AULADIAGNOSE2016 - fITOPATOLOGIA

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MÉTODOS EM DIAGNOSE DE DOENÇAS DE 
PLANTAS
Prof. Bruno Sérgio Vieira
DEFICIÊNCIAS NUTRICIONAIS
Deficiência de 
fósforo em milho
Deficiência de manganês em 
folhas de laranjeira
Deficiência de cálcio em tomate
Deficiência de manganês em 
milho
INJÚRIAS DE PRAGAS
INJÚRIAS DE PRAGAS
FATORES ABIÓTICOS
Phaeosphaeria maydis
Fitotoxidez do 
Herbicida Paraquat em 
milho
DIAGNOSE DE DOENÇAS DE 
PLANTAS
1ª DICA: NÃO CHUTAR
Estudo de caso: 
Mancha de Phoma (Phoma costaricensis)
x 
Mancha aureolada (Pseudomonas syringae pv. garcae)
Fungicidas: Cúpricos, triazol, 
estrobilurina, benzimidazol
Fungicidas Cúpricos, (hidróxido 
de cobre, casugamicina 
(antibiótico) 
“Procedimentos laboratoriais”
1. Coleta e envio de amostras: recomendações gerais.
1.2. Sintomas iniciais e avançados da doença.
1.3. Evitar excesso de umidade.
1.4. Evitar exposição ao calor.
1.5. Não misturar amostras na mesma embalagem.
1.6. Apenas amostras radiculares devem ser acompanhadas de solo.
1.7. Amostras com espinhos devem conter a inscrição CUIDADO.
1.8. Enviar material fresco embrulhado em jornal ou saco plástico perfurado (chegada até 2 dias).
1.1. Enviar material devidamente identificado.
1.9. Enviar material herborizado (chegada além 2 dias).
2. Registro da amostra.
3. Coleta de informações auxiliares.
4. Protocolo geral: processo de diagnose segue uma rotina bem
estabelecida em que as causas possíveis
são progressivamente eliminadas por um
processo lógico-dedutivo.
5. Quais são as causas possíveis (fungo, bactéria, nematoide, artrópode,
causa abiótica, vírus, fitoplasma, protozoário)?
6. Análise Quarentenária: patógenos específicos?
(Instrução Normativa).
Fungo
Vírus
Nematoide
Bactéria
7. Amostras são dissecadas sob microscópio estereoscópico. 
Bactérias Fitopatogênicas
1. Sintomatologia.
Crestamento bacteriano do feijoeiro (X. a. phaseoli); B – Podridão mole em batata (E.
c. carotovora).
A B
2. Testes de exsudação.
Procedimento para teste de exsudação em gota. 
2. Testes de exsudação.
Exsudação de Xanthomomas campestris pv. campestris em folha de couve.
Procedimento padrão para o isolamento de fitobactérias a partir de órgãos vegetais
infectados.
3. Isolamento em cultura pura.
3. Isolamento em cultura pura.
Colônias isoladas de Xanthomonas axonopodis pv. phaseoli.
4. Testes de patogenicidade e hipersensibilidade.
A B
C D
Inoculação com suspensão bacteriana; B – Inoculação por injeção;
C – Inoculação com palito;
D – Reação de hipersensibilidade (HR).
Bactéria Planta Sintomas típicos HR
Fitopatogênica Hospedeira + -
Fitopatogênica Não-hospedeira - +
Saprófita Qualquer - -
________________________________________________________________
Fonte: Romeiro (2001)
Característica 
 
