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MICROBIOLOGIA– Prof: Maria Cristina Tognim e Sheila Belini 13/03/19 Definição: o A microbiologia é o ramo da biologia que estuda os seres vivos microscópicos nos seus mais variados aspectos como morfologia, estrutura, fisiologia, reprodução, genética, taxonomia e também a interação com outros seres e com o meio ambiente. o A microbiologia abrange, ainda, o estudo das aplicações industriais dos microrganismos, embora a tendência atual seja deixar esta função para a biotecnologia. CARACTERÍSTICAS GERAIS DAS BACTÉRIAS 1) Morfologia e ultra-estrutura Tamanho das Bactérias Na ordem de milésimos de milímetros = micrômetros Morfologia Cocos bactérias arredondadas o Cocos em cadeia = estreptococo; pneumonias o Cocos em pares = diplococos o Estafilococos formam septos de divisão em diversas partes da bactéria Bacilos – bastão o Sentido amplo – bastonete o Sentido restrito – bastonetes cujas extremidades são cortadas em ângulo Espirilos – espiral o Sentido restrito – em forma de hélice ou saca-rolha o Vibrião – segmento em espiral (vírgula) Vibriones; Espiroquetas; Espirilos ESPIRILOS – leptospira; borrelia (mais curta com poucas espiras); treponema (mais intermediária em torno de 10 espiras), o treponema é causador da sífilis 2) A CÉLULA BACTERIANA MEMBRANA CITOPLASMÁTICA Responsável pela separação do meio interno (citoplasma) e externo da célula - ESTRUTURA QUÍMICA Composta por proteínas e lipídeos imersos em uma bicamada fosfolipídica - FUNÇÕES a. Transporte de solutos b. Produção de energia por transporte de elétrons e fosforilação oxidativa c. Biossíntese enzima que faz a síntese está ligada à membrana d. Duplicação do DNA proteínas que duplicam estão ali localizadas e. Secreção (e.g., enzimas hidrolíticas, toxinas, bacteriocinas, penicilinases) - MESOSSOMOS Invaginações múltiplas da membrana citoplasmática. Septal Desempenha importante papel na divisão celular atua como fuso separando os dois cromossomos duplicados. Além disso, participa da formação das paredes transversais Lateral Concentra enzimas envolvidas no transporte eletrônico conferindo à célula maior atividade respiratória ou fotossintética ESTRUTURAS EXTERNAS À PAREDE CELULAR FLAGELOS o Nem toda bactéria apresenta flagelo. Sua principal função é o deslocamento. Proteína = flagelina (OBS: algumas bactérias movimentam-se por meios diferentes p. ex: deslizando sobre a superfície de um meio sólido com movimentos sinuosos) o Flagelo único de um lado = monotríqueo o Múltiplos flagelos de um lado = lofotríqueo o Flagelos de ambos os lados = anfitríqueo o Múltiplos flagelos sobre todaa superfície celular = peritríqueo PELOS, FÍMBRIAS OU ‘PILI’ o Apêndices filamentosos proteicos são menores, mais curtos e mais numerosos que os flagelos o Não desempenham papel relativo à mobilidade o Servem para aderência. Nem toda bactéria apresenta. Proteína = pelina o Pilus F sexual – faz a transferência do plasmídeo, é um condutor de material genético durante conjugação bacteriana. Ela só terá esse pili se apresentar o plasmídeo. o Com a passagem do plasmídeo a bactéria que recebeu pode adquirir a capacidade de transferir esse plasmídeo que ela conseguiu o Pilus tipo 1 – fimbria que gruda na célula permitindo a geração de uma infecção o Outros funcionam como receptores de bacteriófagos e estruturas de aderência CÁPSULA o Composta de açúcares e poucas proteínas – glicoproteica. Estrutura frágil. Polímeros de açúcares o Estrutura antifagossitária – engana o sistema imunológico. o Bactérias que causam meningite, as 3 apresentam cápsula. PAREDE CELULAR Bactérias Gram positivas e Gram negativas o Composição química e estrutura GRAM POSITIVA – parede mais espessa, apresenta predominantemente um único tipo de macromolécula GRAM NEGATIVA – parede mais fina e uma membrana externa semelhante a interna, ambas lipoproteicas; possui parede composta por várias camadas que diferem na sua composição química Na maioria das bactérias, a rigidez da camada é devido a uma substância encontrada somente em procariotos: peptídioglicano. Bactérias Gram-positivas possuem muito mais peptideoglicano que as bactérias Gram-negativas; Peptídioglicano é uma macromolécula formada por N-acetil-glicosamina (NAG) e ácido N- acetilmurâmico (NAM); Ao NAM estão ligadas, covalentemente, cadeias laterais de tetrapeptideos (CLT); 1) COMPONENTES CARACTERISTICOS DA PAREDE CELULAR DAS BACTÉRIAS GRAM POSITIVAS – camada espessa de peptídeoglicano com ac. teicóicos saindo dela 1. Peptidioglicano O álcool não consegue penetrar Estrutura química: o Ac. N-acetilglicosamina (NAG) o Ac. A-acetilmurâmico (NAM) SINTESE: o 1° fase: síntese de monômeros no citoplasma. Dependente da glicose-6-fosfato. FOSFOMICINA é um antibiótico que atua nessa fase. Realiza sua atividade bloqueando a formação do pentapepitídeo; o 2° fase: polimerização dos monômeros no meio extracelular ou espaço periplasmático. VANCOMICINA e TEICOPLANONA o 3° fase: ligação cruzada dos polímeros ocorre no meio extracelular ou espaço periplasmático. BETALACTANTOS Penicilina – atua bloqueando a síntese da parece celular. Liga-se nas PBP’s que são proteínas da bactéria. 2. Ácido teicóicos Ácido teicóido de parede ligado ao peptídioglicano e ácidos lipoproteicos (LTA) Funções dos ácidos teicoicos (O ácido teicóico é um polímero de ribitol quimicamente modificado) a) Facilitar a ligação e a regulação da entrada e saída de cátions na célula b) Regular a atividade da autolisina durante o processo da divisão celular c) Constituir sítios receptores de fagos d) Servir de sítio de ligação com o epitélio do hospedeiro 2) COMPONENTES CARACTERISTICOS DA PAREDE CELULAR DAS BACTÉRIAS GRAM NEGATIVAS Peptidioglicanos – composição é a mesma da Gram positiva, porém mais fina O espaço que separa a membrana citoplasmática da membrana externa é chamado de espaço periplasmático O peptídioglicano liga-se à membrana externa por uma lipoproteína e está embebido no gel periplasmático que contém alta concentração de enzimas degradadoras de proteínas de transporte Devido a menor concentração de peptídioglicano, a