TERAPIA GÊNICA V2

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TERAPIA GÊNICA
TRATAMENTO DE DOENÇAS GENÉTICAS
Na maioria das vezes o tratamento das doenças genéticas é somente paliativo → amenizando os sintomas ao invés de agir na causa primária: o gene.
Terapia Gênica
Consiste na transferência de material genético para células- alvo, com o objetivo de suprir os produtos de um gene estruturalmente anormal no genoma do paciente:
-adição do gene normal 
-correção do gene 
-silenciamento do gene defeituoso
ESTRATÉGIAS TERAPÊUTICAS
RELATO DE CASO
-criança de 8m após batida na cabeça apresenta sangramento nasal com recorrência → distúrbio coagulação???
 -testes mostrou 1% atividade fator IX → Hemofilia B 
-teste genético confirmou mutação 
-tratamento padrão: infusão intravenosa de concentrado da proteína recombinante ou derivado plasma 
-risco de doenças infecciosas (hepatite, AIDS) e anticorpos contra proteína recombinante
-19 anos: incluído ensaio clínico p/ Terapia Gênica -vetor AAV
- com gene fator IX direcionado p/fígado (injeção na veia porta) 
-aumento nos níveis fator IX
FORMAS POTENCIAIS DE TERAPIA GÊNICA
TERAPIA GÊNICA GERMINATIVA
Introdução dos genes no zigoto, célula resultante da fecundação, ou nos óvulos e espermatozoides. Assim, as células que se originam dessas células germinativas passarão a ter o gene de interesse em seu genoma.
Alteração de células reprodutivas (óvulos, espermatozoides ou células precursoras).
Além das questões éticas, esta terapia apresenta inúmeros problemas operacionais: alta taxa de mortalidade; desenvolvimento de tumores e malformações; alteração de embriões potencialmente normais e a irreversibilidade das ações.
Os primeiros trabalhos demonstrando ser possível introduzir segmentos de DNA (genes) no pro núcleo fertilizado de ratos, implantar os zigotos no oviduto e identificar os genes introduzidos em todas as células do animal recém-nascido. Os ratos nascidos dessa manipulação são chamados de transgênicos e já se tornaram ferramenta de amplo uso para o estudo de doenças genéticas, alterações do desenvolvimento, imunologia, oncologia e neurobiologia. Nos últimos dez anos a produção de ratos transgênicos criaram uma nova área de tecnologias de células embrionárias. Ainda que em ratos já seja possível promover alterações de células embrionárias usando vetores retrovirais, recombinação homóloga e inativação específica de gene gene knockout, em outros animais, devido ao grande número de limitações, apenas a técnica da microinjeção vem sendo empregada. Mesmo em ratos, cujo genoma amplamente conhecido é fator favorável ao sucesso dessas técnicas, sérios problemas persistem, traduzindo a complexidade da manipulação do genoma embrionário. Baixa freqüência de integração do gene introduzido; integração, produzindo deleção, duplicação e transnslocação; integração ocorrendo ao acaso dentro do genoma; risco potencial de mutagênese insercional devido à falta de controle do sítio de integração tendo como consequências o impedimento da função de um gene normal; a conversão de um protooncogene em oncogene e/ou a inativação de um gene supressor tumoral, são os problemas mais comumente citados.
TERAPIA GÊNICA DE CÉLULAS SOMÁTICAS
só é utilizada para tratar doenças genéticas recessivas em células de diferentes tecidos não relacionados a produção de gametas. A sua característica básica é a de provocar uma alteração no DNA do portador da patologia, através da utilização de um vetor, que pode ser um retrovírus (Retrovírus ou RNAvírus, quando utilizados como vetores na terapia gênica somática, alteram de forma permanente a célula hospedeira, integrando-se ao genoma. São utilizados especialmente em células dos músculos liso e esquelético, da medula óssea, fibroblastos e hepatócitos)ou um adenovírus(ou DNAvírus, são utilizados como vetores para procedimentos de terapia gênica somática, especialmente em células do epitélio respiratório, não se integrando ao genoma da célula hospedeira. ).
