Aula 4 - DNA Recombinante [2019_1] (1)

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Tecnologia do DNA Recombinante
Aula 4
Prof. Rodrigo Volcan Almeida
DBq – IQ – UFRJ
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Técnica do DNA recombinante
Construção de DNA recombinante ou clonagem:
ligar dois ou mais segmentos de DNA, gerando mólecula capaz de replicação autônoma em hospedeiro celular.
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Técnica de DNA recombinante
Base das técnicas de DNA recombinante
enzimas que modificam ácidos nucléicos
síntese, degradação, ligação ou remoção de partes dos ácidos nucléicos de forma controlada
Enzimas
DNA Polimerases
Enzimas de restrição - corte
Ligases - ligação 
Kinases e fosfatases - modificação de terminações (alteração de PO4)
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Princípio geral…
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E. coli
Plasmídeo
Digestão
Digestão
Eucarioto
Ligação
Transformação
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Ferramentas de Trabalho
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Enzimas de Restrição
Endonucleases de restrição
Bacteriófagos  vírus infectam bactérias
1950s - fagos infectam cepas específicas
certos fagos “restritos” a certas cepas (Luria) 
1962 - endonuclease clivam DNA não protegido
DNA não protegido degradado por endonuclease restringindo infecção
1968 - purificação 1a endonuclease de restrição
1970 - purificação e caracterização HindII
corte mesmo sítios - mapa de restrição Simian Virus 40
Enzimas
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Enzimas de Restrição
Organismos possuem sistema de Restrição e Modificação associados
Modificação - metilação de bases
Enzimas de restrição ocorrem em bactérias, vírus, alga eucarionte Chlorella
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Enzimas de Restrição
Tipos de Enzimas de Restrição/Modificação:
Tipo I - Restrição e Modificação na mesma enzima com 2 ou 3 subunidades heterólogas
Tipo II - sistema R e M separados
Homodímeros
93% das comerciais
Tipo III - R e M na mesma enzima
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Tipos de Enzimas
de Restrição
Tipos de Terminação
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Enzimas de Restrição
Enzimas de Restrição Tipo II
reconhecem sítios palindrômicos - 4 a 8 bases
cortam no interior da seqüência
enzimas R e M adjacentes no genoma de origem
requerem Mg2+
normalmente produzem 5’-fosfato e 3’-OH
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Enzimas de Restrição
Nomeclatura
Nome específico do organismo:
1a letra o gênero + 2 letras espécie = 3 letras
próximo letra da identificação da cepa
numeral romano indica ordem de identificação 
Escherichia coli = EcoRI
Haemophilus influenza = Hind III 
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Enzimas de Restrição
Sítios de Reconhecimento de Tipo II
palíndrome de 4 a 8 bases com eixo rotacional de simetria
EcoRI - GAATTC
interrompido
 SfiI - GGCCNNNNNGGCC
AccI - GTMKAC - M = A ou C; K = G ou T
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Enzimas de Restrição
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Enzimas de Restrição
http://rebase.neb.com
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Enzimas de Clonagem
LIGASES
ligar ou juntar ácidos nucléicos (lig. fosfodiéster)
clonagem de fragmento de DNA em vetor
FOSFATASES
remover grupo 5’ fosfato de fitas de DNA
prevenir re-ligação de vetor
produzir substrato para quinase adicionar 32 PO4
QUINASES (Kinases)
adicionar grupos fosfato - marcação 32P 
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Ligases
T4 DNA ligase: ligar ou juntar ácidos nucléicos  refazer a ligação fosfodiéster
clonagem de fragmento de DNA em vetor
5’
P 5’
3’
OH 3’
5’ P
5’
3’ OH 
OH 3’
5’
3’
5’
OH 3’
Mg 2+, ATP
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Papel in vivo
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Ligases
Função biológica:
produzida por fago T4 em E. coli
ligar intervalos na replicação de DNA (“Okazaki”)
reparo de DNA e recombinação
Catalisa a formação de ligações fosfodiéster entre nucleotídeos e hidrólise de ATP->AMP + PPi
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Ligases
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Ligases
T4 DNA de bacteriófago = comumente usada na construção de recombinantes
Requer ATP como co-fator
Não utiliza NAD (E. coli DNA ligase)
usada em quebras ou ligação coesivas e não abruptas
Para reações intermoleculares requer que uma possua 5’-fosfato 
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Isolamento do Gene
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Isolamento do Gene
PCRs (polymerase chain reaction)
Procariotos  PCR comum (primer específico) e outros
Eucariotos  RT-PCR
BIOINFORMÁTICA
Biblioteca genômica
Biblioteca de cDNA
Metagenômica
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Isolamento do Gene
PCRs (polymerase chain reaction)
Executa in vitro o processo de replicação do DNA
Quais os componentes presentes na replicação do DNA?
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Isolamento do Gene
PCRs (polymerase chain reaction)
Executa in vitro o processo de replicação do DNA
DNA polimerase
DNA molde (a ser replicado)
Nucleotídeos (dATP , dTTP , dCTP, dGTP - dNTPs)
Iniciadores (oligonucleotídeos – “primers”)
Condições de reação (pH, sais, temperatura)
Explicando o funcionamento do PCR
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PCR
SEQUENCIAMENTO
Isolamento do Gene
Biblioteca genômica
Um exemplo para um gene de 4,1kb no genoma humano de 3bilhões pb 
3,3 milhões de clones  ~20mil placas !!!