parede das bactérias Gram-negativas é mais suscetível a quebras quando comparada com a das Gram-positivas. Ácido teicóicos NÃO estão presentes nas bactérias Gram-negativas MEMBRANA EXTERNA: Dupla camada lipídica. Possui uma camada interna composta basicamente de fosfolipídios e uma externa contendo lipopolissacarídeos e proteínas. Possui um interior hidrofóbico devido aos ácidos graxos LPS – lipopolissacarídeos constituído por um lipídio complexo (lipídio A), ao qual está ligado um polissacarídeo chamado de antígeno O. A cadeia lateral desse polissacarídeo varia de espécie para espécie e por isso são responsáveis pela característica antigênica em bactérias Gram-negativas; O LPS é chamado também de endotoxina, pois é tóxico. PROTEÍNAS: - PORINAS formam poros que propiciam a passagem passiva de solutos; inespecífica, é regulada pelo tamanho da subst. - PROTEÍNAS DA MEMBRANA EXTERNA também envolvidas no transporte de solutos e funcionam como receptores de fímbria sexual e de fagos - LIPOPROTEÍNAS função estrutural Forte carga positiva (proveniente dos polissacarídeos) constitui fator importante na evasão dessas bactérias à ação das células fagocitárias e ao complemento durante a invasão de um hospedeiro. Barreira adicional à entrada de substâncias antibióticos, lisozima, detergentes, metais pesados, sais de bile, enzimas digestivas e alguns corantes. Confere uma barreira hidrofóbica adicional dificultando a penetração de algumas substâncias OBS**PAREDE CELULAR Fração Lipopolissacarídica ESPAÇO PERIPLASMÁTICO Compreendido entre as membrana externa e plasmática Além de peptídioglicano, contém uma série de enzimas e proteínas: o Enzimas hidrolíticas (proteases, nucleases, lipases) quebra de macromoléculas, às quais a membrana citoplasmática é impermeável, produzindo moléculas menores que podem ser transportadas o Enzimas capazes de inativar drogas (ex: beta-lactamase inativa a penicilina) o Proteínas transportadoras de soluto - FUNÇÕES DA PAREDE CELULAR: 1. Proteção 2. Manutenção da forma (pressão osmótica interna geralmente de 15-20 atmosferas). 3. Divisão celular/septo (primer). - PROTOPLASTOS: remoção da parede celular de bactérias Gram-positivas (lisozima ou penicilina). Formas esféricas. - ESFEROPLASTOS: remoção da parede celular de bactérias Gram-negativas (penicilina). Formas esféricas que conservam a membrana externa. BACTERIAS COM PAREDE DE COMPOSIÇÃO QUÍMICA DIFERENTE OU SEM PAREDE. ARQUEOBACTÉRIAS: sem peptideoglicanos típicos (algumas com paredes compostas exclusiva-mente por N- acetilglicosamina ou proteínas). MICOPLASMAS: sem parede (citoplasma limitado por bicamada fosfolipídica mais proteínas). FORMAS L: sem parede, obtidas em estudos de laboratório. Estáveis ou instáveis. ESTRUTURAS BACTERIANAS E SUAS FUNÇÕES − Cápsula CÁPSULA Ligada a parede, extensão limitada e estrutura definida. CAMADA MUCOSA Massa amorfa mais dispersa parcialmente desligada da célula. CAMADA “S” Composta por proteínas ou glicoproteínas ligadas à parede, encontrada nas arqueobactérias; reservatório de água e nutrientes; aumento da capacidade invasiva de bactérias patogênicas; aderência; aumento da resistência microbiana a biocidas; (sustentação?). ESTRUTURAS INTERNAS À PAREDE CELULAR MESOSSOMOS Septal: associado a divisão do DNA e participa da formação das paredes transversais. Lateral: concentrar enzimas envolvidas no transporte de elétrons, conferindo a célula maior atividade respiratória ou fotossintética. MATERIAL GENÉTICO E PLASMÍDEO Nucleóide Nucleóide procarioto ou DNA bacteriano Ausência de uma membrana nuclear e de um aparelho mitótico Fibrilas de DNA de dupla hélice na forma de uma única molécula Plasmídeo: Fragmentos de DNA circular, fita dupla, autoduplicativos independentes da replicação cromossômica, mobilizam-se entre bactérias pelo pili F. Os genes não determinam características essenciais, porém muitas vezes confere vantagens seletivas às células que o possuem. EX: plasmídeos R (fator R) fatores de resistência às drogas. Fator F fatores sexuais Importantes na conjugação COMPONENTES CITOPLASMÁTICOS RIBOSSOMOS Local responsável pela síntese proteica ESPORO Esporogênese (endósporo) Estruturas formadas por algumas espécies de bactérias Gram-positivas: Bacillus spp. e Clostridium spp; quando o meio se torna carente de água ou nutrientes essenciais. Tipo de diferenciação celular que ocorre como resposta a uma situação desfavorável do meio ambiente. Na esta de pré-esporo desidratado, encontra-se muito ácido dipocolínico e cálcio não permite a morte pela fervura Após completar a esporogênese, o esporo é liberado no meio ambiente onde pode sobreviver por muitos anos Pequenas proteínas, ácidos solúveis (PPASs) Resistencia: temperatura; produtos químicos NUTRIÇÃO E METABOLISMO BACTERIANO Basicamente a necessidade nutritiva dos microrganismos são as mesmas de todos os seres vivos que, para renovarem seu protoplasma e exercerem suas atividades, exigem fontes de energia e fontes de materiais plástico (i.e., C, H, O, N, S e P). Nos seres superiores dois tipos nutritivos. FONTES DE ENERGIA Algas e algumas bactérias são fotossintéticas (litotróficas ou organotróficas). A grande maioria das bactérias é quimiotrófica (litotróficas, e.g., Thiobacillus; ou organotróficas – bactérias de interesse médico). Bacterioclorofila é o pigmento fotossintético. Não há produção de oxigênio, pois a água não é utilizada como fonte de elétrons. FONTES DE CARBONO Autotróficas: única fonte de carbono é o gás carbônico (CO2) ou o íon bicarbonato. Heterotróficas: exigem fontes orgânicas de carbono, por exemplo, carboidratos (D-glicose), aminoácidos, ácidos monocarboxílicos, lipídios, álcoois e mesmo polímeros (amido, celulose). FONTES DE NITROGÊNIO Algumas bactérias retiram diretamente da atmosfera e o convertem a nitrogênio orgânico Fixação A maioria utiliza compostos inorgânicos de nitrogênio ÍONS INORGÂNICOS ESSENCIAIS MACRONUTRIENTES: Fósforo (PO4: energia e síntese de ácidos nucleicos) Enxofre (cistina, cisteína, vitaminas: biotina e tiamina). Potássio (ativa enzimas e regula a pressão osmótica). Magnésio (ativador de enzimas