Os problemas operacionais desta técnica são: o tempo de vida da célula hospedeira; a baixa expressão do gene; o controle da expressão gênica; a dificuldade de atingir o tecido-alvo e o seu potencial oncogênico.
Terapia in vivo: as células são tratadas dentro do corpo
 O vetor é introduzido diretamente no organismo. Essa forma é considerada mais eficiente e menos dispendiosa. Porém, é preciso o endereçamento correto, se um gene é destinado ao fígado, deve-se garantir que chegue a este órgão e não ao pâncreas, por exemplo.
Terapia ex vivo: as células do paciente são retiradas e manipuladas fora do corpo
As células do indivíduo são retiradas, modificadas e reintroduzidas. É um método mais difícil, porém, mais fácil de controlar.
Inserção
1. Inserção de um gene em um vetor 
2. Contato Vetor / Célula 
3. Entrada e transporte do gene até o núcleo da célula
4. Transcrição do RNAm a partir do gene 
5. Tradução do RNAm em proteína 
6. Secreção, fixação na membrana ou expressão citoplasmática da proteína
PROCEDIMENTO BÁSICO PARA TERAPIA GÊNICA
CÉLULAS ALVO
Características: acessíveis, tempo de vida longo no corpo, alta taxa de proliferação
Tipos de células alvo: 
Células tronco (medula óssea- cordão umbilical) 
linfócitos 
fibroblastos de pele 
células musculares (mioblastos) 
células vasculares endoteliais 
hepatócitos
Técnicas de introdução de genes em células de mamíferos:
Técnicas que utilizam métodos físicos ou químicos: baixa eficácia e transitório
microinjeção de DNA 
eletroporação (choque elétrico) 
biobalística (gene gun) 
Precipitado de fosfato de cálcio 
Lipossomos
Sistemas Não-Virais: Microinjeções de DNA
Introdução de uma pequena quantidade de DNA diretamente no núcleo da célula-alvo com o auxílio de um aparelho denominado micromanipulador.( (terapia ex vivo ou in vivo- embrião)
 Número de células que pode ser transformado é geralmente muito baixo e a operação de um micromanipulador é muito delicada e requer pessoal treinado e especializado. 
Utilizada principalmente no desenvolvimento de vacinas de DNA.
Sistemas Não-Virais: Eletroporação
Técnica de microbiologia em que um campo eléctrico é aplicado nas células de modo a aumentar a permeabilidade da membrana celular, permitindo que produtos químicos, medicamentos ou DNA possam ser introduzidos na célula. Permite, portanto, transferência de íons e moléculas solúveis em água para dentro da célula. Utilizada como forma de aumentar a eficiência das vacinas de DNA, para ativar a imunidade contra o câncer;[8] na eletroquimioterapia.
Pulsos elétricos curtos de alta voltagem; 
Permeabilizarão da membrana celular; 
Entrada na célula de diferentes tipos de moléculas, entre as quais os DNA.
Eletroporação = choque elétrico → poros (morte celular).
Sistemas Não-Virais: Microesferas – Biobalística ou Gene-Gun
Método de transferência direta de genes em uma célula, com o objetivo de criação de organismos transgênicos. Consiste na estimulação dos genes de interesse no interior das células com a ajuda de um canhão de DNA, com o qual se modifica o DNA da célula. 
Sistemas Não-Virais: Transfecção com Fosfato de Cálcio
Os íons de cálcio podem fazer com que uma célula apropriada aceite que genes exógenos entrem na célula por difusão. Um posterior choque térmico induz a célula a reparar-se. Isto é um método rápido de transfecção, embora um método relativamente ineficiente. 
Método utilizado com sucesso para introduzir transgenes em células in vitro; 
Não apropriado para aplicação in vivo.
Precipitado c/DNA- endocitose (cultura celular – ex vivo)
 
Sistemas Não-Virais: Lipossomos
Pequenas vesículas esféricas formadas por bicamadas concêntricas de fosfolipídios que se organizam espontaneamente ou por ultra-sons em meio aquoso em que o componente da solução usada (íons, moléculas) pode preencher a cavidade do interior do lipossoma. Tais partículas são consideradas uma excelente forma de sistema de liberação controlada de medicamentos ou substâncias biologicamente ativas devido a sua flexibilidade estrutural seja no tamanho,composição e fluidez da bicamada lipídica, como na sua capacidade de incorporar uma variedade de compostos tanto hidrofílicos como hidrofóbicos.
