ÁCIDO ITACÔNICO

Prévia do material em texto

OTIMIZAÇÃO DA PRODUÇÃO DE ÁCIDO ITACÔNICO POR VIA 
MICROBIANA 
 
 
J. C. CRUZ
1
, J. P. FARIAS
1
, A. M. CASTRO
2
 e E. F. C. SÉRVULO
1
 
 
1
Universidade Federal do Rio de Janeiro, Departamento de Engenharia Bioquímica 
2
PETROBRAS, CENPES 
E-mail para contato: julianacruz@ufrj.br 
 
RESUMO – O ácido itacônico, listado como um dos 12 mais promissores produtos 
químicos obteníveis de biomassa, pode ser produzido por fermentação de açúcares por 
fungo filamentoso Aspergillus terreus. O ácido orgânico, de aplicação nas áreas de 
polímero, agricultura, farmacêutica e medicina, atrai interesses de desenvolvimento de 
processos fermentativos com alta produtividade. Para tal, a identificação de um 
microrganismo com capacidade significativa de produção permite, à posteriori, um estudo 
dos componentes do meio que aumente da produtividade, atentando para a o fator aeração, 
essencial na produção de ácido itacônico. O presente trabalho inicialmente selecionou 
uma entre duas linhagens de Aspergillus terreus (DSMZ 826 e DSMZ 5770) que 
produzisse ácido itacônico em maior concentração em meio com glicose como fonte de 
carbono. A linhagem selecionada foi utilizada para testes de volume de meio reacional, 
diretamente relacionado à aeração da fermentação em escala de bancada. Por fim, testou-
se uma segunda fonte de carbono: a sacarose. Os resultados indicaram que A. terreus 
DSMZ 5770 produz ácido itacônico em maiores concentrações (31g/L) em comparação 
com a linhagem DSMZ 826 (1g/L) em meio de glicose. A obtenção de ácido itacônico por 
A. terreus DSMZ 5770 em volume de 100 mL apresentou melhor condição para produção 
(22g/L) comparado com 150 mL (14 g/L). Por fim, não houve diferença significativa entre 
os valores de ácido itacônico produzido em sacarose (26g/L) e glicose (28 g/L). 
 
1. INTRODUÇÃO 
O interesse comercial do ácido itacônico é evidente, já que o resultado da polimerização do 
diácido como homopolímero ou copolímero é um produto biodegradável (Hughes e Swift, 1992) 
potencialmente aplicável em áreas como química de polímeros (resinas, poliésteres plásticos, vidro 
artificial), nos setores de agricultura, farmácia e medicina (preparação de compostos bioativos) 
(Pfeifer, 1952; Okabe, 2009; Kuenz, 2012). Tais características torna o ácido itacônico um potencial 
protagonista de otimização de processo de produção. A rota química de obtenção produção do ácido 
pode ser realizada pela desidratação ou pirólise de ácido cítrico, por descarboxilação de ácido 
aconítico, ou partir da fermentação de açúcares (Pfeifer, 1952), sendo a última utilizada 
industrialmente e atende à necessidade de processos por fontes renováveis. 
Apesar do reconhecimento do ácido itacônico como um potencial bloco de construção para 
obtenção de produtos bio-derivados (DOE, 2004), ainda não foi atingido o potencial de produção, 
Área temática: Processos Biotecnológicos 1
estando incluído ainda num mercado de nicho em muitas economias (Itaconic Acid - Global Strategic 
Business Report, 2011). Tal fato é evidenciado por ainda ser produzido industrialmente em poucos 
países (Tabela 1), o que resulta em uma produção bem abaixo da demanda mundial (Itaconic Acid - 
Global Strategic Business Report, 2011). 
Tabela 1 - Produtores de ácido itacônico no mundo (Okabe et al., 2009). 
Empresa Localização 
Início da 
produção 
Capacidade 
(ton/ano) 
Pfizer Food Science 
New York, USA; 
Sandwick, UK 
1945-1995 5.000-7.000
a
 