E
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Reação de Gram - - - - - - - - - + + 
Crescimento anaeróbio + + - - - - - - - - - 
Crescimento aeróbio + + + + + + + + + + + 
Colônias amarelas ou alaranjadas em YDC ou NBY - +a - - - - +b +c - +d - 
Colônias mucóides em YDC a 30oC - - + - + - - - + + - 
Pigmentos fluorescentes em KB - - - + - - - - - - - 
Pigmentos não-fluorescentes difusíveis em KB - - - - - + - - - - - 
Urease -e - + - + V - + ND - ND 
Oxidase - - + - + +f - - + - + 
Crescimento a 40oC - V + - - +g - - - - - 
Mais do que 4 flagelos peritríquios + + - - - - - - - - - 
Crescimento em D1M ágar - - - - - - - - + - - 
Formação de esporos - - - - - - - - - - - 
Micélio aéreo - - - - - - - - - - + 
 Características utilizadas para a identificação de gêneros de bactérias fitopatogênicas (SCHAAD, 2002)
5. Identificação de gêneros e espécies: série progressiva de testes
(coloração, testes fisiológicos, etc.)
Nematoides Fitopatogênicos
1. Sintomatologia.
A B
Galhas de Meloidogyne exigua em pimentão; B – Anel vermelho em coqueiro
(Bursaphelenchus cocophilus).
2. Extração
2.1. Funil de Baermann
Suporte
Peneira plástica
Lenço de papel
Solo ou material vegetal
Água
Funil
Mangueira de borracha
Presilha
Bequer ou copo
Suspensão de nematóides
Esquema de extração de nematóides pelo método do
Funil de Baermann.
2.2. Flotação centrífuga em solução de sacarose (Jenkins, 1964)
A B C E
D
J I H F
G
Esquema de extração de nematóides pelo método de
Jenkins.
Água
Centrífuga por 4 min
O sobrenadante é 
descartado
Solução de sacarose
Centrifugação por 1 min.
O sobrenadante é recuperado
Os nematóides, menos densos que a sacarose, são 
separados do solo, que é mais denso que a sacarose
2.3. Borbulhador
Extração de nematóides de sementes de gramíneas pelo método do
borbulhador..
3. Preparo de suspensão para análise.
3.1. Colocar suspensão extraída em tubo de ensaio e deixar decantar por 30 min.
3.2. Drenar, com o auxílio de uma mangueira fina, o excesso de água, ficando os
nematóides concentrados.
3.2. Verter essa suspensão em uma placa tipo syracuse ou placa de contagem.
4. Preparo de lâminas temporárias.
4.1. Sob microscópio estereoscópico, transferir os espécimes para uma pequena gota
de água limpa colocada no centro de uma lâmina.
4.2. Dispor os nematóides no centro e no fundo da gota.
4.3. Sobrepor uma lamínula e selá-la.
4.4. Etiquetar convenientemente.
5. Exame ao microscópio ótico para a identificação de gêneros e
espécies.
Anguina agrostis Heterodera schachtii
→ Literatura
Vírus Fitopatogênicos
1. Sintomatologia.
Mancha anelar em mamoeiro (PRSV); B – Mosaico dourado do feijoeiro
(BGMV).
A B
2. Gama de hospedeiros: análise de sintomas em plantas indicadoras .
2.1. Identificar espécies indicadoras
2.2. Polvilhar Carborundum 600 nas folhas a serem inoculadas .
2.3. Macerar o tecido vegetal em almofariz, na presença do tampão (1:5) .
2.4. Molhar a gaze no inóculo e passar, sem pressão, nas folhas das indicadoras.
2.5. Observar e anotar os sintomas:
Espécie inoculada Sintomas a 3 
d.p.i. 
Sintomas a 
14 d.p.i. 
Sintomas a 
28 d.p.i. 
 
 
 
 
 