Dupla camada lipídica englobando uma fração aquosa -complexo de DNA e lipídeos. 
Lipossomos catiônicos: padrão ouro de vetores não virais
Desvantagens: Não possuem capacidade intrínseca de atravessar a membrana nuclear:1 em 1000 plasmídeos atinge o núcleo; Grande maioria são levados ao sistema lisossômico.
Principais fatores considerados na escolha do vírus: 
Capacidade: tamanho do segmento de material genético que podem conter; 
Tropismo: vírus infectam determinados tipos celulares; 
Capacidade de infectar células que não estão em divisão; 
Vetores integradores ou não integradores: fazem integração do gene transferido no material genético da célula hospedeira. Quando o material genético não é integrado, torna-se epissomo extracromossômico.
Técnicas que utilizam vetores biológicos: 
Retrovírus (RNA) 
Adenovírus (DNA) 
Adenovírus associado-AAV (parvovírus) 
Lentivírus (retrovírus → cels. não dividem) 
Herpes vírus (invadir neurônios) 
Cromossomo artificial
RETROVÍRUS
Retrovírus (vírus de RNA) são os vetores ideais para a transferência de genes em células humanas: 
São capazes de infectar quase 100% das células-alvo em divisão→ integra no genoma hospedeiro 
Carregam fragmentos relativamente grandes de DNA (8kb) 
Desvantagem: infectam somente células em divisão
Genes retrovírus: Gag: proteína cápsula interna/ Env: transcriptase reversa e integrasse/ Pol: envelope glicoproteína
Inserção retroviral: Ocorre inserção casual do DNA no genoma celular. A inserção casual do DNA no genoma das células hospedeiras pode : inativar um gene importante: morte celular ,ativar um oncogene: alterar o padrão normal de controle e divisão celular → câncer ou causar mutação
Adenovírus
Vetor mais utilizado em terapia gênica contra o câncer;
Vantagens: 
- DNA dupla fita; 
- Infectam grande variedade de tecidos; 
- Não possuem envelope, sua partícula é muito estável; 
- Não se integram no DNA das células hospedeiras; 
- Aceitam inserções de 30Kb; 
- Penetram em células que não se multiplicam; 
- Não ativam protooncogene
Desvantagens 
- Não é integrado ao genoma celular; 
- Resposta imune contra o tecido transduzido com o vetor. 
- Baixa taxa de entrega in vivo expressão transitória 
Barreira para Terapia Gênica - Entrega do Gene
Estabilidade do vetor que carrega o gene durante transporte 
Penetrar o tecido a ser captado pelas células alvo 
Após endocitose, escapar de degradação lisossomal 
Transporte para o núcleo 
Manter atividade transcricional no núcleo 
Evadir a resposta imune
Pré-Requisitos: Terapia Gênica
escolher a doença apropriada a ser tratada 
identificar e clonar o gene e suas regiões reguladoras 
assegurar que o gene inserido não tenha efeitos prejudiciais 
determinar as células-alvo certas que tenham duração de vida adequada 
verificar se a técnica é segura e eficiente para a introdução do gene nas células
restringir a transferência do gene às células alvo somáticas documentar e divulgar os resultados obtidos
Classes de Doenças Passíveis de Terapia Gênica
Doenças Hereditárias (monogênicas - AR) 
Neoplasias Doenças infecciosas (AIDS) Outras 
Doenças: doença arterial coronária; artrite; doença renal, etc 
Mais de 1800 protocolos aprovados
2004: China aprovou 1º terapia gênica comercial para câncer de cabeça e pescoço 
2011: Pensilvania (CTL019) terapia de leucemia linfoblástica aguda
Algumas tentativas de terapia gênica : 
Deficiência da enzima desaminase de adenosina (ADA)
Imunodeficiência combinada severa ligada ao X (XSCID) 
Fibrose Cística 
Hemofília 
DMD 
Hipercolesterolemia Familial: LDLR (receptor de lipoproteína de baixa densidade) 
Doença de Parkinson e artrite 
Câncer 
AIDS
Deficiência da Desaminase de Adenosina - (ADA) 
A sensibilidade e especificidade dos valores da ADA no derrame pleural, para o diagnóstico de tuberculose, dependem do estudo e da metodologia; e quanto maior for a prevalência da tuberculose pleural, maior será o valor preditivo positivo da ADA.
