DNA recombinante e a tecnologia de modificação do DNA

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Tecnologias da informação com base no DNA 
Larissa Christina Pires Barreto
Letícia Silva de Mello
Letícia Stéfanny Lamim de Menezes
Marcos Eduardo Gomes do Carmo
Matheus Silva de Barros
Monique Biazon de Oliveira
Genômica e história da humanidade
Ás primeiras sequências genômicas completas de espécies bacterianas na década de 1990. 
Duas sequências genoma humano completo surgiram em 2001
James Watson e Craig Venter. 
 O genoma humano completo pode agora ser sequenciado em um ou dois dias, e um genoma bacteriano, em poucas horas. 
O sequenciamento genômico é auxiliado por novas gerações de métodos de sequenciamento de DNA
Uma sequência genômica é gerada em várias etapas:
Primeiro, as sequências genômicas são quebradas em locais aleatórios por cisalhamento
 Para gerar fragmentos de algumas centenas de pares de bases de comprimento.
 Os oligonucleotídeos sintéticos são ligados às extremidades de todos os fragmentos, fornecendo um ponto de referência conhecido em cada molécula de DNA. 
O sequenciamento genômico é auxiliado por novas gerações de métodos de sequenciamento de DNA
Os fragmentos individuais são então imobilizados em uma superfície sólida, e cada um é amplificado utilizando-se a PCR 
A superfície sólida é parte de um canal que permite que as soluções líquidas possam fluir sobre as amostras
O resultado é uma superfície sólida de apenas alguns centímetros, com milhões de grupamentos de DNA ligados, 
Cada grupo contendo múltiplas cópias de uma única sequência de DNA derivada de um ou de outro fragmento de DNA genômico aleatório. 
O sequenciamento genômico é auxiliado por novas gerações de métodos de sequenciamento de DNA
O pirossequenciamento na qual a adição de nucleotídeos é detectada com
flashes de luz. O excesso de nucleotídeos é destruído rapidamente pela enzima
zima apirase antes que o próximo nucleotídeo pulse. Quando
um nucleotídeo específico é adicionado com sucesso às
cadeias de um agrupamento, o pirofosfato é liberado como
um supbroduto. Outra enzima na solução que banha a superfície
é a sulfurilase, que converte o pirofosfato em ATP.
O aparecimento do ATP fornece por fim o sinal de que
um nucleotídeo foi adicionado ao DNA. Também estão presentes
no meio a enzima denominada luciferase e uma molécula
do substrato, a luciferina (a luciferase é a enzima que
gera o flash de luz produzido por vaga-lumes, 
Quando o ATP é gerado, a luciferase catalisa uma reação
com a luciferina que resulta em um pequeno flash de
luz. Quando muitos flashes pequenos ocorrem em um grupo,
a luz emitida pode ser gravada em uma imagem capturada.
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O sequenciamento genômico é auxiliado por novas gerações de métodos de sequenciamento de DNA
A polimerase adiciona o nucleotídeo adequado às fitas em cada grupo, cada tipo de
nucleotídeo (A, T, G ou C) transportando um marcador fluorescente 
diferente. Esses nucleotídeos terminadores têm grupos de bloqueio
 ligados às estremidades 3’ permitindo apenas a adição de um 
nucleotídeo a cada fita. Em seguida,raios lasers excitam todos os
 marcadores fluorescentes, e uma imagem de toda a superfície revela a cor (e, portanto,
a identidade da base) adicionada a cada grupo. 
O marcador fluorescente e os grupos de bloqueio são então removidos
química ou fotoliticamente, em preparação para a adição de
um novo nucleotídeo para cada grupo. Os procedimentos
de sequenciamento são realizados em etapas. 
6
O genoma humano contém genes e muitos outros tipos de sequências
A estrutura dos cromossomos eucarióticos e das sequências do genoma revelou que muitos, se não a maioria dos genes eucarióticos, contêm um ou mais segmentos de DNA intervenientes que não codificam a sequência de aminoácidos do produto polipeptídico. 
Íntrons: sequências intervenientes
Éxons: seguimentos codificadores
O genoma humano contém genes e muitos outros tipos de sequências
Os íntrons são removidos do transcrito de RNA primário e os éxons são unidos para gerar um transcrito que pode ser traduzido juntamente em um produto.
Expressão gênica e splicing do RNA permitem a produção de várias combinações de éxons, que levam à produção de mais de uma proteína a partir de um único gene. 
O genoma humano contém genes e muitos outros tipos de sequências
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O genoma humano contém genes e muitos outros tipos de sequências
Semelhanças e diferenças entre os seres humanos individuais:
Dentro da população humana há milhões de variações de base única, chamadas de polimorfismos de nucleotídeo único, ou SNP 
Difere do próximo, em média, em 1 em cada 1.000 pb.
Estão na forma de SNP, 
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O genoma humano contém genes e muitos outros tipos de sequências
Ocorre uma grande variedade de deleções maiores, 
Inserções e pequenos rearranjos na população humana. 
A partir dessas diferenças genéticas, muitas vezes sutis, surgem as variações humanas perceptíveis 
Diferenças na cor do cabelo, estatura, visão, tamanho do pé e comportamento.
