Manipulação do sêmen DILUIDORESe Criopreservação

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Manipulação do sêmen: DILUIDORES
Prof. Guedes
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Manipulação do sêmen
Todo e qualquer tipo de manipulação e tratamento laboratorial imprimido ao ejaculado, suas frações ou componentes
avaliação laboratorial
 física
 química 
morfologia espermática
diluição
resfriamento
envase
congelação
Manipulação do sêmen
- FRESCO OU PURO - REFRIGERADO / CONGELADO
- DILUÍDO - CONGELADO
DIFERENTES FINALIDADES
DEPENDENTE DA CARACTERÍSTICA SEMINAL PRÉ MANIPULAÇÃO
DEPENDENTE DA ESPÉCIE
COLHEITA E AVALIAÇÃO DO SÊMEN
IA
DILUIÇÃO SÊMEN
REFRIGERAÇÃO SÊMEN
CONGELAÇÃO SÊMEN
Sêmen FRESCO ou PURO
FREQUENTE: cães, pequenos ruminantes, suínos, equinos
boa qualidade seminal
USO IMEDIATO
DILUIÇÃO do sêmen
OBJETIVOS:
	- aumentar o volume do ejaculado de modo que um único ejaculado possa originar muitas doses inseminantes
	- auxiliar na manutenção da qualidade do sêmen
	
DILUIÇÃO do sêmen
FUNÇÕES DO DILUIDOR:
	- nutrientes e energia
	- solução tampão para alterações de pH
	- manutenção da pressão osmótica e balanço eletrolítico
	- inibição do crescimento de microrganismos
	- proteção contra choque térmico e formação de cristais de gelo no SPTZ
	- aumentar o volume do sêmen 
	- combater o estresse oxidativo
CARACTERÍSTICAS DO DILUIDOR:
	- atóxico
	- osmolaridade de pH ideiais: 6,8 - 7
	- oferecer nutrientes/energia para SPTZ
	- bloquear a atividade celular
	- baixo custo
	- fácil preparo
Ex: Tris, Tes, gema-citrato, Tris-gema-citatro, glicina-gema, lactose, água de coco, comerciais, etc.
DILUIÇÃO do sêmen
PROTETORES DA M.P.
EXTRACELULARES: 
Não penetram a membrana celular;
Ação de estabilização e reparo da membrana;
Exemplos:
Açúcares,
Lipídeos,
Proteínas,
Aminoácidos,
Polímeros sintéticos de alto peso molecular.
Leite, gema de ovo, água de coco....
Gema de ovo
Comum em diluentes para congelação de sêmen
Protege os espermatozoides de choque térmico
Protege a membrana na congelação e descongelação
Permite níveis de glicerol mais baixos
Nutrição
Composição variável
Questões sanitárias
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PROTETORES DA M.P.
INTRACELULARES: 
Moléculas pequenas que entram na célula;
Exemplos:
Glicerol,
Propileno glicol,
Etileno glicol,
Metanol,
Etanol,
Dimetil sulfóxido,
1-2 Isopropanodiol,
Polietilenoglicol,
Acetamina,
Formamina,
Lactamina.
TAMPÕES do pH
Regulação do equilíbrio osmótico
ELETROLÍTICOS: Citrato de sódio, Fosfatos
NÃO-ELETROLÍTICOS: TRIS / TES
CARBOIDRATOS
FONTE DE ENERGIA: glicose, frutose
EQUILÍBRIO OSMÓTICO: sacarose, lactose, rafinose
ANTIOXIDANTES
Não Enzimáticos:
α-tocoferol (Vitamina E);
Ascorbato (Vitamina C);
Glutationa (GSH);
Urato; 
Piruvato;
Taurina e a hipotaurina. 
Enzimáticos:
Superóxido dismutase (SOD);
Catalase;
Glutationa peroxidase (GPx).
OUTROS...
EDTA: evita a aglutinação (suíno, equino, primatas...)
ANTIBIÓTICOS
OEP (Orvus es paste- lauril sulfato de sódio): detergente, dispersor de fatores de proteção existentes no plasma seminal
DILUIDORES para Bovinos
Multiplique – 100ml (R$50,00), Botu-bov, Bovimix (Nutricell)
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Bubalinos: Diluidores à base de Tris , à base de glicina e à base de TES
 
Ovinos: Diluidores à base de TRIS e à base de lactose
 
Caprinos: Diluidores à base de Tris e à base de leite desnatado
 
Cães: À base de Tris, de glicina. 
 
