Resumo Cromatografia

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CROMATOGRAFIA 
 
1.1. Descrição Geral da Cromatografia 
A cromatografia compreende um grupo diversificado e importante de métodos que 
permitem ao cientista separar componentes muito semelhantes de misturas complexas. 
Muitas dessas separações são impossíveis por outros meios. 
Em todas as separações cromatográficas, a amostra é transportada por uma fase móvel, 
que pode ser um gás, um líquido ou um fluído supercrítico. Essa fase móvel é então 
forçada através de uma fase estacionária imiscível fixa, colocada na coluna ou em uma 
superfície sólida. 
Os componentes que são mais fortemente retidos na fase estacionária movem-se 
muito lentamente no fluxo da fase móvel. Ao contrário, os componentes que se ligam 
mais fracamente à fase estacionária, movem-se mais rapidamente. Como 
consequência dessas diferenças na mobilidade, os componentes da amostra se 
separam em bandas ou zonas discretas que podem ser analisadas qualitativa e/ou 
quantitativamente. 
1.2. Classificação dos Métodos Cromatográficos 
Os métodos cromatográficos podem ser classificados de dois modos. A primeira 
classificação está baseada no meio físico no qual as fases estacionária e móvel entram 
em contato. Na cromatografia de coluna, a fase estacionária é mantida dentro de um 
tubo estreito através do qual a fase móvel é forçada a passar sob pressão. 
Na cromatografia planar, a fase estacionária é suportada sobre uma superfície plana 
ou nos interstícios de um papel. Neste caso, a fase móvel move-se através da fase 
estacionária por ação de capilaridade ou sob influência da gravidade. 
OBS: Apenas a cromatografia líquida pode ser realizada tanto em colunas como em 
superfícies planares. As cromatografias gasosas e com fluído supercrítico, por outro 
lado, estão restritas aos procedimentos em coluna, de modo que as paredes da coluna 
contenham a fase móvel. 
 
1.3. Eluição Cromatográfica em Colunas 
A imagem abaixo mostra de forma esquemática, como duas substâncias A e B são 
separadas em uma coluna por eluição cromatográfica com uma fase móvel líquida. 
 
A eluição envolve a lavagem de uma espécie através da coluna por adição contínua 
de novos volumes de solvente. Como mostrado na figura, uma porção única da 
amostra é introduzida no alto da coluna (item (a)) e os componentes da amostra se 
distribuem em duas fases. A introdução de fase móvel adicional (o eluente) força o 
solvente, que contém parte da amostra, a descer na coluna, na qual ocorre mais 
partição entre a fase móvel e porções ainda não usadas da fase estacionária (item 
(b)). 
1.4. Cromatograma 
Se um detector que responde à concentração do soluto for colocado no final da coluna 
e seu sinal for lançado em gráfico em função do tempo (ou do volume da fase móvel 
adicionada), obtém-se uma série de picos, como mostrado na figura abaixo. 
 
 
Esse gráfico, chamado cromatograma, é útil tanto para análises qualitativas quanto 
para a quantitativa. As posições dos picos no eixo do tempo pode identificar os 
componentes da amostra. As áreas sob os picos dão uma medida quantitativa de cada 
componente da amostra 
 
1.5. Eficiência da coluna 
Dois termos são amplamente usados em medidas quantitativas de eficiência de coluna 
cromatográfica: (1) Altura equivalente a um prato teórico, H e (2) número de pratos 
teóricos, N. Os dois termos estão relacionados pela equação 
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Onde L é o comprimento da coluna empacotada. A eficiência da coluna cromatográfica 
aumenta à medida que o número de pratos se torna maior e que a altura do prato diminui 
Considera-se que, em cada prato, ocorre o equilíbrio do soluto entre a fase móvel e 
estacionária. O movimento coluna abaixo é então tratado como uma transferência em 
passos da fase móvel em equilíbrio, de um prato para o próximo. 
A altura do prato é dada por: � �
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, onde �2 é a variância. 
1.6. Variáveis que afetam o alargamento de banda 
Foi mostrado que o alargamento da zona é consequência da velocidade finita na qual 
ocorrem os vários processos de transferência de massa durante a migração de um 
soluto coluna abaixo. Seus efeitos sobre a eficiência da coluna, medida pela altura do 
prato H, são descritos abaixo. 
 1.6.1 O efeito da velocidade de fase móvel 
A magnitude dos efeitos cinéticos sobre a eficiência da coluna depende do tempo de 
contato entre a fase móvel e a estacionária, o que, por sua vez, depende da 
velocidade da fase móvel. Por esta razão, os estudos de eficiência são geralmente 
feitos através da determinação de H em função da velocidade da fase móvel u. 
Como sugerido pela imagem abaixo, as vazões da cromatografia líquida são 
significativamente menores do que as usadas em cromatografia gasosa. Isto significa 
que as separações por cromatografia gasosa são completadas em tempos mais curtos 
do que as separações por cromatografia líquida. Além disso, como mostrado na figura, 
as alturas dos pratos nas colunas de cromatografia líquida são uma ou mais ordens de 
magnitude menores do que as encontradas em colunas para cromatografia gasosa. 
Assim, uma comparação entre CG e CL mostra que a primeira é capas de separações 
mais rápidas e mais eficientes, embora não necessariamente que ambas ocorram 
simultaneamente. 
 