Hereditariedade
Herança poligênica: Descreve a herança de características que são determinadas por mais de um gene:
Poligenes, produzem traços específicos quando são expressos juntos.
 Difere dos fenótipos possíveis a padrões de herança mendeliana , em que as características são determinadas por um único gene.
Traços poligênicos exibem um alelo não domina completamente ou mascara outro.
O fenótipo é uma mistura dos fenótipos herdados dos alelos progenitores.
Hereditariedade
Traços poligênicos exibem um alelo não domina completamente ou mascara outro.
O fenótipo é uma mistura dos fenótipos herdados dos alelos progenitores.
Hereditariedade
Cor dos olhos :
 E influenciado por até 16 genes diferentes
Quantidade de pigmento melanina da cor marrom que uma pessoa tem na parte frontal da íris.
Castanhos escuros e pretos: Têm mais melanina do que olhos cor de avelã ou verde
Olhos azuis não têm melanina na íris
Hereditariedade
Um cruzamento entre dois indivíduos com olhos castanhos claros (BbGg) produziria várias possibilidades fenotípicas diferentes. 
O alelo para a cor preta (B) é dominante para a cor azul recessiva (b) para o gene 1 .
o gene 2 , a tonalidade escura (G) é dominante e produz uma cor verde.
 O tom mais claro (g) é recessivo e produz uma cor clara.
Olhos negros: (BBGG)
Olhos castanhos escuros: (BBGg), (BbGG)
Ter todos os alelos dominantes olhos negros.
Dois alelos dominantes cor preta ou marrom.
 Um alelo dominante cor verde
Nenhum alelo dominante cor dos olhos azuis.
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Hereditariedade
Cor da pele
Determinado por pelo menos três genes e outros genes
 A cor da pele é determinada pela quantidade de melanina pigmentada de cor escura na pele.
Os genes que determinam a cor da pele têm dois alelos cada e são encontrados em diferentes cromossomos .
Estudo dos genes e seus produtos
 Enzima (chave doença)
Isolar para estudo e análise estrutural
Alterar resíduo de aminoácido em seu sítio ativo = reação que a enzima catalisa
Só possível se: obter gene que codifica 
Clonagem de DNA e métodos desenvolvidos p/ manipular genes clonados
Uma pesquisadora isolou uma nova enzima que é a chave
para uma doença humana. Ela espera isolar grandes quantidades
da proteína a fim de cristalizá-la para seu estudo
e análise estrutural. Deseja alterar os resíduos de aminoácidos
em seu sítio ativo para compreender a reação que a
enzima catalisa. Ela prepara um sofisticado programa de
pesquisa para elucidar como essa enzima interage e é regulada
por outras proteínas na célula. Tudo isso, e muito mais,
se torna possível se ela conseguir obter o gene que codifica
sua enzima. Infelizmente, esse gene tem apenas alguns milhares
de pares de bases no interior de um cromossomo humano,
com um tamanho medido em centenas de milhares
de pares de bases. Como ela vai isolar o pequeno segmento
de que necessita e, então, estudá-lo? A resposta encontra--se na clonagem do DNA e em métodos desenvolvidos para
manipular genes clonados.
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Estudo dos genes e seus produtos
 Genes podem ser isolados por clonagem do DNA
No DNA: um clone é uma cópia idêntica de um segmento particular do gene.
 Solução problema 
MAIOR
Anexá-lo a uma porção muito menor de DNAt e
Permitir que microorganismos façam muitas cópias dessa porção 
Clonagem de DNA
Um clone é uma cópia idêntica. Esse termo foi originalmente
aplicado a células de um único tipo, isoladas e
cultivadas para criar uma população de células idênticas.
Quando aplicado ao DNA, um clone representa muitas
cópias idênticas de um segmento particular do gene. Em
resumo, a pesquisadora deve cortar o gene do cromossomo
maior, anexá-lo a uma porção muito menor de DNA
transportador e permitir que microrganismos façam muitas
cópias dessa porção para ela. Esse é o processo de clonagem
de DNA. O resultado é a amplificação seletiva de
um determinado gene ou segmento de DNA, facilitando
seu isolamento e estudo.
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Estudo dos genes e seus produtos
 Genes podem ser isolados por clonagem do DNA
Cortar o DNA-alvo em locais precisos: Endonucleases (“tesoura”)
 Selecionar molécula transportadora de DNA capaz de auto replicação: Vetores de clonagem (plasmídeos ou DNA viral)
 Juntar dois fragmentos de DNA covalentemente: DNA-ligase 
Transportar o DNA recombinante do tubo de ensaio p/ uma célula hospedeira
 Selecionar ou identificar as células hospedeiras que contem DNA recombinante
Tecnologia do DNA recombinante
 Escherichia coli (1º organismo)
1. Cortar o DNA-alvo em locais precisos. Endonucleases
específicas de sequência (endonucleases de
restrição) fornecem as tesouras moleculares necessárias.