extracelulares, síntese de proteínas, união das frações ribossômicas). Ferro (citocromos e de pigmentos). ÍONS INORGÂNICOS ESSENCIAIS MICRONUTRIENTES: Cobre. Cobalto. Zinco. Manganês. Molibdênio. Sódio e muitos outros. OXIGÊNIO ATMOSFÉRICO Aeróbias (exigem O2 livre). Microaerófilas (exigem leve tensão de O2 livre). Anaeróbias estritas (não toleram O2 livre). Anaeróbias não-estritas* (não usam o O2 atmosférico mas este não é tóxico). Facultativas (com ou sem O2 livre). Como a água o oxigênio atmosférico não é um nutriente e funciona apenas como receptor final de hidrogênio nos processos de respiração aeróbia. Entram na célula FATORES DE CRESCIMENTO São os compostos orgânicos indispensáveis a um determinado microrganismo, mas que ele não consegue sintetizar (devem estar presentes no meio para que o microrganismo possa crescer). Exemplos: vitaminas (e.g., complexo B), amino-ácidos, nucleotídeos e ácidos graxos. Nota: Dentro de certos limites, o crescimento será proporcional ao teor do composto limitante. Isto permite a elaboração de um método de dosagem de certos compostos como vitaminas e aminoácidos. Este é o fundamento da “dosagem microbiológica”. ÁGUA Não constitui nutriente, mas é indispensável para o crescimento. A água é o solvente universal. Nutrientes em solução para nutrição da bactéria (passagem pela membrana). Regulação da pressão osmótica. Regulação térmica (pelo elevado calor específico). Bactérias morrem rapidamente pela dessecação (exceto as bactérias esporuladas). MEIOS DE CULTURA Cultivo artificial das bactérias. Não existe um meio universal. Meio sintético e complexo Meio líquido, sólido e solidificado. Meio seletivo e diferencial - COMPOSIÇÃO DOS MEIOS DE CULTURA: Meios sintéticos São aqueles cuja composição química é qualitativa e quantitativamente conhecidas Meios complexos Se quisermos cultivar microrganismos mais exigentes no meio, podemos enriquecê-lo com substancias capazes de fornecer uma variedade grande de aminoácidos e vitaminas, como por exemplo, extrato de carne. Nesse momento o meio passou a ser complexo Contém produtos cuja composição química não é perfeitamente definida Estados físicos dos meios de cultura Líquido: soluções aquosas de nutrientes geralmente as bactérias tem maior facilidade de iniciar seu crescimento nesse meio Fluido ou semi-sólido Sólido cada bactéria será separada de sua vizinha, multiplicando-se, formará uma colônia de organismos iguais a ela, visóvel macroscopicamente e facilmente transferível para novo meio onde crescerão em culturas puras. O agente solidificador mais usado é o ágar polissacarídeos extraídos de algas Meio seletivo São aqueles cujas características impedem o crescimento de certos microrganismos, permitindo apenas o crescimento de outros.Meios diferenciais São aqueles que conferem características especiais às colônias que, em condições normais, seriam idênticas DEFINIÇÕES: Cultura: população microbiana em crescimento ativo em um meio nutritivo. Cultura pura única espécie (na prática cultura axênica?). Meio de cultura: usado para o cultivo artificial dos microrganismos. OUTROS FATORES ENVOLVIDOS NA NUTRIÇÃO Temperatura: psicrófilas (0-18ºC); mesófilas (20-40ºC); termófilas (50-80ºC). pH: em torno de 7,0, para a maioria. Ácido – helicobacter pilor; Básico – Vibrio holerae Enzimas: extracelulares (quebra de macromoléculas, inativação de antibióticos). Conservação de bactérias: ágar estoque (4-8 ºC), nitrogênio líquido (-179ºC), liofilização; CRESCIMENTO DA BACTÉRIA O crescimento é um somatório dos processos metabólicos progressivos, que normalmente conduz a divisão (reprodução) com concomitante produção de duas células-filhas a partir de uma. FATORES RELACIONADOS AO CRESCIMENTO DE MICRORGANISMOS NOS MEIOS DE CULTURA 1. Disponibilidade de nutrientes (fonte energia) 2. Necessidade ou não de aeração. 3. Necessidade de certo grau de umidade. 4. Manutenção de pH apropriado. 5. Incubação em temperatura adequada. 6. O meio de cultivo deve estar estéril para uso. 7. Uso de técnicas assépticas. AERAÇÃO: oxigênio (mecanismo de escape) Anaeróbicas estritas possuem enzimas que catalisam a conversão do oxigênio, essa conversão é total. CONSIDERAÇÕES GERAIS Célula mãe alongamento da célula invaginação da parede celular e migração do material nuclear formação da parede celular transversa e distribuição organizada do material celular para as duas células filhas separação das duas células cada célula repete o processo MÉTODOS DE MEDIDAS O desenvolvimento de uma cultura bacteriana pode ser medido tanto por um aumento na quantidade de protoplasma, quanto pelo número de organismos. - Métodos diretos: a. Centrifugação um volume de cultura centrifugado e a altura do sedimento é uma medida da massa protoplasmática. Se o tamanho do microrganismo for conhecido, o número destes deve ser calculado b. Peso seco determina-se o peso seco de organismos por unidade de volume de cultura. Ignora o conteúdo aquoso e sua variação durante o crescimento do microrganismo. - Métodos indiretos a. Nitrogênio as células são lavadas a fim de retirar os constituindo nitrogenados do meio. b. Estimativas calorimétricas ou espectrofotométricas de constituintes do protoplasma c. Medidas de consumo de um metabólito ou acúmulo de um produto do metabolismo d. Turbidimetria e. Consumo de um composto pela massa bacteriana MÉTODOS DIRETOS DE CONTAGEM DE PARTÍCULAS a. Contadores de partículas b. Câmaras de contagem c. Esfregaços corados MÉTODOS INDIRETOS DE CONTAGEM DE PARTÍCULAS a. Diluição seriada ou do número mais provável b. Plaqueamento em meio sólido CURVA DE CRESCIMENTO Os estudos de crescimento são feitos essencialmente em meios líquidos e as considerações que seguem são válidas para estas condições. A curva de crescimento pode ser arbitrariamente dividida em 4 fases: 1) Fase de lag, durante a qual praticamente não ocorre divisão celular, mas há aumento de massa 2) Fase logarítmica, na qual ocorre divisão regular numa velocidade máxima e constante 3) Fase estacionária, durante a qual a velocidade de multiplicação diminui gradualmente até que se anule. Durante essa