RT-PCR

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RT-PCR (Reverse Transcriptase Chain Reaction)
•Reação é composta de 2 partes: a transcrição reversa e a 
amplificação propriamente dita. 
•A reação não parte de um molde de DNA diretamente extraído da 
amostra; a amostra fornece o RNA, que é convertido em cDNA (DNA 
complementar). 
•Ferramenta útil em estudos de expressão gênica, pois avaliando o 
mRNA, podemos detectar quais proteínas estão sendo efetivamente 
expressas.
Extração de RNA - TRIZOL
• Agente desnaturante forte
• Consiste de uma solução monofásica de fenol e guanidina isotiocianato. Durante a 
extração, o Trizol rompe as células e mantém a integridade do RNA 
•A adição do clorofórmio, seguido da centrifugação, separa a solução em fases aquosa 
e orgânica. 
•O RNA permanece exclusivamente na fase aquosa. 
•RNA total é recuperado por precipitação com isopropanol. 
• Uma das maiores preocupações na extração de RNA é a sua degradação por ação de 
ribonucleases (RNAses) que são enzimas extremamente resistentes a diversos 
tratamentos, inclusive térmicos 
Extração de RNA – Colunas de sílica gel
•Quantificação do RNA em espectrofotômetro (260nm)
•Verificação da integridade do RNA em gel de agarose
Terminada a extração…
rRNA
Síntese de cDNA
Eletroforese de ácidos nucléicos
Tampão de amostra
500pb
Gel de agarose 1%
4000pb
50pb