Validação de Métodos Analíticos

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VALIDAÇÃO DE MÉTODOS ANALÍTICOS
Dra. Adriane Medeiros Nunes
Laboratório de Metrologia Química
Departamento de Química Analítica e Inorgânica - UFPel
Pelotas, 26 de Outubro 2010
2
Introdução
A necessidade de se mostrar a qualidade de medições químicas 
está sendo cada vez mais exigida e reconhecida. Através da sua:
Comparabilidade
Rastreabilidade
Confiabilidade
Resultados Analíticos não confiáveis podem conduzir:
Decisões desastrosas
Prejuízos financeiros irreparáveis
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Introdução
Para garantir que um novo método analítico gere 
informações 
Confiáveis Interpretáveis
Sobre a amostra
Ele deve sofrer uma avaliação denominada 
validação
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Conceitos do processo de validação
Vários autores definem validação de métodos conceitos estão em 
continua evolução
Algumas definições podem ser transcritas:
-“A validação deve garantir, através de estudos experimentais, que o método atenda às 
exigências das aplicações analíticas, assegurando a confiabilidade dos resultados” 
(ANVISA).
- “Validação é o processo de definir uma exigência analítica e confirmar que o método 
sob investigação tem capacidade de desempenho consistente com o que a aplicação 
requer” (ISO/IEC 17025).
- “A validação de métodos assegura a credibilidade destes durante o uso rotineiro, 
sendo algumas vezes mencionado como o “processo que fornece uma evidência 
documentada de que o método realiza aquilo para o qual é indicado para fazer” (USP).
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Validação de métodos
Dentro do âmbito geral do termo validação de métodos é possível 
distinguir dois tipos:
- Validação no laboratório (“in house validation”)
Consiste das etapas de validação dentro de um único laboratório, seja para 
validar um método novo que tenha sido desenvolvido ou para verificar 
que um método adotado está bem aplicado.
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Validação de métodos
- Validação completa 
Envolve todas as características de desempenho e um ESTUDO 
INTERLABORATORIAL.
Utilizado para verificar como a metodologia se 
comporta com uma determinada matriz em 
vários laboratórios
-Estabelecendo a reprodutibilidade da metodologia
- Incerteza expandida associada à metodologia como um todo
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Legislação
No Brasil, existem duas agências credenciadoras para verificar a 
competência de laboratórios de ensaios:
ANVISA: Agência Nacional de Vigilância Sanitária
INMETRO: Instituto Nacional de Metrologia, Normalização e Qualidade 
Industrial.
Disponibilizam guias para o procedimento de validação de métodos analíticos
Resoluções: são documentos com poder de lei, que devem ser obedecidos.
Guias: são documentos que sugerem uma linha a ser seguida e são, portanto, 
abertos para interpretação: “recomendações”.
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Parâmetros analíticos para validação de métodos
- Parâmetros de desempenho analítico
- Características de desempenho
- Parâmetros de mérito
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1- Seletividade ou Especificidade
Amostra
Uma amostra, de maneira geral, consiste:
- Analitos a serem medidos;
- Matriz;
- Outros componentes. 
(que podem ter algum efeito na medição)
 Um método que produz resposta para apenas um analito é chamado de 
específico.
Um método que produz resposta para vários analitos, mas que pode 
distinguir a resposta do analito da de outros, é chamado seletivo.
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HG AAS
Consiste na formação de hidretos voláteis a partir do elemento em 
solução ácida na presença de um agente redutor adequado
 Hidreto Ponto de Fusão Ponto de Ebulição Solubilidade em H2O
 (°C) (°C) (µg.ml-1) 
 AsH3 - 116,3 - 62,4 696 
 GeH4 - 164,8 - 88,1 insolúvel
 SbH3 - 88 - 18,4 4100
 SeH2 - 65,7 - 41,3 37700-68000
Tabela 1- Propriedades de alguns Hidretos empregados para AAS
Dependendo da técnica analítica utilizada, a quantidade 
relativa de matriz pode diminuir
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Dependendo da técnica analítica utilizada, a quantidade 
relativa de matriz pode diminuir
1- Seletividade ou Especificidade
Hidreto + Ar + H2 + 
traços de O2
Fig. 1- Sistema de Geração de Hidretos em batelada (adaptado de Welz & Melcher,1983)
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2- Linearidade e Faixa de aplicação
 
A linearidade corresponde à capacidade do método em fornecer resultados 
diretamente proporcionais à concentração do analito em amostras, dentro de 
uma determinada faixa de concentração.