 
 Nicotiana tabacum (fumo), Nicotiana benthamiana, Nicotiana 
glutinosa, Chenopodium quinoa (quinoa), Cucurbita pepo (abobrinha). 
2. Gama de hospedeiros: análise de sintomas em plantas indicadoras .
A
C
B
D
Sintomas em plantas indicadoras: A – Mosaico/Mosqueado;
B – Bolhosidade; C – Lesões cloróticas; D – Lesões necróticas.
Nicotiana tabacum (fumo
Nicotiana benthamiana Nicotiana glutinosa
Chenopodium quinoa 
3. Teste sorológico: ELISA indireto.
3.1. Preparo e adição de amostras.
3.2. Lavagem da placa.
3.3. Preparo e adição do anti-soro.
3.4. Preparo e adição do conjugado.
3.5. Preparo e adição do substrato.
3.5. Interpretação dos resultados.
3. Teste sorológico: ELISA indireto.
4. Amplificação de ácido nucléico por PCR.
4.1. Extração do ácido nucléico.
4.2. Montagem da reação:
Tampão da enzima
MgCl2
dNTP’s
Oligonucleotídeos
Taq DNA Polimerase
Água
Mix para PCR:
Tampãp 10×
MgCl2
dNTP’s
PAL1v1978
PAL1c496
Taq Polimerase
H2O
Parâmetros de amplificação:
Desnaturação inicial: 94oC por 2 minutos
30 ciclos de: desnaturação (94oC por 1 minuto),
anelamento (50oC por 2 minutos) e
polimerização (72oC por 2 minutos)
Polimerização final: 72oC por 10 minutos
Incubação final a 4oC Termociclador
4.3. Análises dos resultados: eletroforese.
Eletroforese de proteína viral.
Fungos Fitopatogênicos
1. Sintomatologia.
Fungos Fitopatogênicos
1. Sintomatologia.
Fungos Fitopatogênicos
1. Sintomatologia.
Fungos Fitopatogênicos
1. Sintomatologia.
A - Mancha de ascoquita em ervilha (Ascochyta pisi); B – Mancha de alternária em
chicória (Alternaria cichorii)
A B
Fungos Fitopatogênicos
1. Sintomatologia.
Fungos Fitopatogênicos
1. Sintomatologia.
Fungos Fitopatogênicos
1. Sintomatologia.
Fungos Fitopatogênicos
1. Sintomatologia.
Fungos Fitopatogênicos
1. Sintomatologia.
Fungos Fitopatogênicos
1. Sintomatologia.
Abacate
Sphaceloma perseae
Laranja
Elsinoe fawcetti
2. Preparo de lâminas e identificação do agente etiológico.
Phyllachora sp.
Plasmopara australis
Phakospora pachyrhizi
Lâminas
→ Literatura
3. Isolamento em cultura pura.
3.1. Isolamento direto.
Esquema para o isolamento direto de fungos
fitopatogênicos.
3. Isolamento em cultura pura.
3.1. Isolamento indireto.
Esquema para o isolamento indireto de fungos
fitopatogênicos.
4. Preparo de lâminas e identificação do patógeno.
Bipolaris sp.
Phytophthora ramorum
Micélio estéril (endofita/saprófita?)
Lâminas
→ Literatura
Patologia de Sementes
1. Exame de sementes secas:
→ Observação de sintomas e sinais de fitopatógenos (ex. escleródios).
Figura 15. Escleródios de Claviceps purpurea misturados em
sementes de cereais.
5. Incubação em meio de cultura:
→ Semeio de sementes previamente desinfestadas em meios de cultura
(gerais ou seletivos) esterilizados e incubação (ex. Fusarium graminearum).
Espiga de milho infectada por Fusarium graminearum; B – Colônias de F.
graminearum obtidas em meio de cultura.
A B
8. Incubação em câmara úmida - Teste de “Blotter”:
→ Método padrão utilizado em patologia de sementes.
→ Semeio de sementes, previamente desinfestadas ou não, sob papel
umedecido em caixa gerbox.
Teste de “Blotter” realizado com diferentes lotes de sementes.
→ Variações:
- 2,4-D: usado para inibir a germinação de dicotiledôneas.
9. Incubação em câmara úmida - Teste de “Blotter”:
Teste de “Blotter” realizado com sementes de coentro e
beterraba .
Diagnose fitopatológica como “trabalho 
de detetive”: um exemplo prático –
solucionando o mistério da verrugose da 
goiabeira
“Verrugose”
Fungos x Insetos
Sphaceloma psidii
Pestalotiopsis sp. 
Outros 
Tripes 
Percevejos 
Outros 
? ?
Relatos: “Doença” encontra-se amplamente distribuída no Brasil e pode causar perdas 
de até 100% da produção.
Etiologia: Agente causal desconhecido???
“Verrugose” em outras culturas:
Abacate
Sphaceloma perseae
Laranja
Elsinoe fawcetti
Relatos: “Doença” encontra-se amplamente distribuída no Brasil e pode causar perdas 
de até 100% da produção.
Etiologia: Agente causal desconhecido???
Coleta de amostras: Frutos de goiabeira apresentando sintomas de “verrugose” 
foram coletados em diferentes cidades e regiões do país
(Sudeste, Sul, e Centro-Oeste). 
Fungos x Insetos
Sphaceloma psidii
Pestolotiopsis sp. 
Outros 
Tripes 
Percevejos 
Outros ? ?
Isolamento indireto de fitopatógenos:
Fruto infectado
Colônias isoladas:
Colletotrichum gloeosporioides Pestalotiopsis sp.
Este gêneros incluem espécies patogênicas, epífitas e/ou saprófitas, dependendo 
do hospedeiro e das condições do ambiente...
MAS NENHUM DOS DOIS É CONHECIDO COMO CAUSADOR DE VERRUGOSE! 
Observação de associação constante com tripes... APENAS COINCIDÊNCIA?
Experimentos:
Pomar 1 - (Sr. Antenor)
Utilizaram-se no total 10 plantas, cada uma delas contendo todos os 8 tratamentos.
Trat 1: Ferimento + inseticida + ensacamento
Trat 2: Tripes + ensacamento
Trat 3: Inseticida (Confidor)
Trat 4: Inseticida + ensacamento
Trat 5: Fungicida (Cercobin 1g/L)
Trat 6: Coquetel fúngico + câmara úmida
Trat 7: Ferimento + coquetel fúngico + câmara úmida
Trat 8: Testemunha
Conclusões:
Conclusões:
• Nenhum dos dois fungos testados causou a 
“verrrugose” nos frutos de goiabeira, mesmo em tecidos 
mecanicamente danificados;
Conclusões:
• Frutos de goiabeira tiveram sintomas iniciais da “verrugose” 
quinze dias após a infestação com tripes.
• Nenhum dos dois fungos testados causou a 
“verrrugose” nos frutos de goiabeira, mesmo em tecidos 
mecanicamente danificados;
Conclusões:
• Frutos de goiabeira tiveram sintomas iniciais da “verrugose” 
quinze dias após a infestação com tripes.
• A “doença” não é uma doença, é uma injúria de inseto.
• Nenhum dos dois fungos testados causou a 
“verrrugose” nos frutos de goiabeira, mesmo em tecidos 
mecanicamente danificados;
Laboratório de Diagnóstico Fitossanitário – DFP/UFV
Portaria de Credenciamento: 50, de 19 de dezembro de 2000.
Laboratório de Micologia
Laboratório de Micologia
Sala de Incubação Coleção de Culturas
Laboratório de Nematologia
Laboratório de Virologia
Laboratório de Bacteriologia
Casa-de-vegetação
Câmara de crescimento