Aula4_ReplicacaoDNA

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16/03/2018
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Replicação do DNA
QBQ 317N – Aula 4
• Como o material genético é duplicado 
(replicado) com máxima precisão (sem erros)?
A informação genética (hereditária) é 
fielmente transmitida de geração à geração.
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Prêmio Nobel em Fisiologia ou Medicina, 1962, para Francis Crick, 
James Watson & Maurice Wilkins por elucidar a estrutura do DNA
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Como é a replicação do DNA?
Semi-conservativa ConservativaDispersiva
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A replicação do DNA é semi-conservativa
Replicação do 
DNA
O mecanismo de 
replicação está 
baseado no 
pareamento das 
bases da cadeia de 
DNA.
A estrutura do DNA 
contém a informação 
necessária para 
perpetuar sua 
sequência de bases
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DNA-Polimerases: As enzimas que sintetizam DNA
A síntese de DNA 
ocorre pela adição de 
nucleotídeos a 
extremidade 3´OH da 
cadeia em crescimento.
A DNA polimerase 
requer um primer
(iniciador) e um DNA 
molde
A síntese requer 
desoxirribonucleosídeos
5´trifosfato como 
substrato
Sentido da síntese 
sempre é 5’  3’
DNA polimerase I
Purificada de extratos de 
E.coli, em 1957, por 
Arthur Kornberg
Prêmio Nobel em Fisiologia ou Medicina, 1959, para Severo Ochoa e Arthur Kornberg pela descoberta
do mecanismo enzimático de síntese do DNA e do RNA
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DNA-polimerase
Desoxirribonucleosídeo 5´trifosfato:
dATP; dCTP; dTTP; dGTP
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DNA (dNMP)n + dNTP (dNMP)n+1+ PPi
Desoxiribonucleosídeo
5´trifosfato 
(precursor)
Fita sendo 
polimerizada
Fita molde
Desoxirribose
A química da síntese de DNA
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pirofosfatase
2 P
G = < -7.3 kcal/mol
A química da síntese de DNA
Pareamento de bases
correto incorreto
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•Como a dupla-fita de DNA é replicada?
Fita contínua (líder)
Fita descontínua (atrasada)
Fragmentos de Okazaki
Fitas parentais
Fragmentos de Okazaki:
~1000-2000 nt em bactérias
~100-200 nt em eucariotos
Movimento da 
Forquilha de 
Replicação
A forquilha de replicação
Cada fragmento de 
Okasaki tem seu 
iniciador de RNA
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As DNA-polimerases sempre requerem um iniciador (primer) 
previamente pareado ao molde que será copiado. 
Na replicação o primer é RNA
Primase
DNA polimerase
Bolha de replicação
A replicação é bidirecional
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Forquilha de replicação
Forquilha de replicação
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Fita descontínua
Fita descontínuaFita contínua
Fita contínua
Direção de 
movimento das 
forquilhas
A replicação é bidirecional
Cada fragmento 
de Okasaki tem 
seu iniciador de 
RNA
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A replicação é vista como um “olho” flanqueado 
por DNA não replicado
A replicação é bidirecional
Replicação de cromossomos de 
eucariotos, bactérias e arqueias é 
BIDIRECIONAL
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Síntese da Fita descontínuaPrimer de 
RNA
Remoção do Primer de RNA
Preenchimento da lacuna
Une os dois fragmentos de DNA
RNAse H 
A DNA ligase conecta os fragmentos de Okasaki
após a remoção do primer de RNA pela RNAseH
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•Como a fidelidade da replicação é garantida 
(durante a síntese de DNA)?
A DNA polimerase possui uma atividade de revisão: 
hidrolisa o nucleotídeo incorporado erroneamente 
(pareamento incorreto). Em seguida incorpora o 
nucleotídeo correto
Atividade de exonuclease 3’ 5’ 
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Nucleotídeo mal‐pareado é 
removido pela subunidade 
épsilon da DNA Polimerase 
(exonuclease 3´5´)
DNA polimerase continua a 
elongação
Revisão de prova (proofreading):
Erros de incorporação podem ser corrigidos durante a 
replicação pela própria DNA polimerase III
Quais os principais componentes da 
maquinaria de replicação? 
• Helicase (abertura da dupla fita)• Proteínas ligantes de DNA fita simples (single-
stranded DNA binding protein)• DNA polimerase• Primase (síntese do primer de RNA)• RNAse H (degrada o primer de RNA)• DNA Girase (introduz super-hélice)
A replicação é um processo rápido e preciso! 
A DNA polimerase III de E. coli polimeriza 800nt/segundo
A DNA polimerase III é processiva (adiciona >500000 nt
antes de dissociar do molde)
Taxa de erro = 10-9 por ciclo de replicação
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A maquinaria de replicação (replissomo)
Fita descontínua
Fita contínua (líder)
A processividade da DNA polimerase é garantida por 
uma das subunidades da holoenzima (sliding clamp)
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Subunidades 
Beta da DNA-
polimerase III 
envolvem o 
duplex das 
fitas-filhas
Cinta deslizante β
O processo 
de 
replicação
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Modelo do trombone: para explicar como a maquinaria de
replicação explora a flexibilidade do DNA para sintetizar a fita
contínua e descontínua na mesma direção, formando uma alça
na fita descontínua
Cinta deslizante (subunidades β) aumenta 
a processividade da DNA polimerase
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Como a replicação se inicia? Como termina?