2. Selecionar uma pequena molécula transportadora
de DNA capaz de autorreplicação. Esses
DNAs são chamados vetores de clonagem (vetores
são agentes de entrega). São geralmente plasmídeos
ou DNAs virais.
3. Juntar dois fragmentos de DNA de modo covalente.
A enzima DNA-ligase liga o vetor de clonagem
e o DNA a ser clonado. Moléculas de DNA
compostas por segmentos ligados de modo covalente
a partir de duas ou mais fontes são chamadas de
DNAs recombinantes.
4. Transportar o DNA recombinante do tubo de ensaio
para uma célula hospedeira que irá proporcionar
a maquinaria enzimática para a replicação do
DNA.
5. Selecionar ou identificar as células hospedeiras
que contêm DNA recombinante.
Os métodos utilizados para realizar essas e outras tarefas
relacionadas são coletivamente chamados de tecnologia
do DNA recombinante ou, de modo mais informal, de engenharia
Genética
Grande parte dessa discussão inicial incidirá sobre a
clonagem de DNA na bactéria Escherichia coli, o primeiro
organismo utilizado para o trabalho de DNA recombinante
e ainda a célula hospedeira mais comum. A E. coli apresenta
muitas vantagens: o metabolismo do seu DNA (como
muitos outros de seus processos bioquímicos) é bem compreendido;
muitos vetores de clonagem que ocorrem naturalmente
associados à E. coli, como plasmídeos e bacteriófagos
(vírus bacterianos, também chamado de fagos), são
bem caracterizados; e existem técnicas para transportar
o DNA rapidamente de uma célula bacteriana a outra. Os
princípios aqui discutidos são amplamente aplicáveis à clonagem
de DNA em outros organismos, tópico discutido em
mais detalhes adiante na seção.
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1. Cortar o DNA-alvo em locais precisos. Endonucleases
específicas de sequência (endonucleases de
restrição) fornecem as tesouras moleculares necessárias.
2. Selecionar uma pequena molécula transportadora
de DNA capaz de autorreplicação. Esses
DNAs são chamados vetores de clonagem (vetores
são agentes de entrega). São geralmente plasmídeos
ou DNAs virais.
3. Juntar dois fragmentos de DNA de modo covalente.
A enzima DNA-ligase liga o vetor de clonagem
e o DNA a ser clonado. Moléculas de DNA
compostas por segmentos ligados de modo covalente
a partir de duas ou mais fontes são chamadas de
DNAs recombinantes.
4. Transportar o DNA recombinante do tubo de ensaio
para uma célula hospedeira que irá proporcionar
a maquinaria enzimática para a replicação do
DNA.
5. Selecionar ou identificar as células hospedeiras
que contêm DNA recombinante.
Os métodos utilizados para realizar essas e outras tarefas
relacionadas são coletivamente chamados de tecnologia
do DNA recombinante ou, de modo mais informal, de engenharia
Genética
Grande parte dessa discussão inicial incidirá sobre a
clonagem de DNA na bactéria Escherichia coli, o primeiro
organismo utilizado para o trabalho de DNA recombinante
e ainda a célula hospedeira mais comum. A E. coli apresenta
muitas vantagens: o metabolismo do seu DNA (como
muitos outros de seus processos bioquímicos) é bem compreendido;
muitos vetores de clonagem que ocorrem naturalmente
associados à E. coli, como plasmídeos e bacteriófagos
(vírus bacterianos, também chamado de fagos), são
bem caracterizados; e existem técnicas para transportar
o DNA rapidamente de uma célula bacteriana a outra. Os
princípios aqui discutidos são amplamente aplicáveis à clonagem
de DNA em outros organismos, tópico discutido em
mais detalhes adiante na seção.
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Estudo dos genes e seus produtos
 Endonucleases de restrição e DNA-ligases produzem DNA recombinante
 Conjunto de enzimas 
 (centro) 
 O vetor recombinante é introduzido em célula hospedeira (= amplificação)
 Sistema de restrição-modificação
 
1º Endonuclases de restrição
2º DNA-ligases
Endonuclases de restrição: reconhecimento e clivagem do
 DNA exógeno.
No DNA da hospedeira: proteção do reconhecimento por
metilação. 
Particularmente importante para a tecnologia do DNA recombinante
é um conjunto de enzimas (Tabela 9-1) que se
tornou disponível ao longo de décadas de pesquisa sobre
o metabolismo de ácidos nucleicos. Duas classes de enzimas
estão no centro da abordagem clássica para a geração
e propagação da molécula de DNA recombinante (Figura
9-1). Em primeiro lugar, as endonucleases de restrição
(também chamadas de enzimas de restrição) reconhecem e
clivam o DNA em sequências específicas (sequências de reconhecimento
ou sítios de restrição) para gerar um conjunto
de fragmentos menores. Em segundo lugar, o fragmento
do DNA a ser clonado é unido a um vetor de clonagem adequado,
por meio de DNA-ligases, para ligar as moléculas
de DNA. O vetor recombinante é então introduzido em uma
célula hospedeira que amplifica o fragmento no curso de
muitas gerações de divisão celular.
