Espectrofotometria de Luz

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ESPECTROFOTOMETRIA
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LUZ – A Base da Espectrofotometria
Teoria Corpuscular
Princípios:
 Corpos luminosos emitem energia radiante em partículas;
 Estas partículas são lançadas intermitentemente em linha reta;
 As partículas atingem a retina e estimulam uma resposta que produz uma sensação visual.
Newton (1642-1727)
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Teoria das Ondas
Princípios:
 A luz era resultante da vibração molecular de materiais luminosos;
 Esta vibração era transmitida através de uma substância invisível e sem peso que existia no ar e no espaço, denominada “éter luminífero”;
 As vibrações transmitidas atuam na retina, simulando uma resposta que produz uma sensação visual.
Cristian Huygens (1629-1695)
LUZ – A Base da Espectrofotometria
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Teoria Eletromagnética
Princípios:
 Os corpos luminosos emitem luz na forma de energia radiante;
 A energia radiante se propaga na forma de ondas eletromagnéticas;
 As ondas eletromagnéticas atingem a retina, estimulando a uma resposta que produz uma sensação visual.
James Clerk Maxwell (1831-1879)
LUZ – A Base da Espectrofotometria
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Teoria Quântica
Princípio:
 energia é emitida e absorvida em quantum, ou fóton.
“ A energia na radiação não é contínua, mas dividida em minúsculos pacotes, ou quanta. ”
Max Planck (1858-1947)
LUZ – A Base da Espectrofotometria
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Espectro Eletromagnético
LUZ – A Base da Espectrofotometria
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LUZ – A Base da Espectrofotometria
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Balanço de energia nos processos de emissão, propagação e absorção da radiação;
A quantidade de radiação pode ser avaliada em unidades de energia ou no seu efeito sobre o receptor:
O olho humano; unidades fotométricas
A película fotográfica;  unidades fotográficas
A pele humana;	  unidades eritêmicas
Pierre Bouguer 	(1698 –1758)  Elaborou a teoria fotométrica;
J.H. Lambert 	(1728 –1777)  Formulou matematicamente;
Esquecida até a invenção da lâmpada (meados do século XIX).
“área da óptica que trata da medição da energia radiante, avaliada de acordo com seu efeito visual e relacionada somente com a parte visível do espectro”
FOTOMETRIA
LUZ – A Base da Espectrofotometria
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Grandezas Fotométricas
LUZ – A Base da Espectrofotometria
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Grandezas Fotométricas
Fluxo Radiante (watt [W])
“ é a potência da radiação eletromagnética emitida ou recebida por um corpo ” 
O fluxo radiante contem frações visíveis e invisíveis.
LUZ – A Base da Espectrofotometria
Fluxo luminoso - ( lumen [lm] ) 
“ é a parcela do fluxo radiante que gera uma resposta visual ” 
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Eficiência luminosa ( [lm/W] ) 
“ é a capacidade da fonte em converter potência em luz” 
Grandezas Fotométricas
LUZ – A Base da Espectrofotometria
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Eficiência luminosa ( [lm/W] ) 
Grandezas Fotométricas
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Intensidade luminosa ( candela [cd] ou [lm/sr] ) 
“ é a propagação da luz em uma dada direção dentro de um ângulo sólido unitário ” 
Grandezas Fotométricas
Ângulo Sólido ( [sr] ) 
1 esterradiano 
“ é o ângulo espacial que tem seu vértice no centro da esfera, cuja a área superficial é igual ao quadrado de seu raio ” 
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Iluminância ( lumen/m2 ou lux [lx] ) 
“ é a medida da quantidade de luz incidente numa superfície por unidade de área ” 
Grandezas Fotométricas
Valores típicos
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Luminância ( [cd/m2] ) 
“ é uma medida física de brilho de uma superfície, sendo através dela que os seres humanos enxergam ” 
Luminância
é uma excitação visual
Brilho
é a resposta visual desse estímulo
Grandezas Fotométricas
Superfície Difusa 
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Valores de luminâncias de algumas fontes 
Limite inferior	 0,000001 	cd/m2
Limite superior  1.000.000 	cd/m2
Ofuscamento	 25.000 	cd/m2
Grandezas Fotométricas
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Grandezas Fotométricas
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Grandezas Fotométricas
Tôdas as grandezas são produtos de área ou ângulo sólido 
Excitância luminosa (M)
M =  x E
M =  x E
p/ superfícies perfeitamente difusoras
M =  x L
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A taxa vetor iluminação/iluminação escalar é um parâmetro utilizado
para estimar a
direcionalidade
da luz e suas
qualidades
de modelação
de objetos. 
ESCALAR E VETOR ILUMINAÇÃO
Grandezas Fotométricas
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ESCALAR E VETOR ILUMINAÇÃO
EMÁX = E1 – E2
varia entre
0 ambiente totalmente uniforme, sem sombras
4 ambiente de iluminação monodirecional 
direção do vetor
Grandezas Fotométricas
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Refletância 
Absortância 
Transmitância 
Propriedades óticas dos materiais
ρ + α + τ = 1 
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Propriedades óticas dos materiais
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RADIAÇÃO ELETROMAGNÉTICA
Comprimento de onda (λ)
Período (p) = tempo necessário para completar um ciclo 
Frequência (f) = ciclos/s ou Hertz
 