 
1.6.2 Relação entre a altura do prato e os tipos de coluna 
 
Equação de van Deemter: � � 	 
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Onde H é a altura do prato, u é a velocidade linear da fase móvel cm/s e as grandezas 
A, B e C são coeficientes relacionados respectivamente com os fenômenos caminhos 
múltiplos de fluxo, difusão longitudinal e transferência de massa entre fases. 
• O termo dos caminhos múltiplos (A): 
O alargamento da zona surge, em parte, devido aos múltiplos caminhos que uma 
molécula (ou íon) pode encontrar através da fase estacionária da coluna. A figura abaixo 
representa como o comprimento desses caminhos pode variar significativamente. 
 
Assim, o tempo de residência na coluna de moléculas da mesma espécie também varia. 
Moléculas de soluto alcançam então a extremidade final da coluna após um intervalo de 
tempo, o que leva a um alargamento da banda. 
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O alargamento devido à multiplicidade de caminho pode ser parcialmente compensado 
pela difusão ordinária que resulta de moléculas que estão sendo transferidas da corrente 
que segue um caminho para a corrente que segue outro. Se a velocidade de fluxo for 
muito baixa, ocorrerá um grande número dessas transferências e cada molécula, em 
seu movimento coluna abaixo, experimentará numerosos caminhos de fluxo, gastando 
um tempo curto em cada um. Como consequência, a velocidade na qual cada molécula 
se move coluna abaixo tende a se aproximar da velocidade média. 
• O termo de difusão longitudinal (B/u): 
A difusão longitudinal na coluna cromatográfica é um processo de alargamento de 
banda no qual o soluto difunde-se do centro concentrado de uma zona para regiões 
mais diluídas à frente e atrás do centro da zona. 
A contribuição da difusão longitudinal é vista como sendo inversamente proporcional à 
velocidade da fase móvel. Essa relação não surpreende quando se considera que o 
analito permanece na coluna por um período de tempo mais curto quando a vazão é 
alta. Assim, a difusão do centro da banda para as duas beiradas leva menos tempo para 
ocorrer. 
• O termo de transferência de massa (Cu): 
Esse termo surge porque o equilíbrio entre a fase móvel e a estacionária é estabelecido 
tão lentamente que uma coluna cromatográfica sempre opera sob condições de não-
equilíbrio. Consequentemente, moléculas do analito na parte dianteira de uma banda 
são arrastadas para a frente antes de terem tempo para entrar em equilíbrio com a fase 
estacionária e, portanto, de ficarem retidas. 
O alargamento da banda devido a efeitos de transferência de massa surgeporque as 
várias correntes estão fluindo na fase móvel dentro da coluna e a camada de contato 
com a fase estacionária têm ambas espessuras finitas. Consequentemente, é 
necessário um tempo para que as moléculas de soluto difundam do interior dessas fases 
para as interfaces nas quais ocorre a transferência. 
1.7. Resolução da coluna 
A resolução RS de uma coluna oferece uma medida quantitativa da sua habilidade em 
separar dois analitos. A resolução da coluna é definida como: 
 
 
1.8. Padrões 
A fonte mais importante de erro na análise por esse método geralmente é a incerteza 
no volume da amostra. Ocasionalmente, a velocidade de injeção também é um fator de 
erro. Comumente, as amostras são pequenas (~1µL) e as incertezas associadas à 
injeção de um volume reprodutível desse tamanho com uma microsseringa pode chegar 
a um erro relativo de várias partes por cento. 
A maior precisão em cromatografia quantitativa é obtida com o uso de padrões internos 
porque são evitadas as incertezas introduzidas na injeção da amostra. Neste 
procedimento, uma quantidade de uma substância medida cuidadosamente, que atua 
como padrão interno, é introduzida em cada padrão e na amostra e a razão entre as 
áreas (ou as alturas) do pico do analito e do pico do padrão interno funciona como 
parâmetro analítico. Para que esse método tenha sucesso, é necessário que o pico do 
padrão interno seja bem separado dos picos de todos os outros componentes da 
amostra. Por outro lado, o pico do padrão deve ser próximo ao pico do analito. 
O padrão interno deve: Possuir características físico-químicas semelhantes ao do 
analito; serem termicamente estáveis; não estarem presentes na amostra em questão. 
 