 A quantificação requer que se conheça a dependência entre a resposta 
medida e a concentração do analito;
 A linearidade é obtida por padronização interna ou externa e formulada como 
expressão matemática usada para o cálculo da concentração do analito a ser 
determinado na amostra real.
Curva de 
Calibração
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 y = ax + b
y = resposta medida (absorvância, altura ou área do pico, etc.);
x = concentração;
a = inclinação da curva de calibração = sensibilidade;
b = interseção com o eixo y, quando x=0.
Regressão linear
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Coeficiente de correlação linear (r): 
-indica o quanto pode ser considerada adequada a reta como 
modelo matemático. 
-> 0,90 é ideal.
-Qualidade da curva obtida: quanto mais próximo de 1, menor a 
dispersão do conjunto de pontos experimentais e menor a incerteza 
dos coeficientes de regressão estimados.
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3- Limite de Detecção (LD) 
O LD representa a menor concentração de analito que pode ser detectada, 
mas não necessariamente quantificada, utilizando um determinado 
procedimento experimental. 
a
3sLOD B=
menor concentração de analito na 
amostra que produz um sinal que pode 
ser distinguido do sinal do branco, 
dentro de certo critério estatístico.
sendo “a” a inclinação da curva de calibração e “s” o desvio-padrão de 
10 medidas do branco.
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4 - Limite de Quantificação
 É a menor quantidade do analito em uma amostra que pode ser 
determinada com precisão e exatidão aceitáveis sob as condições 
experimentais estabelecidas.
sendo “a” a inclinação da curva analítica “s” o desvio-padrão de 10 
medidas do branco.
a
10sLOD B=
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5- Precisão e Exatidão
 São dois termos muito importante em química analítica.
Precisão é uma medida da reprodutibilidade de um resultado. 
Ex. se uma grandeza for medida várias vezes e os valores forem muito próximos uns 
dos outros, a medida é precisa.
Exatidão se refere a quão próximo um valor de uma medida está do “valor real”.
 
Ex. se um padrão conhecido estiver disponível (Material de referência), a exatidão é 
o quão próximo o valor determinado está do valor padrão.
 
18
Precisão e Exatidão
Um dado constituinte em um mesmo material é determinado por três 
métodos diferentes, (a), (b), e (c), onde foram feitas 5 medidas em cada 
método.
(a)
(b)
(c)
Xv
(valor verdadeiro)
16 17 18 19 20 21 22
Medidas precisas e exatas
Medidas precisas, mas 
inexatas
Medidas imprecisas e 
inexatas
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É a proximidade dos resultados obtidos pelo método em estudo em relação 
ao valor de referência aceito como convencionalmente verdadeiro.
Checagem da Exatidão (“Validação”)
- Materiais certificados de referência (CRMs)
- Técnicas alternativas
- Teste da recuperação
Exatidão
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21
Testes de recuperação
A recuperação do analito pode ser estimada pela análise de 
amostras adicionadas com quantidades conhecidas do mesmo 
(spike). 
As amostras podem ser adicionadas com o analito em pelo menos 
três diferentes concentrações:
próximoao limite de detecção; 
próximo à concentração máxima permissível;
concentração próxima à média da faixa de uso do método. 
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Limitação do procedimento: 
-O analito adicionado não está necessariamente na mesma forma 
que a presente na amostra. A presença de analitos adicionados em 
uma forma mais facilmente detectável pode ocasionar avaliações 
excessivamente otimistas da recuperação.
onde:
C1 = concentração determinada na amostra adicionada.
C2 = concentração determinada na amostra não adicionada.
C3 = concentração adicionada.
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Metas - LABmequi
 Desenvolvimento e validação de metodologias analíticas para a determinação de 
metais em produtos alimentícios de carne por Espectrometria de Absorção 
Atômica (AAS).
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Determinação de Na e K em carnes Determinação de Na e K em carnes 
processadas após tratamento com TMAH processadas após tratamento com TMAH 
por FAESpor FAES
25
Atualmente....
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Introdução
 
 
5% Comida 
Caseira
12% Ocorrência 
Natural
6% Adição na 
Ingestão
77% Comida Processada
 
 
- Principal aditivo para a conservação da carne
- Controla o crescimento microbiológico
- Intensifica o paladar do alimento
NaCl
Pesquisas indicam a carne como 
sendo a segunda maior fonte de sal 
na dieta, sendo que os cereais são 
os principais.
