Diagnóstico sorológico da Sífilis FTA-Abs

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UNIVERSIDADE FEDERAL DE GOIÁS
FACULDADE DE FARMÁCIA
Diagnóstico sorológico da Sífilis FTA-Abs
Docente: 
Discentes: 
Relatório Nº 02 Como exigência da disciplina de
 Imunologia Clínica
Goiânia
INTRODUÇÃO
A sífilis é uma infecção sistêmica causada pela bactéria Treponema pallidum, considerada uma infecção sexualmente transmissível (IST), e essa é a principal via de transmissão da bactéria, porém, pode também ser transmitida por transfusão sanguínea e da mãe para o feto.(COSTA ,C,V et.al, 2017) 
 A sífilis Quando não tratada, alterna períodos sintomáticos e assintomáticos, com características clínicas, imunológicas e histopatológicas distintas, divididas em três fases: sífilis primária, sífilis secundária e sífilis terciária.(MINISTERIO DA SAÚDE, 2010). Mesmo que o tempo para o surgimento dos anticorpos anti-treponêmicos possa variar de um indivíduo para outro, na maioria dos casos, a partir de 10 dias do aparecimento da lesão primária da sífilis é possível obter reatividade nos testes sorológicos,existindo dois tipos de testes para sífilis que são os treponêmicos e não treponêmicos (BENZAKEN,2016).
 Segundo Avelleira JCR, Bottino G (2006) Os testes treponêmicos utilizam o T. pallidum como antígeno e são usados para confirmar a reatividade de testes não treponêmicos e elem disso nos casos em que os testes não treponêmicos têm pouca sensibilidade, como por exemplo na sífilis tardia. Um dos testes treponêmicos utilizados é o Teste de Imunofluorescência indireta – FTA-Abs e ele é o primeiro teste a positivar após a infecção pelo T.pallidum, assim para que haja resultados seguros é requerido profissionais especializados em microscopia de imunofluorescência, microscópio de fluorescência, reagentes de boa qualidade e diluição apropriada do conjugado. (BENZAKEN, 2016)
 O IFI-FTA-Abs é um teste considerado com boa especificidade , porque ele bloqueia anticorpos não específicos que eventualmente podem se encontrar no soro, utilizando treponemas saprófitos(SÁEZ-ALQUÉZAR, 2007). Assim o objetivo da aula é compreender toda a importância de testes treponêmicos, bem como toda a metodologia para um dos tipos desse teste que é de Imunofluorescência indireta – FTA-Abs, buscando analisar o resultado final.
2. MATERIAIS E MÉTODOS
2.1 MATERIAIS
Algodão
Amostra
Conjugado fluorescente 
Controle positivo específico
Diluente
Estante para tubos
Lâmina com antígenos fixados 
Papel de filtro
Pipetas sorológicas
Placa de Petri
Rack para ponteiras
Recipiente para descarte de material
Solução concentrada de salina tamponada com fosfato (PBS)
Sorbente
Tubos cônicos com tampa (Eppendorf)
Tubo Falcon
2.2 MÉTODOS
Inicialmente, pipetou-se 20 µL de amostra e 80 µL de sorbente e colocou em um Eppendorf, sendo este, em seguida, incubado numa estufa a 37° C por 20 minutos. Enquanto isso, preparou-se o controle positivo, o qual pipetou-se 20 µL do controle positivo específico fornecido pelo kit e 80 µL de diluente também fornecido pelo kit e pôs em um Eppendorf.
Posteriormente, após a retirada do Eppendorf, que possuía a amostra mais o sorbente, da estufa, pipetou-se 50 µL desse e pôs no primeiro poço da lâmina contendo os antígenos (T. pallidum) fixados. No segundo poço dessa mesma lâmina, adicionou-se 50 µL do controle positivo preparado. Já no terceiro e quarto poço, adicionou-se 50 µL de sorbente e 50 µL de diluente, respectivamente. Em seguida, colocou-se essa lâmina numa placa de Petri contendo algodões úmidos e levou esses para a estufa a 37° C por 20 minutos.
Depois disso, lavou-se a lâmina em um tubo Falcon com solução concentrada de salina tamponada com fosfato e secou a lâmina com papel de filtro. Em seguida, colocou-se 1 gota do conjugado fluorescente em cada poço da lâmina e incubou essa no escuro, a temperatura ambiente por 20 minutos.
Após esse período, lavou-se novamente a lâmina com solução concentrada de salina tamponada com fosfato e a secou com papel de filtro. Por fim, adicionou-se 1 gota de MM , pôs uma lamínula e observou no microscópio.
3. RESULTADOS E DISCUSSÃO
3.1 RESULTADOS
O teste realizado possui caráter qualitativo e é uma técnica de imunofluorescência indireta. Sendo possível observar se o paciente possui anticorpos específicos contra o treponema pallidum. Para isso, os anticorpos são fixados em uma lâmina e na presença de uma amostra positiva, o Treponema pallidum se conjuga com esses anticorpos e posteriormente é marcado com uma substância fluorescente. Assim, em uma reação reagente, é possível visualizar em microscopia de fluorescência, a presença de treponemas fluorescentes emitindo uma luz verde-maçã. Em um resultado não reagente, os treponemas emitem uma luz avermelhada ou cor verde pálida, sem sinal de fluorescência.	Por meio da análise em microscópio de imunofluorescência de uma lâmina preparada anteriormente, foi constatada a presença de anticorpos para o antígeno Treponema pallidum. 