2.0. CROMATOGRAFIA GASOSA 
A cromatografia é um método físico de separação, no qual os componentes a serem 
separados são distribuídos entre duas fases: a fase estacionária, e a fase móvel. 
A amostra é transportada por uma corrente de gás através de uma coluna empacotada 
com um sólido recoberta com uma película de um líquido. Devido a sua simplicidade, 
sensibilidade e efetividade para separar os componentes de misturas, a cromatografia 
de gás é uma das ferramentas mais importantes em química. É amplamente usada para 
análises quantitativos e qualitativos de espécies químicas e para a determinar 
constantes termoquímicas tais como calores de solução e vaporização, pressão de 
vapor e coeficientes de atividade. A cromatografia de gás é também usada para 
monitorar os processos industriais de forma automática: analisam-se as correntes de 
gás periodicamente e realizam-se reações de forma manual ou automática para 
compensar variações não desejadas. 
O método consiste primeiramente na introdução da mistura de prova ou amostra em 
uma corrente de gás inerte, normalmente hidrogênio, hélio, nitrogênio ou argônio, que 
atuarão como gás de arrastre. As amostras líquidas vaporizam-se antes da injeção no 
gás de arrastre. O fluxo de gás passa pela coluna empacotada através da qual os 
componentes da amostra se deslocam a velocidades influenciadas pelo grau de 
interação de cada componente com a fase estacionária não volátil. As substâncias que 
têm a maior interação com a fase estacionária são retidas por mais tempo e, por tanto, 
separadas daquelas de menor interação. À medida que as substâncias eluem da coluna, 
podem ser quantificadas por um detector e/ou tomadas para outra análise. 
Existem dois tipos de cromatografia de gás: cromatografia Gás - Sólido (CGS) e 
cromatografia Gás - Líquida (CGL). A cromatografia Gás - Sólida se baseia na base 
sólida estacionária, na qual a retenção das substâncias analisáveis é a consequência 
da absorção física. A cromatografia Gás -Líquida é útil para separar íons ou moléculas 
dissolvidas em um solvente. Se a solução de amostra estiver em contato com um 
segundo sólido ou fase líquida, os diferentes solutos interagem com a outra fase em 
diferentes graus, devido a diferenças de adsorção, intercâmbio de íons, partição ou 
tamanho. Estas diferenças permitem que os componentes da mistura se separem 
usando as mesmas para determinar o tempo de retenção dos solutos através da coluna 
2.1. Injeção da amostra com seringa 
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As amostras gasosas e líquidas podem ser injetadas com uma seringa. Na forma mais 
simples a amostra é injetada primeiro em uma câmara aquecida, onde se evapora antes 
de ser transferida para a coluna. Quando são utilizadas colunas empacotadas, a 
primeira parte da coluna, em geral, serve como câmara de injeção, aquecida 
separadamente a uma temperatura adequada. Para colunas capilares utiliza-se uma 
câmara de injeção separada onde somente uma pequena parte da amostra vaporizada/ 
gasosa é transferida à coluna, este método é conhecido como split-injectíon. Isto é 
necessário para não sobrecarregar a coluna com volume de amostra. 
Neste ponto é importante relembrar a utilização de padrão interno, vide item 1.8. 
 