Endonucleases de restrição são encontradas em um
grande número de espécies bacterianas. No início da década
de 1960, Werner Arber descobriu que a função biológica
dessas enzimas consiste em reconhecer e clivar o DNA exógeno
(o DNA de um vírus infeccioso, por exemplo); afirma-
-se que tal DNA está restrito. No DNA da célula hospedeira,
a sequência que poderia ser reconhecida por sua própria
endonuclease de restrição é protegida da digestão pela metilação
do DNA, catalisada por uma metilase específica. A
endonuclease de restrição e a metilase correspondente são
chamadas algumas vezes de sistema de restrição-modificação.
21
Estudo dos genes e seus produtos
 Endonucleases de restrição e DNA-ligases produzem DNA recombinante
Endonucleases
de restrição 
Tipo I
Tipo II
Tipo III
À1000pb
Dentroda sequência de reconhecimento
À25pb
Complexos grandes
Tanto endonuclease quanto metilase
 Ávidas por ATP 
 Não precisa de ATP
 Catalisa a clivagem das ligações fosfodiéster específicas
 Sequencia de reconhecimento têm 4 a 6 pb de comprimento
Há três tipos de endonucleases de restrição, designadas
I, II e III. Os tipos I e III são complexos geralmente
grandes com múltiplas subunidades, contendo atividades
tanto de endonuclease quanto de metilase. As endonucleases
de restrição tipo I clivam o DNA em sítios aleatórios
que podem estar a mais de 1.000 pares de base (pb) da
sequência de reconhecimento.As endonucleases de restrição
tipo III clivam o DNA a cerca de 25 pb da sequência
de reconhecimento. Ambos os tipos se movem ao longo
do DNA em uma reação que precisa da energia do ATP.
As endonucleases de restrição tipo II, isoladas pela
primeira vez por Hamilton Smith em 1970, são mais simples,
não requerem ATP e catalisam a clivagem hidrolítica
de ligações fosfodiésteres específicas no DNA dentro da
própria sequência de reconhecimento. A extraordinária
utilidade desse grupo de endonucleases de restrição foi
demonstrada por Daniel Nathans, que primeiro as utilizou
para desenvolver novos métodos de mapeamento e análise
de genes e genomas.
Milhares de endonucleases de restrição tipo II foram
descobertos em diferentes espécies bacterianas, e mais de
100 sequências de DNA diferentes são reconhecidas por
uma ou mais dessas enzimas. As sequências de reconhecimento
têm em geral 4 a 6 pb de comprimento e são palindrômicas
(ver Figura 8-18). A Tabela 9-2 lista as sequências
reconhecidas por algumas endonucleases tipo II.
22
Estudo dos genes e seus produtos
Clivagem do DNA por endonuclease de restrição:
Algumas endonucleases de restrição fazem cortes coordenados
nas duas fitas do DNA, deixando dois a quatro
nucleotídeos de uma fita sem par em cada extremidade
resultante. Essas fitas sem pares são chamadas de extremidades
adesivas (Figura 9-2a), pois formam pares de
bases entre si ou com extremidades adesivas complementares
de outros fragmentos de DNA. Outras endonucleases de
restrição clivam ambas as fitas do DNA nas ligações fosfodiésteres
opostas, sem deixar nenhuma base sem par nas extremidades,
frequentemente chamadas de extremidades
cegas (Figura 9-2b).
Uma vez que a molécula de DNA tenha sido clivada
em fragmentos, um determinado fragmento de tamanho
conhecido pode ser parcialmente purificado por meio de
eletroforese em gel de agarose ou poliacrilamida (p. 302)
ou por HPLC (p. 92). Para um genoma típico de mamífero,
entretanto, a clivagem por endonucleases de restrição geralmente
produz um número muito grande de fragmentos
de DNA diferentes para permitir o isolamento adequado
de um segmento específico. Uma etapa intermediária comum
na clonagem de um gene específico ou segmento de
DNA é a construção de uma biblioteca de DNA (descrita
na Seção 9.2).
Após o isolamento do fragmento de DNA-alvo, a DNA-
-ligase pode ser utilizada para uni-lo a um vetor de clonagem
digerido de modo semelhante –isto é, um vetor digerido
pela mesma endonuclease de restrição; um fragmento
gerado por EcoRI, por exemplo, em geral não irá se unir a
um fragmento gerado por BamHI. Como descrito mais detalhadamente
no Capítulo 25 (ver Figura 25-16), a DNA-
-ligase catalisa a formação de novas ligações fosfodiésteres
em uma reação que utiliza ATP ou um cofator semelhante.
O pareamento de bases das extremidades adesivas complementares
facilita muito a reação da ligação (Figura 9-2a).
As extremidades cegas também podem ser ligadas, embora
com menos eficiência. Os pesquisadores podem criar novas
sequências de DNA inserindo fragmentos sintéticos de
DNA (chamados de linkers) entre as extremidades que estão
sendo ligadas. Fragmentos de DNA inseridos com múltiplas
sequências de reconhecimento para endonucleases de
restrição (frequentemente úteis como pontos para inserção
posterior de DNA adicional por clivagem e ligação) são chamados
de polilinkers (Figura 9-2c).
