seu principal objetivo é detectar os agentes primários causadores das doenças que compreende uma atividade necessária para tomada de decisão quanto aos métodos apropriados de controlo ou prevenção das doenças. O sucesso no diagnóstico de doenças das plantas depende do conhecimento que se tem sobre a biologia das doenças, as características dos organismos que causam as doenças, os sintomas e sinais associados aos principais grupos de doenças (Ficha Laboratorial N2, 2019). 
Segundo Michereff (2001), Quando um organismo é encontrado associado a uma planta doente, se for conhecido ou registrado anteriormente, é identificado com a ajuda de literatura. Entretanto, se for um organismo desconhecido, pelo menos para tal planta, para confirmá-lo ou descartá-lo como agente causal da doença, é necessária a realização do teste de patogenicidade. O estabelecimento da relação causal entre doença e um organismo pode ser confirmada após o cumprimento de uma série de etapas e procedimentos, conhecidos vulgarmente por postulados de Koch desenvolvidas por Robert Koch (1881).
Associação constante patógeno-hospedeiro: o microrganismo deve estar presente em todas as plantas de uma mesma espécie que apresentam o mesmo sintoma ou seja, deve-se poder associar sempre um determinado sintoma a um patógeno particular.
Isolamento do patógeno: o organismo associado aos sintomas deve ser isolado da planta doente e multiplicado artificialmente.
Inoculação do patógeno e reprodução de sintomas: a cultura pura do patógeno, obtida no isolamento, deve ser inoculada em plantas sadias da mesma espécie que apresentou os sintomas iniciais da doença e provocar a mesma sintomatologia observada na associação.
Reisolamento do patógeno: o mesmo organismo deve ser isolados das plantas submetidas à inoculação artificial.
Michereff (2001)
Estes postulados anteriormente citados têm uma grande margem de limitação pelas diferenças de parasitismo nos organismos fitopatogénicos. O teste de patogenicidade através dos Postulados de Koch apresenta particularidades para parasitas facultativos e obrigatórios. Para parasitas facultativos, o teste de patogenicidade segue todos os postulados sem exceção alguma, enquanto no caso de parasitas obrigatórios seguem somente duas etapas, isto é, a primeira e a terceira:
1. Associação constante patógeno hospedeiro: o microrganismo deve estar presente em todas as plantas de uma mesma espécie que apresentam o mesmo sintoma. 
2. Inoculação do patógeno e reprodução dos sintomas: no caso de vírus, extrato de folhas doentes ou suspensão de esporos ou esporângios (no caso de fungos causadores de ferrugens, carvões, oídios e míldios) deve ser inoculado em plantas sadias da mesma espécie que apresentou os sintomas iniciais da doença e provocar a mesma sintomatologia observada anteriormente (Michereff, 2001). 
O presente experimento gira em torno do teste de patogenicidade de um organismo desconhecido que provavelmente tenha causado a morte de uma planta ornamental.
Objectivos
Geral
Avaliar as possíveis causas de morte da planta ornamental.
Específicos
Identificar o nome comum e científico da planta ornamental.
Diagnosticar com base nos postulados de Koch a planta ornamental.
Problema de estudo e justificação
As plantas ornamentais são cultivadas por sua beleza e exuberâncias em cores, elas são apreciadas na arquitectura de interiores e no paisagismo de espaços externos. Novas variedades de plantas ornamentais surgiram a partir do cruzamento entre espécies e a sua susceptibilidade à agentes patogénicos têm aumentado a medida que se introduzem novas variedades.
Os últimos anos tem se caracterizado por grandes variações e tendências climáticas em todos os cantos do mundo e estas têm sido acopampanhadas pela adapatabilidade de diversas epidemias. Estudos revelam que nos últimos 10 anos têm se registado incidência e agressividade de diversas doenças e pragas que causam grandes prejuízos e desequilíbrio de economia em países desenvolvidos e em via de desenvolvimento. Segundo EMBRAPA (2015) as perdas de produção de mudas de plantas ornamentais são estimadas em torno de 16%. Estas perdas podem ser explicadas pela introdução de novas doenças, pragas que acompanham as tendências e mudanças climáticas que se tem feito sentir nos últimos anos.
Com vista aos dados estatísticos de perdas de produção e estudos feitos que indicam grandes epidemias, torna-se imprescindível a avaliação minuciosa das causas de perdas de milhares de mudas de plantas ornamentais. 
Revisão Bibliográfica
Descrição da espécie
O gênero Duranta spp., pertencente à família Verbenaceae, compreende cerca de 35 espécies, sendo a maioria adaptada às condições de climas tropicais (ANIS et al., 2001; BORELLA; PASTORINI; TUR, 2010). Dentre as espécies catalogadas podem ser citadas Duranta domberyana, Duranta erecta, Duranta multisi, Duranta peruviana, Duranta vestita, entre outras. 
Duranta erecta L., (sin. D. repens L.), popularmente conhecida como pingo-de-ouro, é nativa de florestas abertas na Índia Ocidental, partes do norte do Paquistão e da América do Sul (STATE, 1995; AHMAD et al., 2009). É um arbusto lenhoso que pode atingir de 1,5 a 4m de altura, apresenta as folhas amarelas douradas de disposição alterna ou opostas e os frutos são alaranjados (BORELLA; TUR; PASTORINI, 2010). Esta espécie é muito usada em áreas de jardinagem e de canteiros de vias urbanas, onde pode suportar o pleno sol, os climas quentes e úmidos, além de não apresentar as exigências na adaptação e no cultivo. A planta possui rápido crescimento e é propagada principalmente por meio de estaquias no período de outono e inverno (BORELLA; PASTORINI; TUR, 2010).
A espécie Duranta erecta L. possui flores apresentadas em racemos terminais e são pentâmeras e hermafroditas com corola tubular violeta a azul pálida, com aproximadamente 10mm de comprimento. O estilete e as anteras estão incluídos no tubo da corola e o néctar é acumulado na porção inferior do tubo (NAVARRO; MEDEL, 2009). Diferentes partes desta planta são utilizadas na medicina popular, sendo relatadas atividades terapêuticas tais como anti-plasmódios, anti-malária, anti-trombina, antioxidante, anti-cancro e atividades antivirais (KHAN et al., 2013). 
Material e Métodos
Material
	Instrumentos
	Soluções
	Lâminas
	Água destilada
	Lamelas
	Hipocloreto de sódio 1%
	12 Placas de petri (3 com PDA e 3 com NA)
	Álcool
	Planta ornamental Sã e Doente
	