Replicon: Unidade do DNA onde ocorre um evento de 
replicação
Replicon:
1. Origem + Término
2. Ativados apenas uma única vez em cada ciclo 
celular
3. O genoma de uma célula procariótica em geral 
constitui um único replicon
4. Cada cromossomo eucariótico constitui vários 
replicons e todos são ativados uma única vez 
no ciclo celular ainda que não simultaneamente
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oriC
origem de replicação de E. coli
Região com sequências específicas, que são sítios de ligação das 
proteínas DnaA, DnaB, DnaC
GATC tem que estar metilado
Forquilha 
sentido 
horário
Forquilha 
sentido 
antihorário
Terminação Terminação
Forquilha 
sentido 
horário
Forquilha 
sentido 
antihorário
Terminação Terminação
Origem
Término da 
replicação
Cromossomos concatenados
Topoisomerase IV
Cromossomos separados
Ligação de proteínas que 
impedem a passagem do 
replissomo
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A replicação do cromossomo circular
O genoma bacteriano circular constitui um único replicon
A velocidade da forquilha de replicação bacteriana é 
50000pb/min
Uma única origem de replicação em E.coli (OriC, 245 pb)
Divisão celular a cada 20 min
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O genoma eucariótico constitui vários replicons
A velocidade da forquillha de replicação eucariótica é 
2000pb/min
Os replicons eucarióticos tem 40-100 kb e são iniciados em 
tempos diferentes
Fase S demora ~ 6hrs em uma célula somática
A replicação de cromossomos lineares
Remoção dos 
primers: 
encurtamento 
das fitas 
filhas!!!
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Esperado Observado
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Sequências repetidas nas extremidades dos 
cromossomos eucarióticos 
Levedura: 20-100 repetições (TxGx)n
-Célula humana: 1500 repetições 
centrômero
telômero
telômero
Marcação fluorescente de Telômeros
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Div
isõ
es
 ce
lul
are
s
Telomerase replicação dos telômeros
Replicação dos Telômeros: Telomerase
telomerase
RNA molde associado à 
telomerase
Polimerização e 
anelamento
Telômeros humanos 
= 5 a 15kb
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Div
isõ
es
 ce
lul
are
s
Sucessivos eventos de replicação  perda da extremidade dos
cromossomos telômeros diminuem seu tamanho 
Senescência (Morte) Celular
Doenças associadas ao envelhecimento têm sido
associadas ao encurtamento de telômeros
Div
isõ
es
 ce
lul
are
s
Telomerase replicação dos telômeros
Maior atividade de telomerase senescência 
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Prêmio Nobel em Fisiologia ou Medicina, 2009, pela descoberta de como 
os cromossomos são protegidos pelos telômeros e pela telomerase
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O experimento mais bonito da Biologia Molecular
MatthewMeselson Franklin Stahl
Em experimento realizado em 1958, testaram a hipótese de 
que a replicação do DNA é semi-conservativa
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Metodologia do experimento de Meselson & Stahl
Cultivo das 
bactérias 
em meio 
contendo 
15NH4Cl
Bactérias 
transferidas 
para meio 
contendo 
14NH4Cl
Coletar amostra 
após 20 minutos 
e isolar o DNA
(1ª. Geração)
Coletar amostra 
após 40 minutos 
e isolar o DNA
(2ª. Geração)
Coletar amostra 
(tempo 0) e isolar o 
DNA
DNA híbrido 
(15N/14N)
DNA leve (14N)
DNA híbrido 
(15N/14N)
centrifugação 
do DNA em 
gradiente de 
densidade 
(CsCl)
DNA pesado 
(15N)
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Cultivo das 
bactérias 
em meio 
contendo 
15NH4Cl
Bactérias 
transferidas 
para meio 
contendo 
14NH4Cl
Coletar amostra 
após 20 minutos 
e isolar o DNA
(1ª. Geração)
Coletar amostra 
após 40 minutos 
e isolar o DNA
(2ª. Geração)
Coletar amostra 
(tempo 0) e isolar o 
DNA
1ª. replicação
2ª. replicação
Molécula parental 
original
Primeira geração de 
moléculas filhas
Segunda geração de 
moléculas filhas
Gerações
0
0.3
0.7
1.0
1.1
1.5
1.9
2.5
3.0
4.1
0 and 1.0 
mixed
0 and 4.1 
mixed
Pesado
Híbrido
Leve + 
Híbrido
Resultados originais do experimento de Meselson & Stahl
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A síntese de DNA ocorre de 5’  3’.
Por que esta orientação de síntese foi selecionada 
evolutivamente?
P
3´HO
P P P
3´HO P PPP
P
ATG C C
3´OH
P P
3´OHPP
PP
P
P P
ATG C C
Síntese 5´ 3´ Síntese 3´ 5´
P P
3´OH
PP
P
P P
ATG C C
3´OH
PPP
P
P P
ATG C
Após 3´ 5´ exo (proofreading)
P
3´HO
P P PP
P
P
ATG C C
P
3´HO
P P P
ATG C
Após 3´ 5´ exo (proofreading)
P
3´OHPP
A
P
3´HO P P
A