Iwata Chemicals Kyogyo, Japan 1970 10.000 
Tianli Biological Fermentation Factor Yunnan, China 1988 2.000 
Gansu Feipeng Biochemical Co. Ltd. Gansu, China 1989 1.000 
Chengdu Lake Biology Engineering Industry Sichuan, China 1993 4.000 
Nanjing Huajin Biologicals Co. Ltd. Nanjing, China 1994 1.000 
Jiangsu Binhai Sanai Biological Co. Ltd. Jiangsu, China 1994 1.200 
Rhodia Melle, France 1995 1.000 
Zhejiang Guoguang Biochemical Co. Ltd. Zhejiang, China 1995 1.000 
Cargill/Cultor Food Science Eddyville, USA 1996 30.000
 
Shandong Zibo Zhongshun Shandong, China 1999 1.200 
Science & Technology Co. Ltd. Diversified Co. of 
Zibo Mineral Bureau 
Zibo, China 1999 3.000 
Guangdong Leizhou Yueli IA Co. Ltd. 
Guangdong, 
China 
1999 1.500 
Qingdao Langyatai Group Qingdao, China 2000 4.500 
a
Encerrou a produção de ácido itacônico em 1996 
Área temática: Processos Biotecnológicos 2
O custo de produção do ácido itacônico por rota biotecnológica depende de custos com a 
matéria prima, fermentação e separação. Apesar dos custos de fermentação e purificação serem as 
maiores barreiras do processo, é esperado um rápido desenvolvimento tecnológico que possa 
contornar as limitações do processo. Reconhecidamente, inovação, competitividade de custos e 
expansão global são os principais determinantes do sucesso no mercado de produtos químicos 
renováveis (Global Strategic Business Report, 2011). Neste âmbito, a produção de biomoléculas a 
partir de matéria prima mais barata vem atraindo pesquisas para obtenção diversos produtos. Como 
exemplos, podem ser citados alguns trabalhos dedicados a tornar possível a utilização de madeira 
hidrolisada e milho como matéria prima de baixo custo para fermentação por fungo filamentoso 
(ITACONIX, 2009; Klement et al., 2012). 
Observa-se que estudos ainda são necessários para que a produção de ácido itacônico seja 
superior e mais rentável. De acordo com o estudo do Departamento de Energia dos Estados Unidos, é 
necessária a redução do custo de produção do ácido itacônico para, pelo menos, US$ 0,5/kg para que 
esse seja competitivo com a atual cadeia de produtos da indústria química – o valor de venda atual 
varia de US$ 1.5–2.5, custando em torno de US$ 1,2 quando comprado em toneladas (Klement e 
Büchs, 2013). Para tal resultado, o rendimento de produto por substrato consumido se torna um 
importante parâmetro para a redução de custos. No caso do uso de matéria prima de baixo custo, 
mesmo que seja mantido o valor do rendimento, o baixo custo do substrato resultaria em maior 
rentabilidade do produto. Sendo assim, fazer uso de fontes de substrato mais batatas é uma das 
estratégias de redução do custo da produção, devendo esta ser consideradas em pesquisas para tornar 
o produto mais atraente economicamente. 
Este trabalho realizou testes comparativos de obtenção de ácido itacônico por Aspergillus 
terreus DSMZ 826 e 5770, além de realizar testes de produção em diferentes condições de agitação 
(por conseguinte, aeração) e em presença de glicose e sacarose como fontes de carbono, considerando 
que a sacarose poderá ser substituída por melaço, matéria prima de baixo valor comparado com 
glicose e sacarose, de acordo com análises posteriores. 
2. MATERIAIS E MÉTODOS 
2.1. Composição do meio e condições de cultivo 
Os meios de cultivo foram preparados com glicose para o teste cinético e de volume, e com 
glicose e sacarose para o teste da fonte de carbono. A composição do meio teve como referência o 
trabalho de Kuenz et al (2012). O cultivo foi realizado em frascos cônicos de 500 mL de capacidade. 
O meio de produção utilizado continha, por litro, 120 g de glicose ou 114 g de sacarose, 0,1 de fosfato 
de potássio monobásico, 3 g de nitrato de amônio, 1 g de sulfato de magnésio hepta hidratado, 5 g de 