	Recepiente para lavagem e dessecação dos tecidos
	
	Parafilm
	
	Estojo de disseminação
	
	Algodão
	
	Camara Húmida
	
	Microscóio Electrónico
	
Métodos
Procedimentos
Identificação da espécie
Inicialmente, identificou-se a espécie com recurso ao herbário da Universidade Eduardo Mondlane que não teve sucessopor ser esta uma espécie exótica.
De seguida recorreu-se à estufa da mesma instituição, Universidade Eduardo Mondlane que culminou com a descoberta do nome vulgarmente utilizado por jardineiros, o de “Dorantes”.
A sua identificação completa fez-se com recurso à pesquisas feitas em correntes de internet.
Identificação do agente causal
Etapa 1:
Descreveu-se detalhadamente os sintomas e sinais presentes na amostra.
Desinfetou-se a área de trabalho com álcool.
Com recurso a uma navalha, destacou-se pedaços relativamente pequenos da parte radicular e parte aérea da planta doente, classificando-se as amostras em interiores e exteriores.
Lavou-se as amostras com bastante água.
Secou-se as amostras.
Desinfetou-se as amostras com hipoclorito de sódio a 1% por 30 segundos.
Passou-se duas vezes as amostras por água, para eliminar o excesso de hipoclorito de sódio.
Em cada placa de petri colocou-se três amostras, interiores ou exteriores.
Por fim, incubou-se as placas de PDA na câmara humida.
Etapa 2:
Passados dez dias:
Fez-se preparações microscópicas para a caracterização dos fungos.
De seguida, fez-se a repicagem para obtenção de cultura pura e incubou-se novamente as amostras em camara húmida.
Etapa 3:
Obtida a cultura pura:
Prosseguiu-se com a inoculação do fungo à planta sadia em diferentes partes dela.
Resultados e Discussão
Resultados
Tabela 1: Descricção dos sintomas
A tabela abaixo apresenta as características observadas á olho desarmado:
	Tipo de Doença
	Biótica
	
	Tipo de Sintoma
	Sistémico
	
	
	Primário
	
	Características
	Folhas dissecadas com uma coloração verde acastanhada.
	