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Main Product Category Sub Categories (where relevant)
Current 2010 
 Targets 
(g salt or mg sodium 
per 100g)*
Revised 2010 Targets 
(g salt or mg sodium per 
100g)*
Targets for 2012 
 (g salt or mg 
sodium per 100g)*
1. Meat Products 1.1 Bacon 
Includes all types of injection cured 
bacon, e.g. sliced back, streaky, smoked 
and unsmoked bacon, bacon joints etc. 
Excludes all dry and immersion cured 
bacon.
1.2 Ham/other cured meats
Includes hams, cured pork loin and 
shoulder etc. Excludes ‘Protected 
Designation of Origin’ and traditional 
speciality guaranteed products,.
1.3 Sausages
1.3.1 Sausages Includes all fresh, chilled 
and frozen meat sausages, e.g. pork, 
beef, chicken, turkey, etc.
1.3.2 Cooked sausages and sausage 
meat products Includes all cooked 
sausages and sausage meat products 
e.g. stuffing, turkey roll with stuffing etc. 
Excludes Scotch eggs (see category 
22.1).
3.5g salt or 1400mg 
sodium (average)
3.13g salt or 1250mg sodium 
(average)
2.88g salt or 1150mg 
sodium (average p)
2.5g salt or 1000mg 
sodium (average)
2.0g salt or 800mg sodium 
(average)
1.63g salt or 650mg 
sodium (average p)
1.4g salt or 550mg 
sodium (maximum)
  1.13g salt or 450mg 
sodium (maximum)
1.8g salt or 700mg 
sodium (maximum)
1.63g salt or 650mg sodium 
(maximum)
1.5g salt or 600mg 
sodium (maximum)
1.4 Meat Pies
1.4.1 Delicatessen, pork pies and 
sausage rolls Includes all delicatessen 
pies, pork pies and sausage rolls e.g. 
game pie, cranberry topped pork pie, 
Melton Mowbray pork pie etc.
1.5g salt or 600mg 
sodium (maximum)
1.38g salt or 550mg sodium 
(maximum)
1.13g salt or 450mg 
sodium (maximum)
≈20%
≈35%
≈20%
≈20%
≈25%
≈11%
≈20%
≈10%
≈8%
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Atualmente, industrias alimentícias (que pertencem a Comunidade Européia) 
têm respondido de forma positiva a redução do nível de sal em seus produtos 
alimentícios. 
Fabricantes de produtos cárneos vêm investindo no desenvolvimento de 
metodologias alternativas para a redução da concentração de sal (NaCl) 
nas comidas processadas
Vários trabalhos estão sendo desenvolvidos com este objetivo
Substituindo o máximo possível de Na+ por K+, bem como por 
outros antioxidantes naturais
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Segundo Romans et al. (2001)
Para carnes curadas a concentração de Na+ pode ser reduzida por uma mistura de 
até 50:50 de NaCl com KCl, por possuir sabor aceitável.
 > 50% de substituição – resulta em sabores indesejáveis resultantes do k+
Cheng et al. (2007)
Investigaram a interação da oxidação lipídica e a oxidação do pigmentos causados 
pela substituição do NaCl por KCl em amostras de carnes suínas
-Foi verificado que a redução do nível de NaCl não alterou significativamente a 
pigmentação durante o período de refrigeração.
-Com 50% de substituição – não houve diferenças significativas nos valores de 
pH, pigmentos totais e ferro heme.
30
 Avaliar o uso de TMAH no preparo das amostras de carnes processadas para a 
determinação de Na e K por Espectrometria de Emissão Atômica com Chama 
(FAES) / Propor uma metodologia simples e barata para o controle desses 
elementos em amostras de carnes destinadas a exportação.
Objetivo
 Os resultados serão comparados através de diferentes 
procedimentos de preparo de amostras;
 Através do uso de diferentes técnicas analíticas;
31
Espectrômetro 1 (FAES1/FAAS)
 Espectrômetro de Absorção Atômica (Shimadzu) - modelo AA-6300
 Corretor de Fundo de Deutério;
 Chama ar-aceliteno foi utilizada para todas as determinações;
 Lâmpada de Cátodo Oco de Na (589.0 nm) e K (766.5 nm);
32
Espectrômetro 2 (FAES 2)
 Fotômetro de Chama (Micronal) – modelo B462;
 Chama – Gás butano;
 Volume de amostra – 5 mL mim-1;
33
Amostras 
Amostras comerciais (Diferentes fabricantes):
 Almôndega;
 Carne Bovina Fatiada;
 Salsicha.