 f= c/ λ 
 c = velocidade da luz no vácuo 3.1010 cm/s
 
Λ unidades
nm = 10-9 m
A= 10 -10 m
Energia (E)
E = h.f => E = h.c/λ
h= constante de Planck
ESPECTROFOTOMETRIA NA REGIÃO UV-VIS
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Espectro visível da luz de uma lâmpada difratada por um prisma: (a) esquema e (b) fotografia.
Exemplo de difração de luz produzida na natureza. 
Luz UV 
Lâmpada de gás hidrogênio ou deutério
Mercúrio
Luz Visível 
Tungstênio 
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COLORIMETRIA
Termo usado para dois instrumentos:
Comparação entre a luz transmitida por uma solução e uma solução padrão.
Medição da quantidade de energia luminosa absorvida por uma solução.
Primeiro tipo é também conhecido como “comparador de cor” e o segundo como “fotômetro”.
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ENERGIA RADIANTE E LUZ
Toda energia eletromagnética ocorre em pacotes discretos  fótons ou quanta
Energia é proporcional à frequência de radiação: 			E = h.v
	E é a energia em erg,
 v é a frequência em Hz e
 h é a constante de Planck = 6,624.10-27 erg.s
A energia radiante pode ser descrita por pacotes de energia ou movimento de onda contínua.
Comprimento de onda  é calculado por:
v  c c = 2,9976 x 1010 cm/s
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ESPECTRO DE RADIAÇÃO ELETROMAGNÉTICA
A luz visível é parte muito pequena do espectro (de 3800 a 7800 Å)
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MEDIDAS COLORIMÉTRICAS
Para comparar as amostras são necessários:
Fonte de energia radiante
Detector de energia radiante
As fontes de energia são constituídas por lâmpadas elétricas:
Lâmpadas incandescentes de tungstênio
Temperatura de cor = 2870 K 
Emite considerável energia infravermelha.
Depende muito da tensão elétrica
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MEDIDAS COLORIMÉTRICAS
Lâmpadas de descarga:
De hidrogênio:
Melhor fonte na região ultravioleta
De mercúrio:
Nível de iluminação mais alto, região ultravioleta
Estas lâmpadas são úteis nas regiões visível e ultravioleta próxima.
Aquecem muito, necessitam refrigeração (fan)
Demoram para estabilizar
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MEDIDAS COLORIMÉTRICAS
Lâmpadas de catodo ôco.
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MEDIDAS COLORIMÉTRICAS
Lâmpada de catodo ôco: 
Usa um catodo feito do elemento de interesse com gás inerte a baixa pressão interna. Baixa corrente elétrica (~ 10 mA) é imposta de forma que o metal é excitado e emite linhas espectrais características do elemento (p. ex. Cobre - 324.7 nm e algumas outras linhas; Selênio - 196 nm e outras, etc.). A luz é emitida direcionalmente através da janela da lâmpada, feita de vidro transparente nos comprimentos de onda UV e visível.
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DETECTORES DE RADIAÇÃO
Célula fotoelétrica
Bateria de pares termoelétricos
Tubo foto multiplicador
Termistores
Foto diodo
Foto transistor
Foto SCR
Diodo PIN
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FONTES DE LUZ
SOL
LÂMPADAS ELÉTRICAS
LÂMPADAS INCANDESCENTES
LÂMPADAS DE DESCARGA
LÂMPADAS LED’S
INCANDESCENTES
Fabricada em 1879 - THOMAZ A. EDSON 
-Efeito Joule 
 