23
Estudo dos genes e seus produtos
 Os vetores de clonagem permitem a amplificação dos segmentos de DNA inseridos
 Dois vetores de clonagem comum: plasmídeos e cromossomos artificiais de bactérias
 
Os plasmídeos de ocorrência natural têm um papel
simbiótico na célula: são capazes de fornecer genes que
conferem resistência a antibióticos ou que realizam novas
funções para a célula. Por exemplo, o plasmídeo Ti de Agro-bacterium tumefaciens torna a bactéria hospedeira capaz
de colonizar as células de plantas e se utilizar de sua energia.
As mesmas propriedades que tornam os plasmídeos
capazes de sobreviverem em um hospedeiro bacteriano ou
eucariótico são úteis para os biólogos moleculares desenvolverem
um vetor para a clonagem de um segmento específico
de DNA. O clássico plasmídeo de E. coli pBR322,
desenvolvido em 1977, é um bom exemplo de um plasmídeo
com características úteis em quase todos os vetores de clonagem
(
1. O plasmídeo pBR322 tem uma origem de replicação,
ou ori, uma sequência onde a replicação é iniciada
por enzimas celulares (ver Capítulo 25). Essa
sequência é necessária para propagar o plasmídeo.
Um sistema regulatório associado limita a replicação
para manter o pBR322 em um nível de 10 a 20
cópias por célula.
2. O plasmídeo contém genes que conferem resistência
aos antibióticos tetraciclina (TetR) e ampicilina
(AmpR), permitindo a seleção de células que contêm
o plasmídeo intacto ou uma versão recombinante
do plasmídeo (discutida a seguir).
3. Várias sequências de reconhecimento únicas no
pBR322 são alvo para endonucleases de restrição
(PstI, EcoRI, BamHI, SalI e PvuII), fornecendo sítios
onde o plasmídeo pode ser cortado e inserido
em um DNA exógeno.
4. O pequeno tamanho do plasmídeo (4.361 pb) facilita
sua entrada nas células e a manipulação bioquímica
do DNA. Esse pequeno tamanho foi gerado
simplesmente cortando-se muitos segmentos de
DNA a partir de um plasmídeo parental maior – sequências
que o biólogo molecular não necessita.
24
 Os vetores de clonagem permitem a amplificação dos segmentos de DNA inseridos
 
Estudo dos genes e seus produtos
Captação do DNA plasmidial: transformação ou eletroporação
Identificação: marcadores de seleção e marcador de triagem
No laboratório, os pequenos plasmídeos podem ser introduzidos
em células bacterianas em um processo chamado
de transformação. As células (frequentemente E. coli,
mas outras espécies bacterianas também são utilizadas) e o
DNA plasmidial são incubados juntos a 0°C em uma solução
de cloreto de cálcio e, em seguida, submetidos a choque
térmico, alterando rapidamente a temperatura para entre
37°C e 43°C. Por motivos não muito bem compreendidos,
algumas das células tratadas desse modo captam o DNA
plasmidial. Algumas espécies de bactérias, como o Acinetobacter
baylyi, são naturalmente competentes na captação
do DNA e não necessitam de tratamento com cloreto
de cálcio – choque térmico. Em um método alternativo, as
células incubadas com o DNA plasmidial são submetidas a
um pulso elétrico de alta voltagem. Esse método, chamado
de eletroporação, torna a membrana bacteriana temporariamente
permeável a moléculas grandes.
Independente da abordagem, relativamente poucas células
captam o DNA plasmidial, de modo que um método
é necessário para identificar aquelas que o fazem. A estratégia
é utilizar um dos dois tipos de genes no plasmídeo,
chamados de marcadores de seleção e triagem. Os marcadores
de seleção podem permitir tanto o crescimento de
uma célula (seleção positiva) quanto matar a célula (seleção
negativa), sob um conjunto definido de condições. O
plasmídeo pBR322 fornece exemplos das seleções positiva
e negativa (Figura 9-4). Um marcador de triagem é um
gene que codifica uma proteína que leva a célula a produzir
uma molécula colorida ou fluorescente. As células não são
prejudicadas quando o gene está presente, e as células que
transportam o plasmídeo são facilmente identificadas pelas
colônias coloridas ou fluorescentes que produzem.
25
 Os vetores de clonagem permitem a amplificação dos segmentos de DNA inseridos
 
Estudo dos genes e seus produtos
Cromossomos artificiais bacterianos Projetos de sequenciamento
de grandes genomas frequentemente exigem a clonagem
de segmentos de DNA mais longos do que normalmente
podem ser incorporados em vetores de clonagem
plasmidiais padrão, tais como o pBR322. Para atender a
essa necessidade, foram desenvolvidos vetores plasmidiais
com características especiais que permitem a clonagem
de segmentosmuito longos (normalmente de 100.000 a
300.000 pb) de DNA. Quando esses grandes segmentos de
DNA clonado são adicionados, esses vetores são suficientemente
grandes para serem considerados cromossomos e
são chamados de cromossomos artificiais bacterianos,
ou BAC (Figura 9-5).