Tratamento das Amostras 
 Inicialmente lavadas com Água Milli-Q;
 Cortadas;
 Homogeneizadas – microprocessador;
 Mantidas sob refrigeração à -16 °C em frascos de PEAD;
 Antes da análise as amostras foram descongeladas e homogeneizadas. 
34
Digestão Ácida
2,5 mL HNO3
2,0 mL H2O2 
Tº ≈ 90 ºC
t = 2 h
Solubilização com TMAH
400 µL de TMAH (25,0 % m/v)
Concentração final – 0,2% m/v TMAH
Solubilização T° ambiente 
 Simples
 Seguro
 Reprodutível 
10,0 mL
Tº ≈ 50 ºC no US
t = 2 h
Solubilização com CH2O2
Metodologia
Almôndega Carne fatiada Salsicha
≈ 250,0 mg de amostra moída e úmida foram tratadas e aferidas a 50 mL
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DIGESTÃO ÁCIDA
HCl, HNOHCl, HNO33, H, H22SOSO44, HF e H, HF e H33POPO44; H; H22OO22
PONTO DE EBULIÇÃO À PRESSÃO ATMOSFÉRICAPONTO DE EBULIÇÃO À PRESSÃO ATMOSFÉRICA
Ácido Concentração P.E. (°C)
HCl 37% (m/v) 110
HF 49% (m/v) 108
HNO3 70% (m/v) 120
Água-régia (HCl:HNO3 3:1) v/v 112
H2SO4 98,3% (m/v) 338
H3PO4 85% (m/v) 150
Força do ácido
Ponto de ebulição
Poder oxidante
Poder complexante
Segurança na manipulação
Pureza
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DIGESTÃO ÁCIDA
Temperaturas desejáveis para a digestão de 
amostras biológicas 
Decomposição com HNO3 (apresenta o menor Ponto de Ebulição)
 Altos teores de GORDURAS
 (queijo, manteiga, óleo vegetal) 170 °C
 Altos teores de PROTEÍNAS
 (carne bovina, soro, albumina) 150 °C
 Altos teores de CARBOHIDRATOS
 (trigo, milho, áçúcar, etc.) 140 °C
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DIGESTÃO ÁCIDA
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SOLUBILIZAÇÃO ALCALINASOLUBILIZAÇÃO ALCALINA
TMAHTMAH
Amostras biológicas em geral podem ser facilmente solubilizadas com 
TMAH em temperatura ambiente, sem a necessidade de aplicação de 
energias para o aquecimento, como as microondas ou ultra-sônicas.
~ 250 mg de 
amostra seca
500 µL de TMAH (25% m/v)
Solução resultante:
 Apresentam características de suspensão;
 Baixo fator de solubilização;
 Permanecendo estável durante meses
 Estocadas a temperatura ambiente
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SOLUBILIZAÇÃO ALCALINASOLUBILIZAÇÃO ALCALINA
TMAHTMAH
INCONVENIENTES:
 Odor de amina;
 Alta viscosidade da solução;
 Otimização do procedimento de análise;
 Possíveis interferências não-espectrais
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Resultados e Discussão
mg/g (média ± SD) (RSD)Amostras Secas Amostras Úmidas
Carne Bovina
K 3,25 ± 0,06 (1,8) 3,18 ± 0,06 (1,9)
Na 12,69 ± 0,04 (0,3) 13,67 ± 0,05 (0,4)
Salsicha
K 3,23 ± 0,11 (3,4) 3,33 ± 0,04 (1,2)
Na 29,34 ± 0,12 (0,4) 30,53 ± 0,20 (0,6)
Almôndega
K 4,86 ± 0,05 (1,0) 5,02 ± 0,10 (2,0)
Na 10,90 ± 0,13 (1,2) 10,52 ± 0,04 (0,4)
O emprego das amostras úmidas 
ou secas apresentaram resultados 
de concentrações similares.