fase o número de bactérias novas que surgem se contrabalança com o número daquelas que estão morrendo. A falta de nutrientes e o acúmulo de materiais tóxicos no meio podem cessar o crescimento de uma cultura 4) Fase de declínio, em que os microrganismos gradualmente diminuem em número até que a cultura se torne estéril, ou seja, todos os microrganismos morrem. TEMPERATURA DE INCUBAÇÃO Os diferentes microrganismos apresentam diferentes ótimos de temperatura, conforme seu hábitat natural. Assim, obedecida essa temperatura ideal, o tempo de geração será menor. NATUREZA DO MEIO Em geral, o desenvolvimento bacteriano é mais eficiente em meios complexos do que em meios quimicamente definidos. Contribuição do meio para a velocidade de crescimento concentração e presença de todos os nutrientes essenciais. AERAÇÃO DO MEIO A influência da presença ou não de O2 no meio depende diretamente das vias pelas quais os microrganismos obtêm energia. CONCENTRAÇÕES DE ÍONS HIDROGÊNIO O pH é um fator muito importante para a atividade enzimática. De maneira geral, o pH neutro é requerido para o melhor desenvolvimento da cultura em termos de velocidade. NATUREZA DO ORGANISMO Dependendo das características metabólicas do microrganismo, seu tempo de geração será maior ou menor. A fase logarítmica termina quando as condições do meio de cultura se alteram pela atividade metabólica das bactérias, que não mais provê as condições necessárias para manter o crescimento uniforme. CRESCIMENTO CONTÍNUO Sistema de células em crescimento no qual os nutrientes são adicionados continuamente e o volume do frasco permanece constante pela retirada simultânea do meio já utilizado. GENÉTICA BACTERIANA DNA tem formato de uma dupla fita circular, altamente empacotado e dobrado para se manter dentro da célula PLASMÍDEOS Fragmentos de DNA fita dupla auto-replicativos que se mobilizam entre bactérias pelo pili F EX: plasmídeo R – resistência a drogas Moléculas extracromossomais circulares de DNA. São geralmente moléculas de DNA de fita dupla que se replica separadamente ou junto com a célula hospedeira. Não são indispensável para as células, mas podem conferir-lhe vantagens seletivas: por exemplo, possuem informação para a degradação de certos substratos, resistência a um antibiótico ou a um metal pesado. Plasmídeo chamado de fator sexual, fator de fertilidade ou fator F apresenta capacidade de ser transferido a uma célula hospedeira durante um processo chamado de conjugação. Replicação do plasmídeo pode ocorrer em dois momentos: Quando a célula se divide o DNA plasmidial também se divide No processo de conjugação - Tipos de plasmídeos: a. Plasmídeo de tipo sexual importantes para a transferência de plasmídeos a uma célula receptora. Podem integrar-se no cromossomo (torna possível a mobilização do cromossomo durante a conjugação) ou permanecer independente do mesmo b. Plasmídeo R fatores de resistência. Contêm a informação para síntese de enzimas que inativam antibióticos específicos conferindo a resistência à antibióticos. Apresentam dois componentes: o determinante de resistência R e o fator de transferência de resistência, sendo que o último contêm informações para a formação do pilus, um requerimento para transferência de DNA por conjugação em bactérias Gram-negativas. c. Plasmídeo Col plasmídeos de E. coli capazes de produzir colicinas d. Plasmídeos virulentos transportam informações que favorecem a virulência durante o processo de infecção em mamíferos TRANSPOSONS Elementos reguladores que se deslocam de um sítio a outro no genoma e afetam a expressão gênica. Segmentos móveis de DNA que são movimentados em baixa frequência dentro do cromossomo. Por ser o cromossomo uma molécula contínua de DNA, a transposição de elementos móveis é um processo de intercâmbio de DNA, um tipo de recombinação. Os transposons estão frequentemente localizados dentro de um gene particular, gerando mutação neste Os genes de resistência presente nos transposons são usualmente diferentes daqueles produzidos por mutação no cromossomo Existem basicamente dois tipos de transposons: Classe I Classe II Podem ser usados como ferramenta para clonagem. Os genes desejadossão introduzidos, clonados em um plasmídeo e este finalmente é introduzido em células bacterianas Existem transposons que são capazes de se transferir de uma célula para outra sem o auxílio de plasmídeos, num processo em que é necessário um contato direto entre a célula doadora e a receptora transposon conjugativo. Importante da disseminação da resistência múltipla de antibióticos - Significado médico Existem transposons frequentemente encontrados em bactérias dos humanos, estes estão ligados a plasmídeos, que são os grandes responsáveis pela resistência bacteriana aos antimicrobianos O mais bem conhecido transposon que ocorre no homem é o HIV, um retroelemento que se dissemina horizontalmente como um vírus. Transposons bacterianos são responsáveis pela disseminação de genes responsáveis pela resistência bacteriana a antibióticos e quimioterápicos de um genoma bacteriano a outro, via plasmídeo. Nova classe de transposon integrons. Muito dos genes resistentes a antibióticos encontrados em bactérias Gram- negativas são contidos em cassetes de genes, vários dos quais integrados numa específica posição de um integron INTEGRONS E A ORGANIZAÇÃO DE TRANSPOSONS Integron É uma estrutura genética que inclui determinantes de um sistema de recombinação sitio-específica capaz de capturar e mobilizar genes contidos em elementos móveis denominados cassetes de genes. Existem teorias que descrevem o integron como um novo tipo de transposon Cassete de genes são elementos móveis de DNA que contém um sítio específico de recombinação. Integrons são pequenos sistemas genéticos modulares móveis envolvidos na aquisição e disseminação de genes da resistência aos antibióticos entre bactérias Gram-negativas, particularmente, entre as enterobactérias. Constituídos por dois segmentos de DNA conservados, que ladeiam uma região central na qual cassetes móveis de genes que codificam funções de resistência aos antibióticos foram