Diversidade de anticorpos

Prévia do material em texto

IMUNOLOGIA MÉDICA – Diversidade de Anticorpos________________________________________Karla Daruiz
1
Introdução:
A primeira pergunta que fazemos quando falamos de diversidade de anticorpos é: Como surgem tantos tipos de anticorpos contra tantos antígenos diferentes no nosso organismo? Afinal nós somos capazes de gerar, por exemplo, 100 bilhões de linfócitos B diferentes com anticorpos diferentes. Já a segunda pergunta é: Como existem células específicas para isso?
Duas hipóteses surgiram durante o tempo em que foram teoria, são elas: Teoria de Seleção Clonal e Teoria Instrutiva, porém hoje a que está valendo é a de SELEÇÃO CLONAL. 
 HIPÓTESE INSTRUTIVA
A hipótese instrutiva que um dia foi teoria e atualmente caiu, bate um pouco com a ideia de como o nosso organismo se adapta ao antígeno. Essa teoria acreditava que um linfócito B tinha todos os receptores possíveis dele na membrana, e ao entrar em contato com o antígeno induziria o anticorpo a ser mais ainda produzido. Logo, quanto mais o linfócito B fosse entrando em contato com o antígeno, mais sinais seriam dados para aquele anticorpo específico que passaria a produzir somente aquele anticorpo deixando de produzir todos os outros. Ou seja, o linfócito B produziria o anticorpo de acordo com o antígeno. 
Os problemas dessa hipótese em si é que: Como vamos ter tantos receptores diferentes na mesma célula ? Ou seja, como garantimos que vamos ativar exatamente o receptor que queremos? E isso significaria que teríamos que ter 100 bilhões de sistemas de sinalizações diferentes ligados a cada um dos genes diferentes, ou seja, 100 bilhões também de genes, e não tem como uma célula ter um tamanho de DNA desse tamanho. 
A segunda questão é que se sempre produzimos anticorpos, nós vamos fazendo o nosso linfócito B se tornar específico em contato com o antígeno e teoricamente o nosso soro deveria responder a qualquer doença. Isso quer dizer que, se fizéssemos um teste de anticorpo pra varíola, por exemplo, em um local, daria positivo pra todas as pessoas. Porém, o que de fato acontece é que se fizermos o teste, ele dará negativo. Logo, essa hipótese acaba morrendo por esses dois motivos principais. (o 1º Porque não temos como comportar tanto anticorpo diferentes, sendo cada um deles um receptor com um sistema de sinalização diferente; e o 2º Porque não temos previamente o anticorpo circulando no nosso organismo.)
OBS: Durante um bom tempo se acreditava nessa possibilidade.
HIPÓTESE DA SELEÇÃO CLONAL
Nosso organismo gera muitos linfócitos B e cada um deles vai produzir um anticorpo específico para poder servir no futuro. Logo, na nossa primeira fase de vida, geramos muitas células B com anticorpos diferentes e até o final da dela nós vamos continuar fazendo isso. Isso explica o porque geramos linfócitos B com anticorpos que não vão servir pra nada e nunca vão ser ativados. Ex: Todas as pessoas têm um linfócito B capaz de gerar um anticorpo contra varíola, porém, como não tomamos vacina para varíola e não existe mais varíola no planeta, esse linfócito B só serve pra ocupar espaço dentro do corpo.
Essa hipótese diz então que:
 Cada célula progenitora é capaz de dar origem a vários linfócitos (B ou T), mas cada um deles possui um receptor distinto de antígeno, ou seja, cada linfócito B possui um anticorpo sendo todos eles iguais e servindo para um mesmo antígeno.
Os linfócitos que desenvolvem receptores que se ligam a antígenos próprios são eliminados durante o processo de maturação. (Isso era dito no início dessa hipótese, hoje isso muda um pouco, ou seja, todos aqueles que se ligarem e ativarem automaticamente são eliminados).
 Há a TOLERÂNCIA A ANTÍGENOS PRÓPRIOS. Cada linfócito B basicamente carrega somente um tipo de receptor na membrana capaz de reconhecer antígeno. Isso quer dizer que, pra cada epítopo precisamos deum linfócito B e mesmo que tenhamos 5 linfócitos B, por exemplo, que produzem o mesmo anticorpo, todos eles vieram de uma mesma célula que foi ativada. Ou seja, quando ativamos uma célula nós geramos uma cópia dela. Porém, quando sai o linfócito T do timo e quando sai o linfócito B da medula, eles são únicos e exclusivos. Logo, quando uma criança nasce ela possui uma célula B capaz de responder para sarampo e só quando ela tomar a vacina que ela vai multiplicar essa célula. Porém, quando ela nasce ela só tem apenas UMA célula sendo ativada para aquele epítopo e somente aqueles linfócitos que se encontram com o antígeno serão ativados. Isso quer dizer que, nós produzimos um monte de linfócito T e B, eliminamos os que são perigosos, liberamos ele na circulação (único e exclusivo) e caso encontre seus antígenos, só eles irão ativar e sofrem proliferação. Essa é a ideia da Seleção Clonal !
 Cada linfócito carrega somente um tipo de receptor de membrana capaz de reconhecer antígenos, então um linfócito tem somente UMA especificidade.
Somente aqueles linfócitos que encontram com o antígeno específico para o receptor de membrana sofrerão ativação.
Como que funciona a Hipótese da Seleção Clonal?