cloreto de cálcio dihidratado, 1,67 ppm de cloreto de ferro hexahidratado, 0,008 g de sulfato de zinco 
heptahidratado, e 0,015 g de sulfato de cobre heptahidratado. O ajuste do pH foi feito com ácido 
sulfúrico até pH 3. O meio foi esterilizado em atmosfera úmida por 20 minutos a 111°C, exceto a 
solução de cloreto de ferro, a qual foi esterilizada separadamente por filtração com membrana de poro 
de 0,2 µm. A fermentação foi conduzida em agitação constante(150 rpm, com deslocamento da 
câmara agitadora de 60 mm) a 33°C. 
Área temática: Processos Biotecnológicos 3
2.2. Quantificação de substrato, ácido itacônico e concentração celular 
A determinação da concentração de açúcares e ácido itacônico foi realizada utilizando HPLC 
Bio-Rad equipado com coluna HPX-87H, H2SO4 a 5 mM como fase móvel, numa vazão de 0,7 
mL/min, e detecção por índice de refração a 35°C. A concentração de esporos foi determinada por 
contagem em câmara de contagem espelhada e a massa celular foi determinada em balança de 
umidade com secagem por infravermelho a 105°C até massa constante. 
2.3. Produção de ácido itacônico: teste de cinética, aeração e fonte de carbono 
Para que fosse obtido um perfil cinético do cultivo, realizou-se a fermentação em múltiplos 
frascos agitados, todos com a mesma concentração de componentes e com glicose como fonte de 
carbono, variando apenas a cepa de micro-organismo inoculado. O perfil cinético foi determinado a 
cada 48 horas, durante 240 horas, em duplicata. 
Os experimentos de cinética permitiram a seleção do micro-organismo Aspergillus terreus DSM 
5770 como um potencial produtor de ácido itacônico. Diferentes volumes de cultivo representam 
diferentes taxas de transferência de oxigênio para o meio. O teste do efeito da produção ácido 
itacônico e a aeração do cultivo, representado pelo uso de 100 ou 150 mL de meio de produção, foi 
realizado com os mesmos componentes e concentrações do meio de cultivo utilizado para a avaliação 
cinética. Os resultados de concentração de glicose, massa seca de células e ácido itacônico foram 
obtidos em 192 e 240 horas, em triplicata. 
Por fim, foi avaliada a produção de ácido itacônico em diferentes fontes de carbono. 
3. RESULTADOS E DISCUSSÃO 
3.1. Análise cinética 
A determinação do perfil cinético é importante para conhecer em qual etapa de cultivo o ácido 
itacônico é produzido, se existe uma extensa fase lag de crescimento, assim como conhecer se a 
produção do ácido acompanha ou não o crescimento do micro-organismo. A Figura 1 apresenta o 
perfil cinético de crescimento e de produção por Aspergillus terreus DSM 826 (a) e DSM 5770 (b), 
assim como o consumo de substrato. A comparação da produção pelas diferentes linhagens é 
claramente diferenciada. Observa-se na Figura 1 (a) que a linhagem A. terreus DSM 826 pouco 
produziu ácido itacônico ao longo de 10 dias de fermentação. O tempo total do experimento não foi 
suficiente para esgotar a glicose adicionada, utilizada preferencialmente para o crescimento celular 
que para a produção do ácido de interesse. Em contrapartida, o perfil de produção ilustrado na Figura 
1 (b) caracteriza a linhagem DSM 5770 como potencial produtora de ácido itacônico, atingindo o 
valor de 31,5 g/L. O perfil cinético obtido, então, permite analisar que a produção do ácido se inicia 
quando a concentração celular apresenta valores em torno de 15g/L, sendo que este valor não passou 
de 20 g/L durante todo o tempo do processo. Isto identifica a produção como não associada ao 
crescimento. Com este resultado, foi selecionada a linhagem A. terreus DSM 5770 para as avaliações 
seguintes de produção de ácido itacônico. 
Área temática: Processos Biotecnológicos 4
 