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SÊMEN REFRIGERADO
SÊMEN CONGELADO: necessidade de centrifugação prévia em meio específico
DILUIDORES para Equinos
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Diluidores para sêmen refrigerado (15C), de curta estocagem (2 dias)
Diluidores de longa estocagem (6 dias): Zolesco, MR-A (comercial)
Diluidor de sêmen congelado: à base de lactose
DILUIDORES para Suínos
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DILUIÇÃO do sêmen
CUIDADOS NA DILUIÇÃO:
	- adicionar o diluidor lentamente, pela parede do tubo
	- controle rigoroso da temperatura
	- reavaliar após suspensão
Cálculo da diluição
PASSO A PASSO:
	1º) Saber quantos sptz o ejaculado apresenta
	
	- multiplicar o volume total do ejaculado colhido pela concentração espermática
	- CONCENTRAÇÃO: câmara de Neubauer
Câmara de Neubauer
[SPTZ] = n x 5 x diluição x altura da câmara x 1000 SPTZ/mL
PASSO A PASSO:
	2º) Saber quantos sptz VIÁVEIS o ejaculado apresenta
	
	- multiplicar o número total de SPTZ do ejaculado pela motilidade espermática (%)
	
Cálculo da diluição
PASSO A PASSO:
	3º) Saber quantos sptz estarão VIÁVEIS após a descongelação do ejaculado 
	- multiplicar o número de SPTZ VIÁVEIS do ejaculado pela perda de descongelação
	- 40 a 50%
Cálculo da diluição
PASSO A PASSO:
	4º) Saber quantas doses inseminantes o ejaculado pode originar
	- dividir o número de SPTZ VIÁVEIS pós descongelação
pelo número da dose inseminante para a espécie
	
Cálculo da diluição
ESPÉCIE
FRESCO/REFRIGERADO
CONGELADO
Bovino
-
20 x 106(0,5mL)
Equino
500 x 106
800 x 106
Suíno
3 x 109(80 a 100mL)
Canino
todo o ejaculado
200 x 106(apr. 2mL)
Felino
80 x 106(100uL)
8 x 106(IU – 30uL)
Ovino
150-200 x 106(100-150uL)
150-200 x 106
Caprino
100-150 x 106(IV 30-50uL)
60 x 106(IU 10-20uL)
PASSO A PASSO:
	5º) Saber o volume da dose inseminante
	- palhetas de 0,5 ou 0,25 mL
	- frascos de IA (suínos e equinos – 100 mL)
Cálculo da diluição
PASSO A PASSO:
	6º) Saber o volume total de sêmen diluído
	- multiplicar o NÚMERO de doses inseminantes pelo VOLUME da dose inseminante
Cálculo da diluição
PASSO A PASSO:
	6º) Saber o volume total de sêmen diluído
	- EQUINO e CÃO: centrifugar o sêmen e descontar o valor do pelete.
	- PEQ RUM e BOV: não centrifugar.
Cálculo da diluição
CONGELAÇÃO do sêmen
PASSO A PASSO:
	7º) Resfriamento
	- ejaculado e diluidor em banho-maria: 37ºC
	- resfriar até 5ºC
	- evitar CHOQUE TÉRMICO 
	- 20min
	- tempo de glicerolização 
CONGELAÇÃO do sêmen
PASSO A PASSO:
	TEMPO DE GLICEROLIZAÇÃO
	
velocidade de congelação (oC / min)
sobrevivência espermática (%) 
efeitos da solução
cristais intracelulares
CONGELAÇÃO do sêmen
PASSO A PASSO:
	TEMPO DE GLICEROLIZAÇÃO
	
EFEITO SOLUÇÃO
Formação de gelo extracelular
Hiperosmose e desidratação
FORMAÇÃO CRISTAIS DE GELO
cristais de gelo intracelulares
CONGELAÇÃO do sêmen
PASSO A PASSO:
	TEMPO DE GLICEROLIZAÇÃO
congelação muito LENTA: desidratação + toxicidade
 congelação muito RÁPIDA: formação de cristais intracelulares e lise do SPTZ
CONGELAÇÃO do sêmen
PASSO A PASSO:
	8º) Envase e identificação
	- todo o material deve estar RESFRIADO
CONGELAÇÃO do sêmen
PASSO A PASSO:
	 processamento automático
Fonte: SIAE
CONGELAÇÃO do sêmen
PASSO A PASSO:
	8º) Congelação final e armazenamento
	- manter sobre vapor de N2 líquido por 20 minutos
	- temperatura de -120 a -150ºC
	
CONGELAÇÃO do sêmen
PASSO A PASSO:
	8º) Congelação final e armazenamento
	
	
CONGELAÇÃO do sêmen
PASSO A PASSO:
	8º) Congelação final e armazenamento
	
	
Avaliação pós descongelação
Após 24 horas:
	
	- descongelar 1 palheta e avaliar a motilidade
		- mínimo: 30% / vigor 02 - 03
 
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