Um vetor BAC (sem qualquer DNA clonado inserido) é
um plasmídeo relativamente simples, em geral não muito
maior do que outros vetores plasmidiais. Para acomodar
segmentos de DNA clonado muito longos, os vetores BAC
têm origens estáveis de replicação que mantêm o plasmídeo
em uma ou duas cópias por célula. O baixo número
de cópias é útil para a clonagem de grandes segmentos de
DNA porque limita as oportunidades de reações de recombinação
indesejadas que podem de modo imprevisto alterar
grandes DNAs clonados ao longo do tempo. Os BACs
também incluem genes par que codificam proteínas, as
quais direcionam a distribuição confiável de cromossomos
recombinantes para as células-filhas na divisão celular, aumentando
assim a probabilidade de cada uma delas transportar
uma cópia, mesmo quando algumas cópias estão presentes.
O vetor BAC inclui tanto os marcadores de seleção
quanto os marcadores de triagem. O vetor BAC mostrado
na Figura 9-5 contém um gene que confere resistência ao
antibiótico cloranfenicol (CmR). A seleção positiva para vetores
contendo células ocorre em placas de ágar contendo
esse antibiótico. Um gene lacZ, necessário para a produção
da enzima b-galactosidase, é um marcador de triagem capaz
de revelar as células que contêm os plasmídeos – agora
cromossomos – que incorporam os segmentos de DNA clonados.
A b-galactosidase catalisa a conversão da molécula
incolor 5-bromo-4-cloro-3-indol-b-D-galactopiranosídeo (X-
-gal) a um produto azul. Se o gene intacto for expresso, a
colônia que o contém será azul. Se a expressão do gene é
interrompida pela introdução de um segmento de DNA clonado,
a colônia será branca.
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 Os vetores de clonagem permitem a amplificação dos segmentos de DNA inseridos
 
Estudo dos genes e seus produtos
27
Genes clonados podem ser expressos para amplificar a produção de proteínas
 
Estudo dos genes e seus produtos
Frequentemente o produto de um gene clonado, mais que
o próprio gene, é o interesse principal, sobretudo quando a
proteína tem valor comercial, terapêutico ou de pesquisa.
Os bioquímicos utilizam proteínas purificadas para muitos
fins, incluindo a descoberta do seu funcionamento, o estudo
de mecanismos de reação, a geração de anticorpos para
as proteínas, a reconstituição de atividades celulares complexas
no tubo de ensaio com componentes purificados e o
exame de parceiros de ligação de proteínas. Com uma compreensão
maior sobre os fundamentos do DNA, do RNA e
do metabolismo proteico e sua regulação em um organismo
hospedeiro como a E. coli ou leveduras, os pesquisadores
manipulam células para expressar genes clonados a fim de
estudar seus produtos proteicos. O objetivo geral é modificar
as sequências ao redor de um gene clonado para enganar
o organismo hospedeiro a fim de produzir o produto
proteico do gene, frequentemente em níveis muito elevados.
A superexpressão de uma proteína torna sua purificação
subsequente muito mais fácil.
Como exemplo, será utilizada a expressão de uma proteína
eucariótica em uma bactéria. Os genes eucarióticos
têm sequências circundantes necessárias para sua transcrição
e regulação nas células dos quais são derivados, mas
essas sequências não funcionam em bactérias. Assim, os
genes eucarióticos não têm os elementos de sequência de
DNA necessários para sua expressão controlada em células
bacterianas – promotores (sequências que informam
à RNA-polimerase onde se ligar para iniciar a síntese de
mRNA), sítios de ligação de ribossomos (sequências que
permitem a tradução de mRNA para proteína) e sequências
regulatórias adicionais. Portanto, as sequências regulatórias
bacterianas adequadas para a transcrição e tradução
devem ser inseridas no DNA vetor nas posições corretas em
relação ao gene eucariótico. Em alguns casos, genes clonados
são expressos de maneira tão eficiente que seus produtos
proteicos representam 10% ou mais da proteína celular.
Nessas concentrações, algumas proteínas estranhas podem
matar a célula hospedeira (geralmente E. coli); portanto, a
expressão do gene clonado deve ser limitada a poucas horas
antes da coleta das células.
Vetores de clonagem com sinais de transcrição e tradução
necessários à expressão regulada de um gene clonado
são chamados de vetores de expressão. A taxa de
expressão do gene clonado é controlada pela substituição
do promotor normal e sequências regulatórias do gene por
versões mais eficientes e convenientes fornecidas pelo vetor.
Geralmente, um promotor bem caracterizado e seus
elementos regulatórios são posicionados próximos a vários
sítios de restrição exclusivos para a clonagem, de modo quegenes inseridos nos sítios de restrição sejam expressos a
partir desses elementos do promotor regulado (Figura
9-7). Alguns desses vetores incorporam outras características,
tais como um sítio de ligação de ribossomos bacterianos,
para potencializar a tradução do mRNA derivado
do gene (Capítulo 27) ou uma sequência de terminação da
transcrição (Capítulo 26).
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Muitos sistemas diferentes são utilizados para expressar proteínas recombinantes. 