	Forma da lesão
	___________
	
	Cor da lesão
	Parda
	
	Sinais
	Sem sinal
	
Isolamento e obtenção de cultura pura
Do tecido doente isolado, foram observados três diferentes micélios de fungos caracterizados por coloração branca, azul e preta. 
Figura 1: Cultura pura do tecido isolado em PDA e NA
Observações microscópicas
Das observações microscópicas, observou-se que o fungo que apresentava uma coloração azul continha hifas septadas em forma de vértices.
No fungo com esporulação branca, observou-se microscopicamente micélio septado sem estruturas reprodutoras ou esporos.
O terceiro fungo observado que apresentava uma coloração negra, caracterizou-se por conídios pretos e hifas septadas.
Inoculação 
Com recurso aos fungos obtidos, usou-se o que apresentava coloração azul por ser a mais provável admitida pela literatura, porém aguardou-se semanas sem aparecimento de novos sintomas na planta inoculada similares aos esperados.
Discussão
Isolamento do patógeno
Sedundo Reis (2017), os agentes patogéticos associados à plantas ornamentais especificamente a Duranta erecta aurea são os apresentados a seguir:
	Patógenos
	Agentes causais
	Fungos
	Sclerotium rolfisii
	
	Pestalotiopsis sp.
	Nemátodos
	Meloidogyne incógnita
Tabela 2: Agentes patogénicos da planta ornamental
Na planta ornamental doente, não havia sinal de ataque de nemátodos mas desconfia-se que o fungo encontrado com coloração azul seja o causador.
Inoculação
Segundo Michereff (2001), Robert Koch propôs como um dos primeiros passos ou uma das primeiras condições no teste de patogenecidade a Associação constante patógeno hospedeiro, onde o microrganismo deve estar presente em todas as plantas de uma mesma espécie que apresentam o mesmo sintoma, porém não foi possível ao longo da experiência investigar-se a proveniência da planta ornamental para a avaliação do campo onde tinha sido inserida a planta.
Michereff (2001), afirma que os postulados de Koch culminam com o reisolamento do patógeno, isto é, o mesmo organismo isolado das plantas submetidas à inoculação, mas no experimento não foi possível fazer o reisolamento, pois a planta inoculada não apresentou os sintomas similares á planta outrora encontrada doente e morta. O não desenvolvimento de sintomas pode ter sido ocasionado pelo período de incubação, pois alguns patógenos tem um período de incubação longo para posterior o desenvolvimento de sintomas.
 
Conclusões
Com base na experiência realizada não foi possível identificar o agente causador da morte da planta ornamental por factores desconhecidos porém, de acordo com a literatura a murcha da Duranta erecta aurea pode ser causada por três agentes patogénicos os fungos Sclerotium rolfisii, Pestalotiopsis sp e o nemátodo da espécie Meloidogyne incognita.
A espécie ornamental, pertence à:
Família: 		Verbenaceae
Género: 		Duranta
Espécie: 		Duranta erecta aurea
Nome comum: 	Pingo-de-ouro
Referências Bibliográficas
MICHEREFF, Sami J. (2001) Fundamentos de Fitopatologia; Recife-PE.
AGRIOS, G.N.(1997);Control of plant diseases. In: AGRIOS; Lavras.editora.
AMORIM, L., BERGAMIN FILHO,A.; KIMATI, H.; (1995).; Manual de
Fitopatologia; Editora Agronômica Ceres Ltda; São Paulo-SP.
DISCONZI, Sousa., (2008), Material de Apoio para as Aulas Teóricas da
Disciplina de FITOPATOLOGIA II., Uruguaiana, RS.
AMORIM, L., BERGAMIN FILHO,A.; KIMATI, H.; (1995).; Manual de
Fitopatologia; Editora Agronômica Ceres Ltda; São Paulo-SP
REIS, CLAUDIA (2017). Manejo de doencas de plantas ornamentais, Apresentação 2.
Ficha Laboratorial Nr 2, Fitopatologia, Faculdade de Agronomia e Engenharia Florestal, UEM; 2019; pp 1,2. 
ANIS, I. et al. Thrombin inhibitory constituents from Duranta repens. Helvetica Chimica Acta, v. 84, n. 3, p. 649-655, 2001
BORELLA, J.; TUR, C. M.; PASTORINI L. H. Alelopatia de extratos aquosos de Duranta repens sobre a germinação e o crescimento inicial de Lactuca sativa e Lycopersicum esculentum. Biotemas, v. 2, n. 23, p.13-22, 2010.
KHAN, M. A. et al. Antioxidative potential of Duranta repens (linn.) fruits against H2O2 induced cell death in vitro. African Journal of Traditional, Complementary and Alternative medicines, v. 3, n. 10, p.1-6, 2013.
NAVARRO, L.; MEDEL, R. Relationship between floral tube length and nectar robbing in Duranta erecta L . ( Verbenaceae ). Biological Journal of the Linnean Society, p. 392–398, 2009
STATE, A. A. M. A.; taxonomic revision of the genus Duranta (Verbenaceae) in Australia. Journal Of The Adelaide Botanic Gardens, v. 1, n. 16, p.1-6, 16, 1995.
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