Doença imunológica rara:
debilitação do sistema imune (imunodeficiência) 
Enzima ADA: via purinas (tóxica) 
linfócitos T (células-alvo) são muito acessíveis 
grande variação no nível de expressão do gene ADA entre indivíduos normais 
o primeiro protocolo aprovado para terapia gênica foi para a correção da deficiência da ADA. 
 Terapia passada:
linfócitos T foram coletados e expandidos em cultura ex vivo →infectadas com retrovírus recombinante 
os linfócitos foram injetados nos pacientes 
expressão do gene ADA →detectada por 12 anos nos linfócitos periféricos 
transferência do gene não foi eficiente: receberam PEGADA (enzima exógena)
NOVA TÉCNICA: 
gene ADA transferido para células tronco: sangue do cordão umbilical 
10% dos linfócitos T circulantes carregavam o gene normal 
tratamento com enzima ADA exógena (PEG-ADA) foi removida progressivamente 
Células T expressando ADA ⇑ significantemente 
IMUNODEFICIÊNCIA COMBINADA SEVERA LIGADA AO X- XSCID
A imunodeficiência combinada grave é uma doença decorrente da imunodeficiência séria e potencialmente fatal. Ela está presente ao nascimento e pode ser causada por mutações em muitos genes diferentes. Todas as formas são de caráter hereditário.A forma mais comum resulta de uma mutação em um gene do cromossomo X (sexual) (denominada doença ligada ao cromossomo X) e ocorre quase que exclusivamente em meninos. as células natural killer não funcionam normalmente. As células natural killers (exterminadoras naturais) são um tipo de leucócito que reconhece e mata células anormais (como determinadas células infectadas e células cancerígenas).
Devido mutação do gene IL2RG: codifica a cadeia γ do receptor IL-2
Pacientes faltam células T e células B prejudicadas 
França: 10 crianças selecionadas para terapia gênica: células da medula óssea retrovírus 
9/10 crianças apresentaram células T com o gene transduzido 
Duas crianças desenvolveram leucêmia de células T ~ 3 anos após a terapia inserção do retrovírus próximo ao promotor do oncogene LMO2 (fator de crescimento) 
FIBROSE CÍSTICA 
Uma doença genética, crônica, que afeta principalmente os pulmões, pâncreas e o sistema digestivo.Um gene defeituoso e a proteína produzida por ele fazem com que o corpo produza muco mais espesso que o usual. O muco espesso leva ao acúmulo de bactéria e germes nas vias respiratórias, podendo causar inchaço, inflamações e infecções como pneumonia e bronquite, trazendo danos aos pulmões. Esse muco também pode bloquear o trato digestório e o pâncreas, o que impede que enzimas digestivas cheguem ao intestino. O corpo precisa dessas enzimas para digerir e aproveitar os nutrientes dos alimentos, essencial para o desenvolvimento e saúde. Pessoas com fibrose cística frequentemente precisam repor essas enzimas através de medicamentos tomados junto às refeições, como forma de auxílio na digestão e nutrição apropriadas.