 
Gás de arrastre (“fase móvel”): Necessita ser um gás inerte, He, por exemplo. 
Forno: Necessita ser estável e reprodutível, manter uma temperatura uniforme, 
abranger uma ampla faixa de temperatura e ser independente dos outros módulos. 
Fase estacionária (dentro da coluna capilar): Ser seletiva, térmica e quimicamente 
estáveis, abranger faixas de temperatura, possuir baixa viscosidade e alta pureza. Ex: 
Poliglicol. 
Coluna capilar: Diâmetro (�) = 0,1 – 0,5 mm; Comprimento (L) = 5 – 100m 
Detectores que podem ser acoplados ao conjunto: 
• DETECTOR POR CONDUTIVIDADE TÉRMICA (DCT OU TCD): Variação da 
condutividade térmica do gás de arraste. 
• DETECTOR POR IONIZAÇÃO EM CHAMA (DIC OU FID): Íons gerados durante 
a queima dos eluatos em uma chama de H2 + ar. 
• DETECTOR POR CAPTURA DE ELÉTRONS (DCE OU ECD): Supressão de 
corrente causada pela absorção de elétrons por eluatos altamente eletrofílicos. 
Possui um número de pratos teóricos muito maior que no caso da HPLC. 
A equação de van Deemter também é válida, entretanto, obviamente, o coeficiente A 
(caminhos múltiplos) não ocorre. 
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3.0. CROMATOGRAFIA LÍQUIDA (HPLC) 
A cromatografia líquida de alta eficiência, também conhecida por HPLC, sigla em inglês 
para High Performance Liquid Chromatography, é a mais utilizada de todas as técnicas 
de separação. A seguir, uma tabela com as vantagens e desvantagens da HPLC e suas 
diferenças com relação à cromatografia gasosa (CG). 
O princípio da HPLC é muito semelhante à CG. Nesta também há uma fase móvel (FM), 
a diferença é que, aqui, a FM é líquida e ocorre interação com a fase estacionária (FE). 
 
3.1. Cromtatografia de adsorção 
 
O mecanismo de separação da cromatografia líquido sólido (CLS), ou adsorção, se 
baseia na competição que existe entre moléculas da amostra e as da fase móvel em 
ocupar os sítios ativos na superfície de um sólido (fase estacionária). 
Para que a molécula do soluto possa ser adsorvida na fase estacionária, primeiro uma 
molécula da fase móvel deve ser deslocada da superfície. Se assumir que o adsorvente 
possui uma superfície polar (por exemplo: sílica ou alumina), grupos apolares (por ex.; 
hidrocarbonetos) terão pouca afinidade por essa superfície e não irão deslocar a 
molécula da fase móvel; por isso, não serão retidos. Grupos funcionais polares capazes 
de formar pontes de hidrogênio terão fortes afinidades pela superfície e serão 
fortemente retidos. Moléculas polarizáveis (por ex.: moléculas aromáticas) irão 
apresentar interação dipolo induzido-dipolo com a superfície do adsorvente e, portanto, 
também serão retidas; o grau de retenção depende da polarização de cada molécula ou 
grupo funcional. 
Diz-se que a fase é normal quando: FE é polar e FM é apolar. 
Diz-se que a fase é reversa quando: FE é apolar e FM é polar. 
A seguir um diagrama com os componentes doequipamento 
 
 
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Bomba: Os requisitos de bombeamento de HPLC são rigorosos e incluem: 
(1) A geração de pressões de até 6000 psi (libras/polegada2); 
(2) Saída com ausência de pulsos; 
(3) Controle de fluxo; 
(4) Componentes resistentes à corrosão. 
Injetor: Também pode-se utilizar microsseringas para a injeção da amostra. No caso da 
HPLC, como o sistema possui uma alça de amostragem, erros desse tipo não 
preocupam o usuário. 
Pré-coluna: Também chamada de coluna de sacrifício, geralmente é introduzida antes 
da coluna analítica para aumentar sua duração por remoção, não somente de material 
particulado e de contaminantes dos solventes, mas também de componentes das 
amostras que se ligam irreversivelmente à fase estacionária. A composição da FE da 
pré-coluna deve ser muito próxima da FE da coluna analítica, mas o tamanho de 
partículas costuma ser maior para minimizar a queda de pressão. 
Coluna analítica: A maioria das colunas para cromatografia líquida apresenta 
comprimento que varia no intervalo de 10 a 30 cm. Normalmente as colunas são retas, 
com possibilidade de aumento. Talvez a coluna mais comum atualmente em uso tenha 
25 cm de comprimento, 4,6 mm de diâmetro interno e FE com partículas de 5 µm. 
Colunas desse tipo contém de 40 a 60 mil pratos/metro. 
Os detectores mais comuns são: 
• UV–Visível; 
 
• Fluorescência; 
 
• Infravermelho; 
 
• Eletroquímicos; 
 
• Espalhamento de luz; 
 
• Espectrometria de massas. 
 
O tamanho da partícula pode causar variações no comprimento da banda. 
A equação de van Deemter se aplica inteiramente aqui. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
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