Clonagem de DNA

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Clonagem de DNA
É o processo de fazer várias cópias
idênticas de um pedaço específico de
DNA;
O gene ou outro fragmento de DNA de
interesse é primeiramente inserido numa
peça circular de DNA chamada
plasmídeo;
A inserção é feita utilizando-se enzimas
que “cortam e colam” DNA, e produz
uma molécula de DNA recombinante.
 O plasmídeo recombinante é introduzido
em bactérias. As bactérias contendo
plasmídeo são selecionadas e cultivadas.
Conforme elas se reproduzem, replicam o
plasmídeo e o transmitem para seus
descendentes, produzindo cópias do DNA
que ele contém.
Etapas da Clonagem
Cortar e abrir o plasmídeo e "inserir" o
gene. Esse processo baseia-se em enzimas
de restrição (que cortam o DNA) e na DNA
ligase (que une/cola o DNA);
Inserir o plasmídeo na bactéria. Utilizar a
seleção por antibiótico para identificar as
bactérias que pegaram o plasmídeo;
Cultivar lotes de bactérias portadoras de
plasmídeo e usá-las como "fábricas" para
fazer a proteína. Colher a proteína das
bactérias e purificá-la.
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3.
Corte do DNA
 Enzima de restrição é uma enzima
cortadora de DNA que reconhece uma
sequência alvo específica e corta o DNA em
dois pedaços neste sítio ou próximo a ele.
 A enzima DNA ligase une os fragmentos
com extremidades correspondentes para
formar uma única molécula de DNA íntegra.
Isto produz um plasmídeo recombinante que
contém o gene alvo.
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Alessandra Julião
Transformação e seleção bacteriana
 Durante a transformação, é dado um
choque (por exposição a alta temperatura,
por exemplo) a células bacterianas
especialmente preparadas que as encoraja a
incorporar DNA estranho.
 Um plasmídeo geralmente tem um gene
de resistência aos antibióticos, que permite
que as bactérias sobrevivam na presença de
um antibiótico específico. Assim, as bactérias
portadoras de plasmídeo podem ser
selecionadas em placas com nutrientes
contendo o antibiótico.
Produção de Proteína
As bactérias servem como mini "fábricas,"
produzindo grandes quantidades de
proteína. Se nosso plasmídeo continha o
gene da insulina humana, as bactérias
começariam a transcrição do gene e a
tradução do RNAm para produzir muitas
moléculas da proteína insulina humana.
Uma vez que a proteína tenha sido
produzida, as células bacterianas podem
ser abertas para liberá-la;
Existem muitas outras proteínas e
macromoléculas flutuando nas bactérias
além da proteína alvo;
Devido a isso, a proteína alvo deve ser
purificada, ou separada dos outros
conteúdos das células por técnicas
bioquímicas;
A proteína purificada pode ser usada
para experimentos ou, no caso de
insulina, administrada aos pacientes.
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OBS: todas as informações e
imagens são tiradas de anotações
feitas durante as aulas e dos slides
disponibilizados pelo professor!
Alessandra Julião