Todos organismos vivos tem a capacidade de expressar genes em seu DNA. 
 É possível usá-los como hospedeiros para expressar proteínas de espécies diferentes. 
Cada um tem sua vantagem e desvantagem. 
Estudo dos genes e seus produtos
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Muitos sistemas diferentes são utilizados para expressar proteínas recombinantes. 
 Bactérias:
E. coli são baratos de manter, fácil de armazenar e cultivar. 
Proteínas eucarióticas formam corpos de inclusão quando expressas em bactérias. 
Estudo dos genes e seus produtos
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Muitos sistemas diferentes são utilizados para expressar proteínas recombinantes. 
 Leveduras: 
Saccharomyzes cerevisiae permite atividade para as proteínas eucarióticas. 
Sua parede celular possui grande resistência, dificultando a introdução do vetor. 
Estudo dos genes e seus produtos
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Muitos sistemas diferentes são utilizados para expressar proteínas recombinantes. 
Insetos e vírus de inseto: 
Autographa californica é um baculovírus que possui uma sequência gênica grande para clonagem direta. 
É necessário um método para purificação do vírus. 
Estudo dos genes e seus produtos
32
Muitos sistemas diferentes são utilizados para expressar proteínas recombinantes. 
Células de mamíferos em cultura: 
Utilizam a capacidade natural do vírus de inserir seu DNA ou RNA na célula e nos cromossomos. 
Replicações in vitro são muito caras e por isso é necessário que sejam realizadas in vivo. 
Estudo dos genes e seus produtos
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Marcadores terminais fornecem instrumentos para a purificação por afinidade. 
 
Estudo dos genes e seus produtos
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As sequências gênicas podem ser amplificadas com a reação em cadeia da polimerase. 
Estudo dos genes e seus produtos
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Alteração de genes clonados produz proteínas clonadas.
Mutagênese direcionada
 
Estudo dos genes e seus produtos
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Alteração de genes clonados produz proteínas clonadas.
Mutagênese 
oligonucleotídeo-direcionada
 
Estudo dos genes e seus produtos
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Determinação da função de proteínas
As proteínas contem 3 níveis de função:
Função fenotípica;
Descreve os efeitos de uma proteína em todo o organismo.
Função celular;
Descrição de uma rede de interações em que as proteínas participam no nível celular.
Função molecular;
A atividade bioquímica exata de uma proteína, incluindo detalhes como as reações que uma enzima catalisa ou os ligantes que ligam a um receptor.
Os métodos com base no DNA são uma contribuição fundamental para esse esforço e fornecem informações em todos os três níveis.
Determinação da função de proteínas
Bibliotecasgenômicas
Bibliotecas de DNA são catálogos especializados de informação genética;
Uma biblioteca de DNA é uma coleção de clones de DNA reunidos para fins de sequenciamento do genoma, descoberta de genes ou a determinação da função de um gene/proteína;
A importância da utilização da biblioteca genômica consiste no fato de não ser possível um sequenciamento maior de 800 pares de bases nitrogenadas, e também do aumento da quantidade do DNA tornando-o possivel de ser sequenciado.
A primeira etapa é a digestão parcial do DNA por endonucleases de restrição, de forma que qualquer sequência apareça em fragmentos em um número limitado de tamanhos – uma faixa de tamanhos compatível com o vetor de clonagem para assegurar que praticamente todas as sequências estejam representadas entre os clones na biblioteca:
Bibliotecas genômicas
O vetor de clonagem, como BAC ou YAC, é clivado com a mesma endonuclease de restrição utilizada para digerir o DNA e ligado aos fragmentos de DNA genômico:
Bibliotecas genômicas
A mistura de DNA ligado é então utilizada para transformar células bacterianas ou de leveduras a produzir uma biblioteca de células, cada qual abrigando uma molécula diferente de DNA recombinante. Idealmente, todo o DNA no genoma em estudo é representado na biblioteca. 
Bibliotecas genômicas
Um exemplo é uma biblioteca que inclui apenas as sequências de DNA expressas, isto é, transcritas em um RNA – em determinado organismo, ou mesmo em apenas algumas células ou tecidos.
Bibliotecas genômicas
Bibliotecas genômicas
Essa biblioteca não tem o DNA não codificante que faz parte de grande parte de muitos genomas eucarióticos.
Os fragmentos de DNA de cadeia dupla resultante são inseridos num vetor adequado e clonados,
 gerando uma população de clones chamada de biblioteca de cDNA.
O aparecimento de um gene para uma determinada proteína nessa biblioteca implica que ele é expresso nas células e sob as condições utilizadas para gerar a biblioteca.
Sequências ou relações estruturais fornecem informações sobre a função das proteínas
Uma razão importante para se sequenciar muitos genomas é fornecer um banco de dados capaz de atribuir funções de genes por comparações do genoma, empreendimento conhecido como genômica comparativa.
Algumas vezes, um gene recém-descoberto é relatado por homologias de sequências de um gene previamente estudado em outra ou na mesma espécie, e a sua função pode ser total ou parcialmente definida por essa relação.