VIDA MÉDIA
lâmpadas de iluminação geral : 750 a 1000 h
RENDIMENTO 
 			15 lm/W 
LÂMPADAS DE DESCARGA
utilizam a descarga elétrica através de um gás argônio, neônio, xenônio, hélio, e vapores de mercúrio e sódio. 
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LÂMPADA FLUORESCENTE
 vapor de argônio ou mercúrio a baixa pressão
parede interna revestida com material fluorescente
  
PARTIDA E OPERAÇÃO
"starter" e reator.
 
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TIPOS DE
LÂMPADA QUANTO À POTÊNCIA
 
5 W até 215 W
 
15, 20, 32, 40, 65, 85, 100, 110, e 125 W
 
VIDA MÉDIA
 
7500 h a 25000 h, ciclos de funcionamento de 3 h
 
RENDIMENTO 
 
64 lm/W a 75 lm/W + consumo do reator 15%
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EFEITO ESTROBOSCÓPICO
 fluxo luminoso emitido é proporcional à corrente “flicker”
MÉTODOS PARA REDUÇÃO DO EFEITO 
 
reatores duplos - com capacitor em série 
reatores eletrônicos
UERJ – Faculdade de Engenharia – Prof. Luiz Sebastião Costa
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LÂMPADA A VAPOR DE MERCÚRIO
tubo de arco em quartzo com argônio e mercúrio 
PARTIDA E OPERAÇÃO 
reator para limitar a corrente
UERJ – Faculdade de Engenharia – Prof. Luiz Sebastião Costa
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VIDA MÉDIA
 
18 000 h - período de 5 h por partida
 
RENDIMENTO
 
50 lm/W
UERJ – Faculdade de Engenharia – Prof. Luiz Sebastião Costa
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ESPECTROFOTÔMETRO
Espectrofotômetro UV
Instrumento para medir a quantidade relativa de energia radiante em função do comprimento de onda. 
Partes essenciais de um espectrofotômetro
Fonte de energia radiante (lâmpadas)
Monocromador: dispositivo para isolar energia radiante monocromática
Cubetas para a substância sob teste
Sensores de intensidade de radiação ou fluxo radiante que atravessa ou reflete da substância sob teste.
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MONOCROMADOR
Dispositivo para isolar bandas estreitas de energia monocromática. São de dois tipos:
Rede de difração (mais barato)
A luz refletida por uma rede de difração é espalhada em função do comprimento de onda. 
Prisma (mais caro)
O prisma refrata a luz de forma diferente em função do espectro, dispersando a luz em função do comprimento de onda.
Fendas de entrada e saída permitem escolher a cor da luz na saída.
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MONOCROMADOR (LUZ VISÍVEL)
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O que faz com que alguns raios interajam e outros passem através das coisas?
Dois requerimentos devem ser observados para que uma determinada radiação possa ser absorvida por uma molécula:
1 - A radiação incidente deve ser de frequência equivalente aquela rotacional ou vibracional, eletrônica ou nuclear da molécula,
2 - A molécula deve ter um dipolo permanente ou um dipolo induzido, ou seja, deve haver algum trabalho que a energia absorvida possa fazer.
INTERAÇÃO DA RADIAÇÃO COM A MATÉRIA
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Rotação
 