 
Figura 1 - Perfil cinético de produção de células e ácido itacônico por Aspergillus terreus DSM 826 
(a) e DSM 5770 (b), em meio de cultivo contendo glicose como substrato. Concentração de células 
(g/L) (▲); concentração de glicose (g/L) (♦);concentração de ácido itacônico (g/L) (■). 
3.2. Análise de agitação/aeração 
A análise de aeração em frascos agitados pode ser feita pela constatação da produção em alturas 
de líquido diferentes. Os resultados apresentados na Tabela 2 confirmam de forma clara que a 
produção de ácido itacônico é influenciada com a aeração do meio de produção. A análise da Tabela 2 
permite avaliar que, para um frasco cônico com o mesmo volume e formato, o uso de volume maior, 
de 150 mL, resultou em menos produção de ácido itacônico comparado com o uso de 100 mL. 
Mesmo sendo pouca a diferença das alturas do líquido, a produção em 150 mL de meio foi cerca de 
60% daquela de 100 mL. 
(a) 
(b) 
Tempo (hora) 
C
o
n
ce
n
tr
a
çã
o
 d
e 
cé
lu
la
s 
e 
d
e 
á
ci
d
o
 i
ta
cô
n
ic
o
 (
g
/L
) 
Área temática: Processos Biotecnológicos 5
Tabela 2 - Produção de ácido itacônico em cultivo em frasco agitado de 500 mL contendo 100 mL e 
150 mL. Resultados de concentração celular, de glicose e de ácido itacônico nos tempos 0, 192 e 240 
horas. Erro experimental menor que 10%. 
 Volume reacional: 100 (mL) Volume reacional: 150 (mL) 
Tempo 
(h) 
Massa celular 
(g/L) 
Glicose 
(g/L) 
Ácido itacônico 
(g/L) 
Massa 
celular (g/L) 
Glicose 
(g/L) 
Ácido itacônico 
(g/L) 
0 0 120,0 0 0 120 0 
192 21,7 48,4 20,5 19,76 58,6 10,1 
240 25,6 38,0 22,6 34,1 53,3 14,0 
 
O maior volume diminui o espaço vazio do frasco, disponibilizando menor aeração. Além disso, 
o maior volume diminui a taxa de transferência dos gases para o microrganismo sintetizador. Estudos 
de Kuenz et al (2012) e Gyamerah (1995) dentre outros mostram que pequenas paradas na 
agitação/aeração são suficientes para que a produção de acido itacônico caia drasticamente. O 
resultado apresentado nesse trabalho sugere que a menor disponibilidade de oxigênio proporciona 
maior crescimento celular em detrimento da produção de ácido, o que não é interessante. Com essa 
conclusão, os experimentos seguintes foram realizados utilizando volume reacional de 100 mL. 
3.3. Análise de fermentação com glicose ou sacarose como fonte de carbono 
O uso de fonte de carbono de menor custo é uma das possíveis alternativas para a produção 
viável economicamente. A análise do perfil de produção de ácido itacônico por A. terreus DSM 5770 
por sacarose busca a possibilidade de análises de outra matéria prima que contém sacasose, como o 
melaço. A comparação da produção por diferentes fonte de carbono, sendo elas glicose e sacarose, é 
apresentada na Tabela 3. A diferença de concentração inical de substrato é justificada pela 
equivalência em número de carbonos entre uma concentração e outra. Ao final de 10 dias de 
fermentação foram produzidos 26 g/L de ácido por glicose e 28,6 g/L de ácido por sacarose, 
resultando em um rendimento de YP/S de 0,34 g de ácido itacônico/g de glicose e 0,25 g de ácido 
itacônico/g de sacarose respectivamente. O valor de rendimento é maior quando utilizada a sacasose. 
Entretando, a produtividade obtida não é significativamente diferente (0,11 g.L
-1
.h
-1 
para a produção 
com glicose e 0,12 g.L
-1
.h
-1
 para a produção com sacarose). No que tange o consumo de substrato 
observa-se que a sacarose é possivelmente mais rapidamente consumida pelo microrganismo 
avaliado. 
 