inseridos nele. Integrase responsável pela inserção de genes de resistência aos antibióticos que se localizam a jusante do promotor RESUMINDO: um integron é uma estrutura genética que inclui os determinantes de um sistema de recombinação sítio- específica capaz de capturar e mobilizar genes contidos em elementos genéticos móveis denominados cassetes de genes. Componentes essenciais: gene int, localizado no segmento 5’ que codifica uma recombinase sítio-específica: a integrase, um sítio adjacente, att, localizado na extremidade do segmento conservado 5’, que é reconhecido pela integrase, para a integração de cassetes de genes de resistência e um promotor orientado para expressão do cassete de genes INTEGRASE A integrasse pode integrar ou inserir cassetes de genes por um sistema sítio-específico de recombinação A mobilidade dos cassetes de genes resulta em um sistema muito eficiente de disseminação de genes da resistência MUTAÇÃO Alterações da estrutura química ou física do DNA. Ocasionada por agente físico ou químico conhecido como mutágenos ou agentes genotóxicos Organismos não expostos a ação de mutágenos selvagem; organismos expostos mutantes De acordo com o agente as mutações podem ser: Espontâneas podem ser causadas por erros durante a replicação do DNA ou pela exposição do organismo a influências extracelulares do meio ambiente, como radiação ou agentes químicos. Eventos raros Induzidas produto de uma ação deliberada no qual o organismo é exposto à ação de um agente genotóxico Pontos quentes regiões do DNA mais sensíveis à aparição de um evento mutacional SISTEMAS DE REPARO DO DNA Quando a célula é submetida à ação de agentes genotóxicos, as proteínas que intervêm na reparação do DNA são sintetizadas. Dois sistemas são conhecidos: Resposta SOS Resposta adaptativa RECOMBINAÇÃO, TRANSFERÊNCIA GÊNICA E DNA RECOMBINANTE Enquanto a mutação assegura a variabilidade, a recombinação genética garante que diferentes combinações de genes sejam possíveis Mecanismos de recombinação transformação, transdução e conjugação - TRANSFORMAÇÃO Processo no qual o DNA livre no meio é tomado pela célula, resultando em alterações genotípicas desta Célula precisa encontrar-se no estado de competência. Quando ela atinge esse estado, libera-se um fator de competência, que induzirá ao estado competente células que ainda não estão. Proteína autolisina expõe à membrana as proteínas-de-união de DNA e endonucleases. O DNA é cortado em fragmentos. Uma exonuclease cliva as duas fitas, para que somente uma entre na célula Fita de DNA + proteínas = complexo eclipse. Esse complexo será transportado através da membrana citoplasmática, onde a fita simples do DNA se une à homóloga da receptora. Ocorre em bactérias Gram-positivas e Gram-negativas - TRANSDUÇÃO É o processo no qual o DNA bacteriano é transferido entre células mediado por um vírus 1. Transdução generalizada qualquer gene pode ser transduzido. O vírus leva basicamente DNA bacteriano. O vírus contendo o DNA bacteriano consegue infectar outras células, mas não produz sua lise, devido basicamente à carência de DNA viral. Por recombinação, o DNA de dupla fita permuta informação com o DNA receptor 2. Transdução especializada transferência de genes bacterianos específicos, que estão localizadas próximo ao sítio de integração viral. - CONJUGAÇÃO Mecanismo de transferência de informação genética que requer contato entre as células Este intercâmbio implica transferência de molécula de DNA extracromossômica, um plasmídeo. 4 estágios: 1. Formação de uma união específica doador-receptor 2. Preparação para a transferência do DNA (mobilização) 3. Transferência do DNA 4. Formação de um plasmídeo funcional replicativo no receptor DNA RECOMBINANTE CONTROLE DOS MICRORGANISMOS MECANISMOS FÍSICOS DE CONTROLE CALOR Os microrganismos morrem por desnaturação das proteínas na presença de calor úmido e por oxidação, quando se trata de calor seco, e há variações de resistência de organismo para organismo: o Ponto de morte térmica temperatura mais baixa capaz de matar todos os microrganismos de uma dada espécie, em suspensão, em 10 min. o Tempo de morte térmica menor tempo capaz de matar todos os microrganismos, numa suspensão, numa dada temperatura o Tempo de redução decimal tempo expresso em minutos, no qual 90% da população são mortos, numa dada temperatura. Quando a população bacteriana é aquecida, a redução do número de formas viáveis ocorre de forma exponencial EX: população viável de 1 milhão –após 1min 100 mil viáveis –após 1 min 10 mil indivíduos vivos, e assim sucessivamente até os 6min quando teremos a probabilidade de não mais encontrar indivíduos vivos. A partir desse momento (6min), prosseguindo as contagens, minuto a minuto, o que detectaremos é somente uma probabilidade, cada vez menor, de encontrar microrganismos vivos Do ponto de vista prático o material será considerado estéril quando trabalharmos na faixa de probabilidade de 1x10 -6 Ou seja, submetendo-se o material ao processo de esterilização após 12 minutos naquela temperatura, a probabilidade de encontrar um organismo vivo é de um para um milhão (iniciando com 1 milhão viável) 1. Calor Úmido Fervura é um dos métodos mais frequente utilizado para eliminação de microrganismos. Mata todas as formas vegetativas dos patógenos, mata vírus, fungos e seus esporos em até 15 min. Alguns endósporos bacterianos e alguns vírus, entretanto, não são destruídos tão rapidamente A fervura não é um método de esterilização, mas sendo submetida a uma fervura de 15min a maioria dospatógenos será morta Esterilização empregando calor úmido requer temperaturas acima de fervura da água conseguidas na autoclave Quanto maior a pressão no interior da autoclave, maior a temperatura atingida. Pasteurização Aquecer o produto a uma dada temperatura, num dado tempo, e a seguir resfriar bruscamente. A pasteurização, por qualquer que seja o tempo e a temperatura empregados, reduz o número de microrganismos presentes, mas não assegura uma esterilização 2. Calor seco Forma mais simples de esterilizar utilizando calor seco, é a flambagem A incineração