Aplicações
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Esta técnica é muito usada em laboratórios de controle de qualidade (indústrias), pesquisa e de análises clínicas e toxicológicas
Em biotecnologia:
 - Proteômica
 - Genômica
 - Transgenia
 - Expressão de proteínas recombinantes...
 *** Análise de proteínas, DNA e RNA
 
APLICAÇÕES
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APLICAÇÕES
O espectrofotômetro é usado para medir a concentração de substâncias, que absorvem energia radiante, em um solvente
Como ele trabalha com energia radiante de maior pureza que a obtida por filtros, é possível determinar a concentração de componentes de uma mistura com mais precisão e mais rápido.
Tem grande vantagem na medida de dois ou mais componentes simultaneamente, sabendo que eles absorvem radiação de diferentes comprimentos de onda.
CALIBRAÇÃO
Conhecendo a mistura que se quer analisar é efetuada uma calibração do instrumento através de amostras com concentrações variadas preparadas no laboratório. Cada amostra padrão é analisada e os dados obtidos fornecem, pelo método dos mínimos quadrados, a curva de calibração para aquela mistura. 
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DEFINIÇÕES
Colorimetria – 
Determinação da concentração de uma substância pela medida da absorção relativa da luz ou transmitância em relação à uma concentração conhecida.
I representa a intensidade de energia. 
Do esquema I1 > I0 > I > I2 
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Leis de absorção
Io
I1 
Transmitânica = It/ Io T% = It/Io x 100
Io = 100
I1 = 50
Io = 100
I1 = 50
I2 = 25
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Pierre Bouguer (1729) e de Johann Heindrich Lambert (1760) duas leis fundamentais: 
- A intensidade de luz (monocromática) transmitida por um corpo homogêneo é proporcional à intensidade de luz incidente. Isto é: 
- A intensidade de luz (monocromática) transmitida decresce exponencialmente com o aumento da espessura da camada do corpo homogêneo 
It/Io = 10 –cba onde c= concentração; 					ba= constante
T = 10-cba
log T = log 10 -cba 
log T = -cba log 10
log T = -cba -log T = cba
log 1/T = cba log Io/It = cba
 log Io/It = Absorbância
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DEFINIÇÕES
Transmitância da amostra.
Transmitância interna da amostra
 Absorbância da amostra
Índice de absorbância
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EFEITO DA CÉLULA DE MEDIDA (CUBETA)
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Lei de Lambert- Beer
A = ε b c qdo a concentração é expressa em moles/L ou
A = a b c qdo a concentração é expressa em outra unidade
a/ ε = absortividade/absortividade molar
b= caminho ópticoc
c= concentração
A = absorbância ou absorvância
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Representação gráfica da Lei de Beer, para soluções de KMnO4 em l = 545 nm e um caminho óptico de 1 cm. 
Em %Transmitância %T versus c
b) Em Absorbância A versus c
 