 
 
Área temática: Processos Biotecnológicos 6
Tabela 3 - Produção de ácido itacônico com glicose e sacarose. Resultados de concentração celular, 
de glicose e de ácido itacônico nos tempos 0, 192 e 240 horas. Erro experimental menor que 10%. 
 Substrato: glicose Substrato: sacarose 
Tempo (h) 
Glicose 
(g/L) 
Ácido itacônico 
(g/L) 
Sacarose 
(g/L) 
Ácido itacônico 
(g/L) 
0 120,0 0 114,0 0 
192 60,4 15,8 11,0 19,4 
240 44,2 26,0 2,9 28,6 
 
4. CONCLUSÃO 
Os resultados apresentados identificam o micro-organismo Aspergillus terreus DSM 5770 como 
potencial produtor de ácido itacônico a partir de glicose comparado com a produção por Aspergillus 
terreus DSM 826. Além disso, foi confirmada a importância da aeração do processo por testes de 
diferentes volumes reacionais para frasco de mesmo volume total. Em processosrealizados em escala 
de bancada é importante que o volume reacional não seja prejudicial à produção, já que a aeração é 
obtida pela agitação e problemas de transferência de massa podem ser mais evidentes. 
Constatou-se que a produção por Aspergillus terreus DSM 5770 tendo como substrato a resulta 
em produção de ácido itacônico comparável àquela realizada com glicose. Isso possibilita avaliações 
posteriores para busca de outras matérias primas mais baratas que contenham também sacasose, como 
o melaço. 
Visto que o ácido itacônico é um produto comercialmente interessante, a otimização da 
produção se torna cada vez mais válido. O uso de materiais de fontes de baixo valor aumenta a 
perspectiva de produção a baixo custo. O estudo da fermentação a partir de glicose e sacarose abre 
horizontes para a utilização de matérias primas de pouco valor agregado que, ao ser disponibilizado o 
açúcar fermentescível, o cultivo por Aspergillus terreus DSM 5770 em meio otimizado, pode ser um 
método bastante promissor para a obtenção de ácido itacônico em altas concentrações. 
5. REFERÊNCIAS 
DOE, Top Value Added Chemicals from Biomass Volume I – Results of Screening for Potential 
Candidates from Sugars and Synthesis Gas. 76 p. 2004. 
GYAMERAH, M. H. Oxygen requirement and energy relations of itaconic acid fermentation by 
Aspergillus terreus NRRL 1960. Appl Microbiol Biotechnol, v. 44, p. 20-26, 1995. 
HUGHES, K. A.; SWIFT, G. Rohm and Haas Company. Preparation of itaconic acid polymers. EP 
0506246 A1, 9 mar. 1992, 30 set. 1992. Disponível em www.google.st/patents/EP0506246A1?cl=un. 
Área temática: Processos Biotecnológicos 7
Acesso em: 21 abr. 2014. 
Itaconic Acid - Global Strategic Business Report. 136p. 2011. 
ITACONIX, 2009. Development of integrated production of polyitaconic acid from northeast 
hardwood biomass, Project Sponsored by NIFA, 2009–2012. 
KLEMENT, T.; BÜCHS J. Itaconic acid – A biotechnological process in change. Bioresource 
Technology, vol. 135, p. 422–431, 2013. 
KLEMENT, T.; MILKER, S.; JÄGER, G.; GRANDE, P.; DOMÍNGUEZ DE MARÍA, P.; BÜCHS, J. 
Biomass pretreatment affects Ustilago maydis in producing itaconic acid. Microbial Cell Factories, v. 
11, p. 1-13, 2012. 
KUENZ, A.; GALLENMÜLLER, Y.; WILLKE, T.; VORLOP, K. Microbial production of itaconic 
acid: developing a stable platform for high product concentrations. Appl Microbiol Biotechnol, v. 96, 
p. 1209–1216, 2012. 
OKABE, M; LIES, D; KANAMASA, S; PARK, E. Y. Biotechnological production of itaconic acid 
and its biosynthesis in Aspergillus terreus. Appl Microbiol Biotechnol, v. 84, p. 597–606, 2009. 
PFEIFER, V. F.; VOJNOVICH, C.; HEGER, E. N. Itaconic acid by fermentation with AspergilIus 
terreus. Industrial and Engineering Chemistry, v. 44, p. 2975-2980, 1952. 
Área temática: Processos Biotecnológicos 8