também é uma forma de esterilizar, utilizando calor seco. Outra forma seria a utilização de fornos, e neste o binômio tempo e temperatura deve ser observado atentamente. RADIAÇÕES Têm seus efeitos dependentes do comprimento de onda, da intensidade, da duração e da distância da fonte. Dois tipos ionizantes e não-ionizantes Desvantagem baixo poder de penetração, efeitos deletérios sobre a pele e órgãos. MICROONDAS As radiações emitidas não afetam diretamente os microrganismos, mas geram calor (calor é responsável pela morte de microrganismos) INDICADORES BIOLÓGICOS Suspensões-padrão de esporos bacterianos submetidos a esterilização juntamente com os materiais a serem processados em autoclaves, estufas e câmaras de radiação Depois de terminado o ciclo de esterilização, os indicadores são colocados em meios de cultura adequados para o desenvolvimento destes esporos e, se não houver crescimento, significa que o processo de esterilização está validado. FILTRAÇÃO A passagem de solutos ou gases através de filtros, de poros suficientemente pequenos que retêm microrganismos, pode ser empregada na remoção de bactérias e fungos deixando, entretanto, passar a maior parte dos vírus PRESSÃO OSMÓTICA A alta concentração de sais ou açúcares cria um ambiente hipertônico que provoca a saída de água do interior da célula microbiana, condensando o citoplasma e retraindo a membrana Microrganismos deixam, então, de crescer e isto tem permitido a conservação de alimentos, evitando a deterioração causada por bactérias e bolores. DESSECAÇÃO Na ausência total de água, os microrganismos não são capazes de crescer, multiplicar, embora possam permanecer viáveis por vários anos. Quando a água é novamente reposta, os microrganismos adquirem novamente a capacidade de crescimento MICROBIOTA HUMANA CONCEITO Microbiota do corpo humano é a população microbiana associada que reveste as superfícies internas e externas do corpo humano. Constituída por bactérias, fungos e protozoários Entende-se por microbiota do organismo a presença de microrganismos que estabelecem residência permanente ou não, sem causar infecções ou nenhum outro dano ao hospedeiro em situações normais; A formação da flora normal ou microbiota tem início no momento do nascimento, pois, ao passar pelo canal do parto, recebe-se os primeiros componentes da microbiota. Microbiota normal ou residente (estável, fixa, coloniza e geralmente “não patogênica”). Microbiota transitória (instável, frouxa, não coloniza e pode ser “patogênica”). No corpo humano a microbiota se distribui pelas partes do corpo que estão em contato com o meio externo como pele e mucosas; A colonização dessas regiões do organismo não ocorre de maneira homogênea, sendo que cada sítio possui uma microbiota com características próprias; A microbiota pode ser dividida em: o Transitória/alóctone: compreende microrganismo que permanecem pouco tempo no organismo, sem estabelecer uma colonização significativa; o Residente/autóctone: compreende organismos que colonizam o hospedeiro de modo simbiótico, por um período de tempo indeterminado, em situações normais; A microbiota natural protege o hospedeiro da contaminação de microrganismos patogênicos (através da competição por nutrientes, diferenças de pH e disponibilidade de oxigênio); Qualquer alteração na microbiota pode causar a colonização ou multiplicação de microrganismos patogênicos; FUNÇÕES DA MICROBIOTA Modulação do sistema imune Resistência à infecção por patógenos exógenos (diretos e indiretos) Absorção de nutrientes e degradação de componentes tóxicos Produzem substâncias que são utilizadas pelo hospedeiro (vitamina K, biotina, riboflavina). PELE Microbiota cutânea se distribui por toda a extensão da pele, e é mais concentrada, entretanto, nas áreas mais úmidas e quentes (axilas, períneo) Predominam bactérias Staphylococcus, Corynebacterium e Propioniobacterium Epiderme (superfície) não favorece o crescimento de microrganismos – descamação e desidratação periódica; Microrganismos estão mais associados às glândulas apócrinas (sudoríparas – infância inativa; puberdade funcional); Folículo piloso – habitat ideal; Secreção das glândulas – rica ureia, aminoácidos, sais, ácido láctico e lipídeos. A Propioniobacterium acnes é encontrada em associação com a atividade secretora das glândulas sebáceas e, por essa razão, não é encontrada na pele de crianças com menos de 10 anos A maioria das bactérias da pele reside na superfície do estrato córneo e na parte superior dos folículos pilosos Bactérias que residem profundamente tem por função recolonizar a pele quando as bactérias mais superficiais são removidas (ex: após lavagem cuidadosa) CAVIDADE ORAL E VIAS AÉREAS Microbiota da cavidade bucal Straphylococcus, Treponema, Mycoplasma e outros Microbiota das fossas nasais Straphylococcus e Corynebacterium Indivíduos que tomam antibióticos β-lactâmicos costumam estar colonizados por espécies de bactérias tais como Klebsiella pneumoniae, Escherichia coli etc. O aparecimento dessas bactérias está relacionado com a supressão ou redução da microbiota normal da região A cárie dentária, as doenças periodontais, actinomicoses e endocardites subagudas são todas doenças causadas por membros da microbiota da cavidade oral Na faringe e traqueia encontra-se Streptococcus alfa-hemolíticos e não-hemolíticos, Neisseria, Staphylococcus difteroides, Haemophilus e Mycoplasma. Os bronquíolos e alvéolos são normalmente estéreis; O esôfago não possui microbiota própria; VAGINA Microbiota vaginal varia com a idade, pH e secreção hormonal. No primeiro mês de vida, e no período compreendido entre a puberdade e a menopausa, há predomínio de Lactobacillus sp. A variação da microbiota vaginal acompanha a variação do pH vaginal. A variação do pH, por sua vez, está relacionada com a quantidade de glicogênio na vagina. A fermentação desse polímero pelos lactobacilos abaixa o pH URETRA ANTERIOR Pobremente colonizada (Staphylococcus epidermidis, Corynebacterium spp., Enterococcus faecalis e, às vezes, Escherichia coli) TRATO GASTROINTESTINAL Bebês Maior variedade de gêneros e espécies