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Absortiviade (a) ou absortividade molar
Característica de uma substância para um determinado comprimento de onda e um determinado solvente
Absortividade – capacidade da molécula em absorver energia
A = abc
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Fenômenos envolvidos quando um feixe (monocromático) de radiação incide sobre uma cubeta contendo uma solução que absorve no comprimento de onda incidente. 
Io = Ir + Ie + Ia + It Io = Ia + It
Io = Intensidade do feixe incidente, Ir = Intensidade do feixe refletido, resultado das diferenças do índice de refração entre o absorvedor e o ambiente, Ie = Intensidade do feixe espalhado, resultado de um meio não homogêneo (suspensão) e/ou de flutuações térmicas, Ia = Intensidade do feixe absorvido pelo meio It = Intensidade do feixe transmitido. 
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Espectro de absorção do permanganato de potássio
A amostra (1) tem 66mg/L de concentração. As demais (2),(3),(4) e (5) foram diluídas para (0.8), (0.6), (0.4) e (0.2) da concentração da primeira amostra, respectivamente.
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Se várias substâncias absorverem a a radiação,há um efeito aditivo: 
 Abs = a1b1C1 + a2b2C2 + . . .
Máx. de absorção a 525 nm
A= 0,233
a = 
Máx. de absorção a 625 nm
A = 0.318 -> a = 0,106/ppm.cm
Corante vermelho
Corante azul
Mistura corante azul + vermelho
A 510 nm= 0,183
a = 0,061/ppm.cm
Mistura:
A 510 nm= 0,317
A625nm = 0,477
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a- Espectro de uma lâmpada de luz branca 
b- Espectro de uma solução aquosa de azul de bromotimol 10-5 mol L-1 (laranja) 
c - Espectro de uma solução etanólica de fluoresceína 10-5 mol L-1 (amarela) 
Figura 1 - a. conjunto dos comprimentos de onda correspondentes ao espectro de emissão de uma lâmpada de tungstênio-halogênio (luz branca); b. região espectral transmitida por uma solução de azul de bromotimol e o respectivo espectro de absorção; c. região espectral transmitida por uma solução de solução amarela de fluoresceína e o respectivo espectro de absorção. 
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INSTRUMENTAÇÃO
Esquema Básico de um Instrumento para Medir a Absorção
Sistema de Feixe Simples
Sistema de Feixe Duplo
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Fontes de radiação UV-VIS
Lâmpada de Tungstênio e Tungstênio-Halogênio: O filamento da lâmpada de tungstênio vaporiza-se e esses vapores fixam-se na face interna do bulbo da lâmpada. 
Lâmpada de Deutério: Normalmente usa-se a lâmpada de deutério para comprimentos de onda entre 180 a 370nm. 
Monocromadores
 Filtros, Filtros de interferência, Prismas , Grades de difração
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Espectro visível da luz de uma lâmpada difratada por uma grade de difração : (a) esquema e (b) fotografia. 
Grade de difração
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Esquema (a) e fotografia (b) do tubo fotomultiplicador
HAMAMATSU - R928 
Fotografias de arranjos de diodo com 1024 elementos (detectores de diodo): a. vista de topo; b. vista de perfil. 
Detectores
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Esquema óptico de um espectrofotômetro com detector de arranjo de diodos 
Vê-se neste esquema duas fontes de radiação, as lâmpadas de deutério e de tungstênio, cujas emissões são focalizadas através de uma lente sobre a amostra. Portanto, todo o espectro de emissão da lâmpada incide sobre a mesma, sendo que a radiação incidente será, em parte, absorvida. Esta radiação que atravessou a amostra (transmitida ou emergente) irá incidir sobre uma lente que focaliza o feixe sobre uma fenda, e desta sobre uma grade de difração. Esta grade irá difratar a radiação, separando os seus diferentes comprimentos de onda, sendo que cada um deles irá incidir sobre um diodo do arranjo. Este diodo, ao ser irradiado, produz uma corrente elétrica cuja magnitude depende da intensidade da emissão (novamente aqui se aplica o efeito fotoelétrico). Através de um circuito de calibração adequado, esta corrente será transformada em absorbância nos diferentes comprimentos de onda, resultando no que se convenciona chamar de espectro de absorção.
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Exemplo de espectro obtido com detector de arranjo de diodos
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Imagens do Aparelho
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Cubetas: :São tubos em formato quadrado constituído de materiais translúcidos.
Espectrofotometria de Luz Visível
Cubeta de Vidro ou Plástico
Espectrofotometria de Luz Ultravioleta
Cubeta de Quartzo
 Localização do espectrofotômetro
 - Bancada estável e exclusiva (se possível)
 - Longe de fontes eletromagnéticas (rádio, microondas...)
 Ligar 30 mim antes do uso
 Cubetas (tipo e manuseio)
 Calibração