Aula 06 - Principais Técnicas em Bioquímica e Biomol

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Bioquímica: Principais técnicas utilizadas em Bioquímica e Biologia Molecular
Prof. Dr. Orleâncio G. R. de Azevedo, Ph.D.
Histórico
Estudos com radisótopos por Marie Curie (1902)
Descoberta do DNA por Watson e Crick (1953)
PCR desenvolvida por Kary Mullis (1983)
Projeto Genoma Humano fundado (1990)
Financiamento bilionário
Histórico
Histórico
Primórdios dos processos fermentativos 
Egípcios, sumérios, babilônios na fabricação de cerveja e pão
Antonie Von Leeuwenhock com o advento do microscópio e a descoberta das bactérias
Louis Pasteur (1876) demonstrando que a causa das fermentações era a ação desses seres minúsculos, os microrganismos
Procurar um gene dentro de um genoma humano é comparável a procurar uma pessoa sem sobrenome em uma casa sem endereço em uma rua desconhecida em uma cidade não identificada de um país estrangeiro.
Solange Farah
Principais métodos em Biologia Molecular
PCR
Bibliotecas genômica e de expressão
Fragmentação –digestão
Separação –eletroforese
Clonagem molecular
Sequenciamento
Southern, Northern e Western blotting
Imunohistoquímica
ELISA (Ensaio Imunoenzimático)
Enzimas de restrição
1953 –a eficiência de replicação de um bacteriófago dependia da célula hospedeira
Verificou-se, então, a presença de nucleases
Bactéria restringe o crescimento do fago e protege o seu DNA metilando-o (modificando)
Fenômeno chamado restrição/modificação
Advento das endonucleases de restrição
Sítio é normalmente uma palíndrome
Enzimas de restrição
Reconhecem sequências de 4 a 8 pares de bases
Cortes com extremidades abruptas ou coesivas
Primeira letra maiúscula é gênero e as duas outras minúsculas são espécies
1073 –foram usadas para clonagem molecular
Pode-se recombinar DNA humano com qualquer outra espécie
Fragmentos separados por eletroforese
Enzimas de restrição
Enzimas de Restrição
Clonagem Molecular
Clonagem Molecular
Consiste no isolamento e propagação de moléculas de DNA idênticas
Primeiro: inserto + vetor = rDNA
Segundo: rDNA + célula hospedeira = transformação
Clonagem Molecular
DNA Recombinante
È o desenvolvimento de tecnologia baseado em sistemas biológicos 
Os objetivos são os mais variados
Fabricação de fármacos
Cura doenças
Limpeza ambiental
Manipulação genética
DNA Recombinante
Conjugação Bacteriana
Conjugação: troca de material genético entre 2 bactérias através de pontes chamadas Pili
Transformação Bacteriana
Transformação : A bactéria absorve moléculas de DNA disperso no meio e incorporá-los a si. 
Transdução Bacteriana
As moléculas de DNA são transferidas de uma bactéria a outra usando vírus como vetores.
Transdução Especializada
Consiste em primeiramente transferir genes de interesse como por exemplo a transferência de um gene que codificam produtos envolvidos na degradação de galactose pelo fago l de E. coli.
Eletroforese
Eletroforese
Já conhecida desde 1930
Difundida em 1950-1960
Movimentação de moléculas submetidas a campo elétrico
Usa um substrato: papel, agarose, poliacrilamida
Separa proteínas por cargas e peso molecular
Separa ácido nucléicos por peso molecular
Eletroforese
PCR (Reação em cadeia da Polimerase)
Técnica revolucionária que visa a obtenção de milhares de cópias de fragmentos de interesse no DNA
Se utiliza apenas de ciclos térmicos para a realização da atividade da enzima polimerase
PCR (Reação em cadeia da Polimerase)
Tem a participação de seqüências iniciadoras chamadas de primers.
Ocorre o anelamento desses primers e a partir disso a polimerase sintetiza uma seqüência complementar da cadeia.
PCR (Reação em cadeia da Polimerase)
PCR (Reação em cadeia da Polimerase)
Equipamentos Utilizados
L
A
D
D
E
R
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Western blot
Análise que se baseia principalmente na análise de proteínas de amostras biológicas através da ligação entre antígenos/anticorpos
Utiliza-se anticorpos primários e secundários marcados
Anticorpos secundários marcados com alguma elemento que emita luminescência
Western blot
È um método em biologia molecular e bioquímica para detectar proteínas em um homogenato (células bem trituradas).
Essa técnica usa eletroforese em gel para separar as proteínas desnaturadas por peso molecular
Western blot
As proteínas são então transferidas do gel para uma membrana (tipicamente de nitrocelulose)
Onde são usados os anticorpos específicos à proteína. 
Pode-se examinar a quantidade de proteína em uma dada amostra e comparar os níveis entre diversos grupos experimentais e controles
Western blot
Algumas características podem comprometer a reação de W. blot
Bloqueio ineficaz
Diluição do anticorpo
Tempo de exposição
Qualidade dos tampões
Western blot
Aplicações em Diagnóstico Clínico
O teste confirmatório de HIV emprega um Western blot para detectar o anticorpo anti-HIV na amostra de soro humano. 
Um Western blot também é um teste definitivo para a BES (encefalopatia espongiforme bovina).
Algumas formas do teste da Doença de Lyme empregam o Western blot.