bacteriana, mas não necessariamente quantidade. A flora adquire características estáveis em torno dos dois anos de idade. Adulto Menor variedade (prevalência dos filos Bacteroidetes e Firmicutes ↑ 90%), maior quantidade de células – maior estabilidade. Permanece mais ou menos a mesma durante a vida adulta. Idosos Menor variedade do que a microbiota do adulto com prevalência de determinado gênero como Clostridium. As basctérias da flora intestinal são encontradas no intestino delgado e grosso, e esse é o mais densamente colonizado. Flora sofre algumas modificações na velhice. Delgado proximal as espécies mais representadas são estafilococos, estreptococos e lactobacilos. Raramente são encontrados bactérias anaeróbicas. Íleo distal a flora torna-semuito mias diversificada, uma vez que passa a abranger coliformes e várias espécies de bactérias anaeróbicas 0Intestino grosso aumento drástico na concentração de bactérias. As do tipo anaeróbica passam a superar as demais Calcula-se que a flora intestinal compreenda em torno de 500 espécies pertencentes a 200 gêneros, mas desses somente em torno de 20 são representados de maneira significativa A flora intestinal se apresenta, além da distribuição vertical, em uma distribuição horizontal. Alguns membros da flora vivem livremente na luz intestinal e outros são associados a camada de muco ou ao epitélio. Estômago várias espécies de bactérias são encontradas nesse órgão, principalmente cocos Gram-positivos, mais tolerantes a acidez gástrica. Pacientes portadores de gastrite e ulcera gástrica podem ter o estômago colonizado por um bacilo Gram-negativo espiralado, posteriormente denominado Helicobacter pylori. Por ser encontrado em casos de carcinoma gástricos e em Uma boa parte da população de forma assintomática, então, foi sugerido que o H. pylori fosse considerado membro da flora normal do estômago - FATORES QUE CONTRIBUEM PARA O CONTROLE DA FLORA INTESTINAL Acidez gástrica responsável pelo pequeno número de bactérias no ID proximal. Somente sobrevivem os cocos e bacilos Gram-positivos mais tolerantes a acidez. Lactobacilos produzem diferentes substâncias que inibem o crescimento de outros membros da flora Bactérias facultativas, através do consumo de oxigênio, criam condições de anaerobiose, que favorece o crescimento de bactérias anaeróbicas Subprodutos do metabolismo ajudam a criar um ambiente intraluminar restritivo ao crescimento bacteriano Fenômeno quórum-sensing controle da expressão gênica em resposta a densidade celular. Processo utilizado por bactérias Gram-negativas e Gram-positivas para regular uma variedade de funções fisiológicas PROBIÓTICOS Microrganismos vivos que, ingeridos em determinadas quantidades, exercem efeitos benéficos, além dos relacionados aos efeitos nutritivos em geral. Microrganismos vivos capazes de promover o equilíbrio da flora intestinal, exercendo efeitos benéficos para a saúde do homem. VÍRUS Agente infeccioso constituído basicamente de um tipo de ácido nucleico (DNA ou RNA) e proteínas, parasitas intracelulares obrigatório cuja replicação se dá exclusivamente à custas de processos anabólicos da célula hospedeira DEFINIÇÕES Viróides partículas de RNA, de forma circular, destituídas de proteína, sem nenhuma forma de capsídeo, até o momento encontrado somente em plantas. Causa doença na batata. Virusóides agente infeccioso constituído de RNA de fita simples, cuja replicação depende de um vírus auxiliar e seu genoma está encapsidado em uma estrutura proteica codificada pelo vírus auxiliar. Prions pequenas partículas infecciosas de natureza proteica. Constituídos provavelmente de apenas um tipo de proteína. Estas pequenas proteínas podem existir em duas formas: a forma normal (Pn) e a forma infecciosa (Pd) que causa a doença. Uma infecção acontece quando algumas proteínas infecciosas (Pd) chegam ao cérebro e contactam com as proteínas normais. As proteínas infecciosas (Pd) têm a capacidade de fazer as proteínas na forma normal mudar de forma, transformando-as de Pn em Pd Vírion ou partícula viral forma extracelular submicroscópica do vírus OBS: viróides e prions são agentes infecciosos que apresentam algumas características gerais de vírus, mas por outro lado são estruturalmente mais simples. COMPOSIÇÃO Consiste basicamente em um ácido nucleico, DNA ou RNA (ambos podem ser encontrados em forma de fita simples ou dupla, linear ou circular), envolvido por uma capa proteica, denominada capsídeo ou cápside e, em alguns casos, de uma membrana lipoproteica, denominado envelope ou envoltório Devido a sua simplicidade, os vírus são conhecidos como parasitas intracelulares obrigatórios, pois depende da maquinaria da célula hospedeira para sua reprodução ENZIMAS Os vírus não realizam processos metabólicos, e, em geral, são inertes fora da célula. Entretanto, algumas partículas virais contêm enzimas que tem grande importância no processo infeccioso. EX: retrovírus carrega na partícula viral a transcriptase reversa, necessária para sua replicação. Em alguns outros vírus, há enzimas necessárias para ajudar a entrada na célula. EX: bacteriófagos enzima lisozima ESTRUTURA DA PARTÍCULA VIRAL Os vírus podem ser classificados, de acordo com a simetria do cápside, em: 1. Virions icosaédricos 2. Virions helicoidais 3. Virions de estrutura complexa vírus que não podem ser classificados como icosaédricos ou helicoidais REPLICAÇÃO VIRAL O processo de infecção viral com ciclo lítico, ou infecção produtiva, pode ser dividido, didaticamente, em cinco fases: 1) ADSORÇÃO Termo que descreve o contato inicial célula-vírus. Essa adsorção é de início fraca, progredindo para uma ligação mais forte, quando a adsorção se torna irreversível. Processo influenciado pelo pH e pela composição salina do meio. Os Virions colidem ao acaso com sítios na superfície celular e aproximadamente um em cada 10³ colisões leva à união complementar entre um sítio da célula (receptor) e uma proteína viral (anti-receptor) 2) PENETRAÇÃO Após a ligação irreversível do vírus à superfície da célula susceptível, o próximo passo da infecção leva à entrada na célula de