Ortólogos: Genes que ocorrem em espécies diferentes, mas têm uma sequência e uma relação funcional clara entre si;
Parálogos: Genes com relações semelhantes entre si, dentro de uma única espécie;
Sequências ou relações estruturais fornecem informações sobre a função das proteínas
Com frequência, pesquisadores modificam geneticamente proteínas de fusão com a finalidade de localizar uma proteína na célula ou organismo.
Algumas das fusões mais úteis envolvem a ligação de proteínas marcadoras que permitem ao investigador determinar a localização por visualização direta ou por imunofluorescência.
Proteínas de fusão e imunofluorescência podem localizar proteínas em células
Um gene-alvo (que codifica a proteína de interesse) fusionado ao gene de GFP gera uma proteína de fusão altamente fluorescente (ela literalmente acende quando exposta à luz azul) e pode ser visualizada diretamente em uma célula viva.
A proteína GFP (PDB ID 1GFL), derivada da água-viva Aequorea victoria, tem estrutura em barril b; o fluoróforo (apresentado como modelo de volume atômico) é o centro do barril.
Proteínas de fusão e imunofluorescência podem localizar proteínas em células
https://pdb101.rcsb.org/learn/paper-models/green-fluorescent-protein-gfp
Uma cuidadosa modificação genética da proteína, associada ao isolamento de proteínas fluorescentes relacionadas provenientes de outros celenterados marinhos, disponibilizou uma ampla variedade dessas proteínas, em um conjunto de cores.
Proteínas de fusão e imunofluorescência podem localizar proteínas em células
Com essa tecnologia, por exemplo, a proteína GLR1 (receptor de glutamato do tecido nervoso) foi visualizada como proteína de fusão GLR1-GFP no nematódeo Caenorhabditis elegans:
Proteínas de fusão e imunofluorescência podem localizar proteínas em células
Gotas de gordura autofluorescente se colorem falsamente de magenta
As membranas das células de E. coli são coradas com corante fluorescente vermelho. As células estão expressando uma proteína que se liga a um plasmídeo residente, fusionado com GFP. Os pontos verdes indicam as posições dos plasmídeos.
Proteínas de fusão e imunofluorescência podem localizar proteínas em células
Em muitos casos, a visualização de uma proteína de fusão GFP em uma célula viva real não é possível, prática ou desejável.
 A proteína de fusão GFP pode estar inativa ou pode não ser expressa em níveis suficientes para permitira visualização.
Proteínas de fusão e imunofluorescência podem localizar proteínas em células
https://web.northeastern.edu/cramlab/
Nesse caso, a imunofluorescência é um método alternativo para a visualização da proteína endógena (inalterada).
A proteína de interesse é algumas vezes expressa como uma proteína de fusão com um marcador de epítopo, sequência proteica curta que se liga firmemente a um anticorpo bem caracterizado e disponível comercialmente.
Proteínas de fusão e imunofluorescência podem localizar proteínas em células
Essa proteína está ligada por um anticorpo que é específico para ela. Em seguida, um segundo anticorpo é adicionado e se liga especificamente ao primeiro, e é o segundo anticorpo, que tem o(s) fluorocromo(s) ligado(s):
Mais sensibilidade (Varios anticorpos pra uma proteína);
Fixação da celular (Morte da célula);
Proteína inalterada (anticorpo especifico para ela).
Proteínas de fusão e imunofluorescência podem localizar proteínas em células
Bibliotecas especializadas de DNA: A clonagem de um cDNA próximo ao gene de GFP cria um construto repórter. A transcrição prossegue por meio do gene de interesse (o cDNA inserido) e o gene repórter (aqui, o de GFP), e o transcrito de mRNA é expresso como uma proteína de fusão.
Proteínas de fusão e imunofluorescência podem localizar proteínas em células
Purificacao de complexos de proteinas Com a construção de bibliotecas de cDNA em que cada gene é fusionado a um marcador de epítopo, os investigadores podem precipitar o produto proteico de um gene por meio de sua complexação com o anticorpo que se liga ao epítopo, processo denominado imunoprecipitação. Se a proteína marcada é expressa em células, outras proteínas que se ligam a ela também precipitam com ela.
Interações proteína-proteína ajudam a elucidar a função de proteínas
http://www.splabor.com.br/blog/cuba-de-eletroforese/o-que-e-eletroforese-saiba-mais/
Interações proteína-proteína ajudam a elucidar a função de proteínas
Fotolitografia para criar um microarranjo de DNA (chip)
Tecnologia de bibliotecas de DNA, a PCR e a hibridização se uniram no desenvolvimento de microarranjos de DNA.
Microarranjos de DNA revelam padrões de expressão de RNA e outras informações
Microarranjos de DNA revelam padrões de expressão de RNA e outras informações
Microarranjos de DNA revelam padrões de expressão de RNA e outras informações
https://www.fetalmed.net/o-uso-do-microarranjo-de-dna-em-medicina-fetal/
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Os microarranjos podem revelar padrões de expressão gênica que se alteram em resposta a estímulos, estágio de desenvolvimento ou condições celulares.
Microarranjos de DNA revelam padrões de expressão de RNA e outras informações
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