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Isolamento do Gene
Biblioteca de cDNA
Purificação do mRNA poliadenilado  oligodT-Sepharose, oligodT-streptavidina
Síntese do cDNA
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Isolamento do Gene
Biblioteca de cDNA
Síntese do cDNA (RNaseH method)
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Isolamento do Gene
Biblioteca de cDNA
Síntese do cDNA (RNaseH method)
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Isolamento do Gene
Metagenômica
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Vetores
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Vetores de clonagem
Plasmídeo - 0,1 a 10 Kb
pBR322; pUC; pGEM; pBluescript; pET
Fago lambda - ~0,1 a 18 Kb
Cosmídeo - ~35 a 50 kb
BAC e YAC - fragmentos maiores
Insertos: genômico, transcrito reverso de mRNA (cDNA), subclonagem ou sintético
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Vetores de clonagem
Manipulação após purificacão
larga escala
“mini-prep” ou lise alcalina 
Características para uso:
origem de replicação
marcadores de seleção 
resistência a antibiótico (ampR e tetR)
gene lacZ - amino terminal b-galactosidase (complementa)
IPTG e X - Gal
sítio múltiplo de clonagem (MCS)
tamanho (quanto menor melhor!)
Plasmídeos
DNA circular acessório, auto-replicativo e extra-cromossomal tamanho de 1 a > 200 Kpb
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Outros Vetores…
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Vetores de clonagem
Insertos maiores
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Vetores de clonagem
Insertos maiores
Plasmídeo - acomoda até 10 Kb
rearranjos ou interfere com replicação
Fago l - acomoda até 18 Kb
Cosmídeo - plasmídeo contendo sitío COS
concatâmeros de moléculas pelo sítio COS
apenas COS para empacotamento de fago
partícula reconhece apenas sítio COS 
partículas de fago com cosmídeo - infectivas
replicação como plasmídeo - colônias
35 a 50 kb, conforme cosmídeo (< 8 Kb) máx 52 kb 
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Hospedeiros
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Hospedeiros
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Escherichia coli
Escherichia coli – comensal ou patogênica para humanos
cromossomo circular 4.639 Kpb
cepas derivadas de K-12
cepas mais utilizadas
denominadas por uma ou mais letras + números
JM 109, HB 101, DH5a, DH10, XL1 blue,......
E. coli BL21(DE3)pLysS
F- ompT gal dcm lon hsdSB(rB- mB-) λ(DE3) pLysS(cmR) 
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Escherichia coli
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Escherichia coli
Cresce rapidamente a 37oC (ciclo de 20 min)
Meio mínimo ou rico
Glucose - melhor fonte de C
Extrato de levedura - essenciais
Triptona e Peptona: fonte amino ácidos
Cepas de E. coli - sem plasmídeo
Introdução de plasmídeo -> transformação
tratamento químico (PEG, CaCl2) ou físico (eletroporação)
vantagens
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Escherichia coli
Não GRAS
Corpos de inclusão (desvantagem?)
Citoplasma  redutor  pontes dissulfeto
Não faz glicosilação
Proteínas intracelulares
desvantagens
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Escherichia coli
Corpos de inclusão (desvantagem?)
Agregados protéicos insolúveis formados pela superexpressão de proteínas que excede a capacidade do sistemas de chaperonas da célula 
desvantagens
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Leveduras
GRAS
Glicosilação
Pontes dissulfeto
Expressão extra-celular
vantagens
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Saccharomyces cerevisiae
Maior tempo de geração que E. coli
Produção de proteínas hiperglicosiladas (S. cerevisiae)
Degradação de proteínas expressas no meio
desvantagens
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Células Animais
São capazes de promover as mudanças pós-traducionais mais complexas, exigidas principalmente por proteínas de organismos superiores
Expressão extra-celular
vantagens
CHO (Chinese Hamster Ovary)
BHK (Baby Hamster Kidney)
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Células Animais
Tempo de geração muito grande (1dia)
Contaminação
Meios de cultura muito complexos e caros
Exigência de Soro Fetal Bovino  contaminação com vírus e micoplamas
Células frágeis  lise celular facilmentedesvantagens
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Purificação
Proteínas de Fusão
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Proteínas de Fusão
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Proteínas de Fusão
Glutationa-S-transferase  se liga especificamente à glutationa (glutationa agarose)  anti-corpo
His-Tag  6xHis  afinidade ao Ni  anti-corpo
as diferentes proteínas (tags) de fusão podem ajudar mais do que na purificação
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Proteínas de Fusão
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Gene Reporter
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Gene Reporter
GFP
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Gene Reporter
GFP
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Gene Reporter
GFP
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Uso das Variantes de GFP
Divisão celular (fusão de Receptor de Lâmina B com GFP 10C) + cromatina (fusão Histona 2B com ECFP)
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Vocês conhecem o Zebrafish?
Danio rerio
Uso das Variantes de GFP
Uso das Variantes de GFP
Uso das Variantes de GFP
Uso das Variantes de GFP
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