3.2 DISCUSSÃO
O teste da imunofluorescência indireta (FTA-Abs – Fluorescent Treponemal Antibody-absorption) consiste na pesquisa de anticorpos para o antígeno Treponema pallidum. Nesse sentido, é importante minimizar ligações inespecíficas dos anticorpos presentes na amostra com outros antígenos. Para isso, foi utilizado o sorbent, o qual foi incubado com o soro do paciente para reagir com antígenos não específicos (T. saprófitos por exemplo) que eventualmente estivessem presentes na amostra. Deste modo, esses anticorpos seriam adsorvidos e portanto bloqueados por esses antígenos inespecíficos. 
A etapa de identificação dos anticorpos é realizada com a utilização de um fluoróforo, anti-IgG humano, o qual tem o papel de ligar-se a região FC dos anticorpos ligados ao antígeno e evidencia-los na técnica de imunofluorescência indireta. Nesse contexto, o microscópio de fluorescência emite luz em um comprimento de onda específico , de modo que excita os elétrons do fluoróforo, assim, os elétrons presentes nele saltam para uma camada mais energética, emitindo luz, tornando possível a visualização dos anticorpos. 
	Neste experimento, foram utilizados dois controles negativos, o primeiro com sorbent e o segundo com o diluente. Para a validação deste ensaio, espera-se que não sejam evidenciados anticorpos nos controles negativos. Na imagem ao lado são evidenciados anticorpos conjugados com os antígenos de T. pallidum. Esse antígeno é de morfologia espiroqueta e encontra-se em fluorescência. 
Figura 1 T.pallidum evidenciado em microscopia de de fluorescência
4. CONCLUSÃO
 Em acordo com os resultados obtidos após a realização do teste FTA-abs por meio da leitura em microscópia de imunofluorescência, onde puderam ser observados treponemas em tom verde brilhante, pode se concluir que o soro do paciente é reativo, confirmando resultado positivo para sífilis.
 Os testes treponêmicos, para sífilis, utilizam fragmentos bacterianos ou o antígeno recombinado do T.pallidum para a detecção de anticorpos específicos do tipo IgM ou IgG que possam estar presentes no soro do paciente. O FTA-abs apresenta boa especificidade, pois durante sua execução, ocorre o bloqueio de possíveis anticorpos inespecíficos, permitindo, quando bem executado, uma leitura clara e com baixas possibilidades de resultados equivocados. (SÁEZ-ALQUÉZAR et al. 2007)
 É uma técnica trabalhosa, pois envolve diversas etapas e processos, entretanto, quando realizado junto a um teste não treponêmico permite um diagnostico com maior precisão e segurança nos resultados. Não é indicada para o acompanhamento e evolução do quadro de sífilis, pois há possibilidade de positivar para anticorpos remanescentes de uma infecção tratada. (BRASIL, 2010).
 Pode se inferir que, com relação á elucidação didática, a aula prática cumpriu com o objetivo de trazer a realização de um teste treponêmico de forma a explanar as etapas e mecanismos que o envolvem, explicando de maneira clara e objetiva cada uma delas, bem como a leitura e interpretação doresultado. 
5. REFERÊNCIAS
Avelleira JCR, Bottino G. Sífilis: Diagnóstico, tratamento e controle. An Bras Dermatol. 2006;81(2):111-26.
BERZAKEN, S,A, ET.al. MANUAL TÉCNICO PARA O DIAGNÓSTICO DA SÍFILIS. Disponível em < www.pncq.org.br> Acesso em 04 de abril de 2019.
SÁEZ-ALQUÉZAR, ET.al. DESEMPENHO DE TESTES SOROLÓGICOS PARA SÍFILIS, TREPONÊMICOS (ELISA) E NÃO TREPONÊMICOS (VDRL E RPR), NA TRIAGEM SOROLÓGICA PARA DOADORES DE SANGUE – CONFIRMAÇÃO DOS RESULTADOS POR MEIO DE TRÊS TESTES TREPONÊMICOS (FTA ABS, WB E TPHA. REVISTA DE PATOLOGIA TROPICAL, 2007
Ministério da Saúde. MANUAL TÉCNICO PARA DIAGNÓSTICO DA SÍFILIS. Brasília : Ministério da Saúde, 2016.
BRASIL. Ministério da Saúde. Doenças infecciosas e parasitárias: guia de bolso. Brasília: Ministério da Saúde; 8a ed. rev. 2010. Disponível em: http://bvsms.saude.gov.br/bvs/publicacoes/doencas_infecciosas_parasitaria_guia_bolso.pdf (acesso em 07 abr. 2019).
SÁEZ-ALQUÉZAR,A.; ALBIERI, D.; GARRINI, R.H.C.; MARQUES, W.P.; LEMOS, E.A.; ALVES, A. Desempenho de testes sorológicos para sífilis, treponêmicos (elisa) e não treponêmicos (VDRL RPR), na triagem sorológica para doadores de sangue – confirmação dos resultados por meio de três testes treponêmicos (FTA ABS, WB e TPHA). Revista de Patologia Tropical, v.36, ..3, 2007.