AULA_02_TECNOLOGIA_DNA RECOMBINANTE

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Prof. Rafael Fernandes Ferreira
Tecnologia do DNA 
Recombinante
Março/2022
5
LEMBRETES
CITOLOGIA
GENÉTICA
BIOQUÍMICA
BIOLOGIA 
MOLECULAR
ANTES DE ENTENDER COMO FAZER PROTEÍNA 
RECOMBINANTE
Organização estrutural das células
Organização Nuclear e Nomenclaturas
Transferência da informação do DNA para a 
proteína
ENDONUCLEASES DE RESTRIÇÃO
Composição do DNA
Organização estrutural das células
Organização Nuclear e Nomenclaturas
Composição do DNA
Transferência da informação do DNA para a proteína
Endonuclease de Restrição (Enzima de Restrição)
POR QUE ESTAS ENZIMAS NÃO DEGRADAM O 
DNA DAS BACTÉRIAS?
Elas se protegem
metilando as
sequências de
seu DNA
Nomenclatura
As enzimas de restrição são chamadas de acordo com a bactéria 
que o produziu
RY 13
Exemplo: EcoR I
Escherichia coli 1º enzima a ser 
descoberta nesta 
bactéria
Gênero
Ordem de 
descoberta 
Espécie Linhagem
• EcoRI Escherichia coli
• BamHI Bacillus amyloliquefaciens RH
• BglII Bacillus globigii
• PvuII Proteus vulgaris
• HindIII Haemophilus influenzae Rd
• HinfI Haemophilus influenzae Rf
• Sau3A Staphylococcus aureus
• AluI Arthrobacter luteus
• TaqI Thermus aquaticus
• HaeIII Haemophilus aegyptius
• NotI Nocardia otitidis-caviarum
Clonagem de DNA é o processo de fazer várias cópias
idênticas de um pedaço específico de DNA.
O gene ou outro fragmento de DNA de interesse é
primeiramente inserido numa peça circular de DNA chamada
plasmídeo.
Organismo Hospedeiro
(BACTÉRIAS)
PROTEÍNA DE INTERESSE
Qual a finalidade de produzir várias cópias de uma sequência 
de DNA num plasmídeo?
Em alguns casos, precisamos de muitas cópias de DNA para realizar
experimentos ou construir novos plasmídeos.
Qual a finalidade de produzir várias cópias de uma sequência de 
DNA num plasmídeo?
O fragmento de DNA codifica uma proteína útil, e as bactérias são usadas como 
"fábricas" para produção dessa proteína
1. ISOLAR O GENE DE INTERESSE
Para que se tenha o DNA recombinante, de duas origens diferentes, é
necessário utilizar as enzimas de restrição. Essas enzimas reconhecem a
sequência alvo específica e cortam seletivamente o fragmento que será
utilizado.
1. ISOLAR O GENE DE INTERESSE (Enzimas de Restrição) 
1. ISOLAR O GENE DE INTERESSE (Enzimas de Restrição) 
1. ISOLAR O GENE DE INTERESSE (Enzimas de Restrição) 
Enzimas de restrição são nomeadas a partir das espécies de procariontes dos
quais foram isoladas. Por exemplo, as enzimas isoladas da bactéria Escherichia
coli começariam com Eco (como em EcoRI).
2. UNIR O GENE AO VETOR: DNA RECOMBINANTE
O fragmento de DNA é inserido em um vetor, que é uma molécula de DNA 
na qual um gene é inserido para construir a molécula de DNA 
recombinante.
2. UNIR O GENE AO VETOR: DNA RECOMBINANTE
DNA LIGASE
Para que a sua sequência de interesse seja inserida dentro do plasmídeo, uma
enzima deve ser utilizada: é a DNA ligase.
Ela irá formar ligações fosfodiéster entre o seu DNA e as duas extremidades
dos plasmídeos.