gene mutante: CFTR - 7q31-32 (AR) 
proteína reguladora de condutância transmembrana: transporte de Cl- diminuído e do Na+ aumentado 
afeta as glândulas exócrinas: problemas respiratórios, digestivos e pancreáticos
Terapia 
vetor adenoviral: infecta os pulmões, penetra em células que não estão em divisão sem integrar no seu DNA, permitindo que estas expressem o DNA viral, introduzido pelo nariz com um spray (terapia in vivo) 
Desvantagem: inflamação com ataque imune que neutraliza as células contendo gene adenoviral; efeito da terapia de vida curta, cerca de 6 semanas 
Nova estratégia (2014): 
vetor pDNA (DNA plamídeo) complexado com lipossomo → usando nebulizador (aerosol viscoso)
Terapia Gênica - Cegueira 
À medida que algumas pessoas envelhecem, os genes responsáveis pelas defesas naturais do olho começam a apresentar anomalias e a destruir as células da mácula, levando à perda da visão. Uma injeção é aplicada na partede trás dos olhos, introduzindo um vírus inofensivo que contém um gene sintético. O vírus infecta as células da retina e libera o gene. Isso permite que o olho produza uma proteína destinada a impedir que as células morram e a manter, assim, a mácula saudável 
Abril/2008: Universidade da Pennsylvania e Hospital da Philadelphia (USA) e Universidade de Londres: trataram pacientes adultos jovens com neuropatia óptica de Leber (LCA2) → defeito no pigmento do epitélio da retina 
Inserção do gene RPE65 (injeção com vetor viral direto na retina): codifica a enzima que auxilia na conversão da vitamina A para rodopsina A (pigmento das células fotorreceptoras que absorvem luz
Após a terapia mostraram melhora na visão: maior sensibilidade a luz, detectaram movimentos manuais e leitura de linhas de um cartaz de exame oftalmológico 
Perspectiva: terapia em crianças c/LCA2 e retinoblastoma 
2014- Universidade de Oxford: terapia gênica da coroideremia (lesão da retina) → mutação no gene CHM → vetor AAV injetado na retina em 6 homens → melhora da visão (Nature, 2014)
TERAPIA GÊNICA DO CÂNCER
Genes supressores do tumor são genes normais que retardam a divisão celular, reparam erros do DNA ou indicam quando as células devem morrer (processo conhecido como apoptose ou morte celular programada). Quando os genes supressores do tumor não funcionam corretamente, as células podem se desenvolver fora de controle, o que pode levar ao câncer.
Introdução de genes supressores de tumor para restaurar a função perdida. 
Ex.: inserção do gene TP53 normal em tumores de pulmão ⇒ bloquear a progressão tumoral e apoptose
Terapia pró-droga ou gene suicida: transferência de um gene (HSV-tk) → tirosina quinase → que ativam pró-drogas → tornam as células em divisão sensíveis a drogas selecionadas 
Usado no tratamento do Glioma: tipo de tumor cerebral que afeta as células da glia que suportam e interagem com os neurônios; 
Um gene suicida na presença de um droga é ativado e mata as células que o contêm. 
Ex.: câncer cerebral, cabeça e pescoço, ovário, mama, pulmão, cólon e pele
Terapia Gênica no Brasil
Em 2004 foi criada a Rede de Terapia Gênica 
27 institutos ou Departamentos de 6 estados (Rio de Janeiro, São Paulo e Rio Grande do Sul), financiados pelo Institutos do Milênio do CNPq/MCT. 
Pesquisas: introdução de genes com efeito terapêutico 
Qual o alvo do Brasil? 
terapia gênica em câncer 
doenças graves do metabolismo 
doenças degenerativas e cardiovasculares 
vacinas de DNA profiláticas para doenças infecciosas e vacinas de DNA terapêuticas para HPV
Rede é composta por: 
Rio de Janeiro: o Instituto de Biofísica da UFRJ, o Instituto Oswaldo Cruz e o Instituto Nacional do Câncer (INCA); 
São Paulo: os Departamentos de Microbiologia e Biologia Celular e Desenvolvimento da USP, o CINTERGEN da UNIFESP, o InCor e o Instituto Butantã; 
Rio Grande do Sul: os Departamentos de Genética e de Biofísica e o Hospital de Clínicas da UFRGS, bem como o Instituto de Cardiologia do Rio Grande do Sul.
2009: 1o. Estudo Clínico em pacientes cardíacos (isquemia) – fases 1 e 2 (segurança e eficácia) Coordenado pelo Dr. Renato Karan Kalil – Inst. Cardiologia do Rio Grande do Sul 
Grupo de 10 pacientes: injeção de DNA (plasmídeo c/gene VEGF-165) diretamente no coração →estimula angiogênese 
8 pacientes apresentaram bons resultados: aumento na capacidade de bombear sangue e desempenho em testes de esforço físico
Glybera: primeiro medicamento comercial de terapia gênica (Lab UniQure - Holanda) 
Deficiência da enzima lipoproteína lipase: digestão da gordura.