parte ou de todo o virion e na liberação do material genômico viral - 4 mecanismos básicos pelos quais os vírus podem penetrar nas células: a. Injeção do ácido nucleico bacteriófagos desenvolvem mecanismos pelos quais conseguem injetar seu ácido nucleico através da barreira da parede celular da bactéria, bem como da membrana citoplasmática contígua. Outros vírus, interagem resíduos com a membrana, fazendo com que apareçam poros na membrana, no qual o RNA viral é introduzido no citoplasma da célula. b. Endocitose endocitose mediada por receptor. Os vírus após sua ligação ao receptor, são englobados pela membrana plasmática, ficando no interior de vesículas nas células. c. Fusão do envelope viral ocorre para vírus envelopados. d. Translocação partícula viral é inteira translocada através da membrana citoplasmática DESNUDAÇÃO Termo geral que descreve a remoção total ou parcial do cápside viral, ocorre logo após a penetração. A maioria dos vírus de RNA é replicada no citoplasma da célula hospedeira. A maioria dos vírus de DNA e alguns de RNA, como os retrovírus, devem ter acesso ao núcleo para que a replicação continue. 3) SÍNTESE DOS COMPONENTES VIRAIS A essência desse tipo de multiplicação viral é dupla: replicação do ácido nucleico viral e produção de cápsides para conter esses ácidos nucleicos. - Arranjos preliminares Podem envolver mudanças no vírus, como remoção da cápside proteica e a síntese de novas enzimas ou alteração de outras. Em qualquer um dos casos, existe um período, imediatamente após a adsorção, em que não há aumento do número de partículas virais infecciosas período de latência ou eclipse Duas importantes funções do genoma viral: Transcrição do ácido nucleico para a formação de RNA mensageiro, que em seguida é traduzido para síntese de proteínas Replicação desse genoma viral de forma a sintetizar novos genomas, que são então incorporados a progênie viral - Transcrição do genoma viral - Tradução ácidos nucleicos virais são poligênicos, isto é, codificam para muitas proteínas - Replicação 4) MATURAÇÃO Após terem sidos sintetizados, as proteínas e o ácido nucleico viral tem de ser unidos para formar partículas virais maduras. Pode ser um processo espontâneo5) LIBERAÇÃO Existem limites para a quantidade de vírus que pode ser acumulada em uma célula infectada. Os vírus devem disseminar-se de uma célula para outra. Alguns vírus são liberados por lise da célula hospedeira final característico do ciclo lítico de infecção de bactérias por fagos virulentos. Os vírus envelopados adquirem o envelope durante o brotamento através da membrana celular, que é uma membrana alterada por partículas virais específicas do envelope, que foram sintetizadas e ali inseridas. Alguns vírus que se replicam no núcleo, brotam através da membrana nuclear, adquirindo assim o envelope. - Ciclo lisogênico de bacteriófagos Existem circunstâncias em que a produção de componentes virais é desligada indefinitivamente. No ciclo lisogênico de replicação de bacteriófagos, não ocorre a produção de novas partículas virais As etapas de adsorção e penetração do vírus ocorrem da mesma forma e pelos mesmos mecanismos que no ciclo lítico Após a liberação do ácido nucleico do invasor, ao invés de ocorrer o início da síntese de componentes virais, ocorre integração do ácido nucleico viral ao ácido nucleico da célula hospedeira. Uma condição essencial para que ocorra a lisogenia é que o bacteriófago contenha DNA de fita dupla. Esse ácido nucleico só será duplicado quando o ácido nucleico da célula hospedeira for duplicado. PATOGÊNESE DA INFECÇÃO VIRAL FASE DE ATAQUE AO HOSPEDEIRO 1. PENETRAÇÃO DO VÍRUS NO HOSPEDEIRO 5 portas de entrada: a. Pele a penetração do vírus pela pele intacta é rara pela dificuldade de ser ultrapassada a camada impermeável de células queratinizadas b. Trato respiratório superfície mucosa que está em contato constante com o ambiente exterior no processo de respiração, desempenha um papel importante na penetração do vírus. Fatores que inibem a entrada: produção de muco; proteases; citocinas; imunidade humoral e celular. c. Trato gastrointestinal d. Trato genito-urinário e. Conjuntiva raramente disseminam provocando infecções sistêmicas 2. DISSEMINAÇÃO Principal via de disseminação é a via sanguínea quando o vírus está presente no sangue é chamado de viremia Outro mecanismo importante na disseminação viral ocorre através dos nervos 3. PERÍODO DE INCUBAÇÃO É o período compreendido entre o início da infecção (momento de entrada do agente infeccioso) e o momento em que aparecem os primeiros sintomas 4. FASE DE MANIFESTAÇÃO DOS SINTOMAS CULTIVO DE VÍRUS Animais de laboratório Inoculação em ovos embrionados Culturas celulares Purificação ultracentrifugação Detecção/identificação microscopia eletrônica; métodos imunológicos e de biologia molecular DIAGNÓSTICO LABORATORIAL DAS INFECÇÕES VIRAIS Coleta do material Isolamento e identificação do vírus Sorologia Demonstração direta do vírus ou de antígenos e ácidos nucleicos virais Diagnóstico molecular QUIMIOTERAPIA ANTIVIRAL AÇÃO DROGA ANTIVIRAL - Inibição da penetração - amantadina - inibição da transcrição - ribavirina - rifampicina - inibição da tradução - ribavirina - metisazona - Inibição da replicação - idoxuridina - citarabina - vidarabina - trifluorotimidina - ribavirina - aciclovir - AZT VANTAGENS E DESVANTAGENS DAS VACINAS INATIVADAS E ATENUADAS Tipo de vacina Vantagens Desvantagens Inativadas Possibilidade de uso de vacinas polivalentes Necessidade de doses vacinais múltiplas* Elevada estabilidade Ausência de produção de anticorpos da classe IgA secretora Necessidade de doses elevadas de antígeno Atenuadas Dose vacinal única** Possibilidade de reversão da atenuação Administração pelas vias natural ou não natural Possibilidade de disseminação natural*** Produção de anticorpos das classes IgG, IgM e IgA Elevada labilidade Interferência na replicação de vírus não atenuados Inativação por anticorpos específicos existentes * com exceção da vacina antiinfluenza **Com exceção da vacina antipoliomielite *** Particularmente importante para vacina anti-rubéola