2. UNIR O GENE AO VETOR: DNA RECOMBINANTE
DNA LIGASE
2. UNIR O GENE AO VETOR: DNA RECOMBINANTE
PLASMÍDEOS
Vetor de clonagem mais utilizado são plasmídeos de Escherichia coli. Eles são
moléculas de DNA circular compostas por regiões funcionais:
• Uma origem de replicação;
• Um gene de resistência a determinado antibiótico;
• Um gene LacZ (cor azul);
• Alguns sítios de restrição (região onde o inserto será inserido).
3.TRANSFORMAÇÃO
Molécula de DNA recombinante produzida é introduzida em um organismo 
hospedeiro, podendo então ser replicadas.
As células hospedeiras copiam o DNA do vetor juntamente com o próprio DNA, criando múltiplas cópias do DNA inserido.
Exemplos de células hospedeiras: bactérias Escherichia coli e Bacillus subtilis e a levedura Saccharomyces cerevisiae.
4. SEMEADURA E INCUBAÇÃO
✓ Bactérias são semeadas em ágar contendo o antibiótico correspondente ao gene de
resistência presente no plasmídeo, e somente as bactérias que possuem o plasmídeo
(contendo o gene de resistência) dentro delas conseguirão crescer no meio.
✓ Nesse meio de cultura também é adicionado um substrato cromógeno, como por
exemplo a X-Gal (análogo da lactose→ galactose + indol).
✓ Enzima β-galactosidase (produzida pelo LacZ) cliva a X-Gal em galactose e um composto
azul escuro.
4. SEMEADURA E INCUBAÇÃO
5. TRIAGEM AZUL-BRANCA
Houve ligação (plasmídeo + inserto?) 
Mudança de cor nas colônias para fazer a triagem.
Dois tipos de colônias podem se formar:
Colônias brancas: bactérias em que os plasmídeos contendo o inserto 
estão presentes. Isso significa que o gene LacZ foi interrompido pelo 
inserto, não produziu a enzima e não clivou a X-gal. DEU CERTO!!!
Colônias azuis: bactérias que têm os plasmídeos, mas eles não tem o 
inserto. Isso significa que o gene LacZ não foi interrompido pelo inserto e 
foi transcrito na enzima e produziu a cor azul.
5. TRIAGEM AZUL-BRANCA
6. Confirmação se o inserto realmente está no plasmídeo
O próximo passo é selecionar algumas colônias brancas e semeá-las 
novamente, porém em meio líquido (caldo) e não em ágar.
Extração somente do DNA plasmidial
Restrição Enzimática
Eletroforese
6. Confirmação se o inserto realmente está no plasmídeo
Se tiver dado certo, você verá duas bandas: uma do plasmídeo e outra do seu 
inserto.
Somente as colônias 1, 3 e 4 possuíam o plasmídeo recombinante com seu inserto.
7. PURIFICAÇÃO DE PROTEÍNAS
A proteína de interesse é então purificada, separada dos demais conteúdos das 
células, por exemplo, outras proteínas e macromoléculas. Isso garante que não 
haja nenhuma impureza, restando apenas o produto final (ex.: insulina).
APLICAÇÕES
Biofármacos
Produzir proteínas humanas com aplicações terapêuticas, como:
Insulina
Hormônio do crescimento humano
Ativador de plasminogênio tecidual (tPA/ APt) (usado para tratar 
derrames e prevenir coágulos sanguíneos). 
APLICAÇÕES
Terapia genética (TG)
Desordens genéticas → pacientes não possuem a forma funcional 
de um gene. 
TG → fornece uma cópia normal do gene para as células do corpo 
do paciente. 
Construir plasmídeos com uma versão normal do gene que é não funcional na fibrose cística. Quando
os plasmídeos foram liberados nos pulmões dos pacientes com fibrose cística, a função pulmonar
deteriorou menos rapidamente
APLICAÇÕES
Organização de DNA nas células. Universidade Federal de Santa Maria. Acesso em Fev 2022.
http://coral.ufsm.br/blg220/hide/organizDNA.htm
Enzimas de Restrição. Universidade de São Paulo. Acesso em Fev 2022.
http://www.iq.usp.br/bayardo/softwares/proteina/advanced/cap3/tarefas3.html
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REFERÊNCIAS