Vetor: adenovírus-associado Aplicação de 12 injeções no músculo da perna (dose única) 
Custo: 1,5 milhão de euros (R$ 3 milhões)
NANOTECNOLOGIA
É o estudo de manipulação da matéria numa escala de nanômetros (1 milímetro é igual a 1 milhão de nanos) 
Tamanho: 5-500nm (um bilionésimo de metro) - minúsculas partículas: variadas formas → tubos, conchas, espirais
Materiais: polímeros, dendrímeros, lipossomos, nanotubos de carbono e metais (ouro e óxido de ferro)
Polímeros: vetor para entregar drogas quimioterápicas e RNAi
avaliar a toxicidade (ativação do complemento, imunogenicidade, carcinogenicidade, teratogenicidade) → devem ser não tóxicos e biodegradáveis → evitar acúmulo no organismo (fígado, baço e medula óssea).
Nanoconchas - esferas microscópicas → núcleo de sílica, recoberto com uma finíssima camada de ouro e, em segundo lugar, luz com comprimento de onda na faixa do infravermelho 
→ destroem células tumorais quando aquecidas com a luz de um raio laser → interagem com a luz de forma específica → "configuradas" para destruir sob a ação de comprimentos de onda específicos
injetaram nanoconchas na corrente sangüínea de camundongos com câncer de cólon → as nanoconchas se acumulam preferencialmente nos tumores (vasos mal formados e permeáveis) → irradiação dos tumores com fonte de laser → 82% dos camundongos sobreviveram
”Nanocomplexo: liposomo + anticorpo, junto com terapia genética → irá tanto detectar quanto alvejar células metastatizadas de câncer, destruindo-as.
liposomo encapsula o gene p53 → ativa apoptose nas células com danos genéticos. 
O complexo liposomo-anticorpo → encontra a célula cancerosa → ligando-se ao receptor transferrina (presente em grande número na superfície das células cancerosas). 
Terapia: melhorou o tratamento do câncer por quimioterapia e radiação → morte das células danificadas → nanocomplexo atinge somente as células cancerosas
”Imunonanoconchas”: nanoconcha direcionável →possa encontrar um tipo específico de câncer, onde quer que ele possa estar escondido 
conectaram anticorpos anti-HER2 em nanoconchas → aplicaram essas imunonanoconchas sobre células de câncer de mama (em laboratório) → utilizaram raios laser para aquecer o agente. -Coraram as células → somente morreram as células de expressão do HER2 que tinham sido ligadas a nanoconchas 
Células que não foram expostas ao câncer também sobreviveram, sugerindo que o tratamento anticorpo-nanoconcha efetivamente destrói as células cancerosas HER2+.
ONOEMULSÃO MULTIFUNCIOANAL –NONOTERANÓSTICO
Nanopartícula de óxido de ferro em emulsão água-óleo carregando um fluoróforo (imagem guiada) e droga terapêutica, após injeção intravenosa para alvejar câncer de cólon em ratos.
Nanopartículas alvo-dirigidas em estudos pré-clínicos e clínicos.
SGT-53: lipossomo contendo plasmídeo com o gene TP53 → tem como alvo receptor de transferrina → alta expressão em células cancerosas. 
Nanopartículas: doxorrubicina + 5-aza-dC → câncer mama
Nanopartículas e toxicidade
•Apesar do uso de nanopartículas até mesmo para consumo há poucas informações sobre os possíveis efeitos tóxicos para a saúde humana e o meio ambiente 
- Efeitos já observados: 
- Catalisar danos oxidativos ao DNA 
- Nanopartículas de ouro: têm a capacidade de mover-se através da placenta da mãe para o feto quando injetadas em ratas grávidas
- Nanopartículas de prata: Granulomas em ratos e camundongos após a exposição aguda 
Nanotubos de carbono: causam acelerado estresse oxidativo na pele