250 mg da amostra moída 
foram suficiente para obter 
resultados exatos e precisos
Amostras tratadas 
com TMAHTMAH
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Analito
Faixa de 
Calibração 
(mg L-1)
TMAH CH2O2 HNO3
a 
(mg L 1‑ )
LD 
(µg L-1) R
a 
(mg L 1‑ )
LD 
(µg L-1) R
a 
(mg L 1‑ )
LD 
(µg L-1) R
K 0,2 – 0,8 0,5922 4,6 0,9986 0,5697 5,7 0,9986 0,6048 2,8 0,9989
Na 0,1 – 0,6 0,8679 1,4 0,9992 0,8004 3,6 0,9977 0,8275 1,0 0,9942
Parâmetros de mérito para as três metodologias de preparo de amostra:
Boa Linearidade das curvas de calibração;
Sensibilidades semelhantes. 
42
Analito Amostra
TMAH CH2O2 HNO3
Ve
(mg g-1)
RSD
(%)
LOD
(µg g-1)
Ve
(mg g-1)
RSD
(%)
LOD
(µg g-1)
Ve
(mg g-1)
RSD
(%)
LOD
(µg g-1)
A 3,18±0,05 1,6 2,0 3,39±0,04 1,2 3,0 3,11±0,04 1,3 1,5
K B 3,33±0,03 0,9 3,59±0,08 2,2 3,22±0,01 0,3
C 5,02±0,10 2,0 5,70±0,03 0,5 5,21±0,03 0,6
A 13,67±0,05 0,4 0,8 14,18±0,20 1,4 2,0 13,85±0,08 0,6 0,6
Na B 30,53±0,20 0,6 31,56±0,30 0,9 30,92±0,19 0,6
C 10,52±0,04 0,4 9,98±0,10 1,0 9,68±0,16 1,6A: Carne fatiada; B: Salsicha; C: Almôndega; Ve: Valor encontrado.
 Resultados analíticos, em mg/g, para amostras de carne processadas após 
tratamento com diferentes procedimentos de preparo de amostras por FAES.
 Das amostras de carne analisadas a salsicha foi que apresentou maior conc. de Na;
 Comparado com as metas atuais exigidas pela EU a concentração de Na nas amostras 
de Salsicha é 6X maior;
 As amostras analisadas apresentaram concentrações de Na muito maior que as 
informadas no rótulo;
 Exemplo: 0,68 m/g de Na (Rótulo) – 10 mg/g (Valor Encontrado).
43
Analito Amostra
FAES FAAS
Ve
(mg g-1)
RSD
(%)
R Ve
(mg g-1)
RSD
(%)
R
K
A 3,52±0,26 7,4 0,9966 3,21±0,17 5,3 0,9988
B 3,47±0,02 0,6 3,27±0,05 1,5
C 5,37±0,48 8,9 5,45±0,20 3,7
Na
A 13,63±0,54 4,0 0,9980 13,32±0,18 1,3 0,9954
B 31,93±0,58 1,8 29,60±0,50 1,7
C 9,82±0,16 1,6 10,69±0,05 0,5
As soluções foram 
preparadas em meio de 
CsCl2 (0,09% m/v)
A: Carne fatiada; B: Salsicha; C: Almôndega; Ve: Valor encontrado.
Resultados analíticos, em mg/g, para amostras de carne processadas por FAAS 
e FAES 2, após tratamento com TMAH.
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ConclusãoConclusão
 
 As altas concentrações de Na encontradas nas amostras analisadas e a 
grande discrepância nos níveis desse elemento informado em seus rótulos, 
enfatizam a importância do Brasil em reduzir o teor de sal nos alimentos 
processados e implementar um controle de qualidade.
O método de preparação das amostras com TMAH mostrou-se:
 Ser uma metodologia simples que fornece resultados exatos e precisos para a 
determinação de Na e K por FAES; 
 Empregando poucas quantidades de amostras e reagentes;
 Sendo eficiente na solubilização das amostras estudadas mesmo com um 
elevado teor de gordura, o mesmo comportamento não foi observado com a 
digestão ácida em copo aberto.
 Em conclusão, o procedimento desenvolvido pode substituir com sucesso os 
procedimentos convencionais, pois não foram observadas diferenças 
significativas com um nível de confiança de 95%.
45
AGRADECIMENTOS
Pelo apoio financeiro e bolsas concedidas:
AGRADECIMENTOS
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SOLUBILIZAÇÃO ALCALINASOLUBILIZAÇÃO ALCALINA
TMAHTMAH
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