Nosso sistema funciona através de células que fazem rearranjos de regiões gênicas. O rearranjo de regiões gênicas que conhecemos é os splincing, porém nesse sistema não é o splincing. O nosso linfócito T faz recombinação somática, ou seja, para gerar região variável ele faz recombinação no DNA da célula, ele tira pedaços inteiros de DNA e joga fora e junta seguimentos para garantir a geração do anticorpo específico. Logo, é por isso que não podemos dizer que se mexermos no DNA a célula morre, já que isso só depende de onde fazemos essa deleção (em locares específicos). 
Ao fazermos então a recombinação gênica, geraríamos as regiões variáveis do anticorpo e fazendo recombinações genicas diferentes, geraríamos anticorpos diferentes. Com isso, falamos em mexer no DNA que é hereditário, ou seja, depois que ele faz essa modificação no DNA, não tem como voltar atrás no anticorpo que ele gerou. Isso significa dizer também que, aquela região variável continua sendo a mesma já que ela não consegue voltar também atrás visto que jogou o DNA fora. Toda cópia então que fizermos de um linfócito B vamos gerar um igual e não linfócitos B com anticorpos de regiões variáveis diferentes, podemos até mudar a cadeia mas a região variável não.
- Nós geramos em torno de 10^11 moléculas diferentes de anticorpo e nesses 10^11, a maioria do nosso repertório é gerado logo no início da nossa vida durante o desenvolvimento das células B por rearranjos do DNA da célula. É por esse motivo que não tem problema nós vacinarmos as crianças logo no início da vida, primeiro mês é BCG e no segundo mês, o bebê já toma várias vacinas simultâneas;
- As sequências de DNA que codificam as regiões V(variável) e C(constante) são separadas por uma distância considerável no genoma;
- Nas células B ocorre a recombinação somática;
- As enzimas responsáveis pela Recombinação são as: RAG-1 e a RAG-2.
LINFÓCITO B
Nós temos a célula tronco hematopoiética que resolve se tornar uma célula progenitora linfoide que continua recebendo sinal e decide se transformar em um linfócito B se localizando na medula e sendo produzido nela. Esse linfócito precisa fazer recombinação somática, no entanto, o pró linfócito vai se proliferar e todos os que vierem dele vão tentar gerar uma cadeia pesada primeiro. Logo, a primeira coisa que o pró linfócito irá fazer é a produção da cadeia pesada e após isso, ele testa a estabilidade dessa cadeia ao expressar na membrana. 
Se ela não der certo, pelo fato de recebermos dois cromossomos (1 do pai e o outro da mãe), a nossa célula vai tentar recombinar o do pai, se não der certo, ele tentará recombinar o da mãe e se continuar dando errado, ela morre. Isso quer dizer que dá trabalho recombinar, ou seja, gasta energia. Porém, se conseguirmos gerar/recombinar a cadeia pesada, seja na primeira ou na segunda tentativa, antes dele recombinar a cadeia pesada, a célula prolifera, e é por isso que podemos ter 3 ou 4 anticorpos, por exemplo,com a mesma cadeia pesada e ligarem a coisas diferentes. Afinal a ligação com o antígeno se dá através da cadeia pesada e da leve e se ele liga na mesma coisa de um lado, ele pode se ligar em coisas completamente diferentes do outro. Ou seja, primeiro ele faz a cadeia pesada, em seguida ele prolifera e aí sim, depois da proliferação ele tenta recombinar a cadeia leve.
Quanto a cadeia leve, nós temos dois tipos: a K e λ. Nosso sistema irá tentar primeiro recombinar a cadeia K, porém, caso a mesma não seja eficiente, a do cromossomo homólogo é recombinado, caso não seja também eficiente, ele tenta a recombinação das duas λ e se nenhuma dessas 4 tentativas derem certo, o clone é eliminado, ou seja, morre. Porém, se ela conseguir ficar estável na membrana, em seguida a célula faz o processo de SELEÇÃO CLONAL.
OBS: Na cadeia pesada, temos 2 tentativas e na cadeia leve temos 4, 2 da Kappa e 2 da Lambda.
Importante Após a recombinação da leve, NÃO HÁ PROLIFERAÇÃO !!! Isso não ocorre por dois motivos. O primeiro é porque a célula pode ser auto reativa e o segundo, é porque ele sai da medula em uma única célula apenas e por isso não tem como proliferar antes.
Resumindo...
Proliferação Recombinação da cadeia pesada Proliferação Recombinação da cadeia leve Seleção Clonal.
Se for auto reativo, na seleção clonal a célula irá morrer. Se for negligente, ou seja, não se ligar a ninguém a célula também morre. Porém, se a célula conseguir passar pela seleção clonal, ou seja, se essa seleção for positiva, ele vai pra circulação, entretanto, apenas UMA célula. Ele só vai proliferar de novo se entrar em contato com o antígeno. O linfócito então, vai sair maduro da medula, porém, virgem (nunca entrou em contato com o antígeno para poder ser ativado).
REGIÕES VARIÁVEIS
Toda a região variável muda entre um anticorpo e outro, sendo que as regiões que mais mudam são aquelas que se ligam ao antígeno. Porém, nosso sistema funciona pela inclusão e inserção de genes específicos que compõe a estrutura de aminoácidos, e, com isso, falamos de regiões gênicas que nossas células escolhem pra poderem trabalhar.
A região variável do anticorpo seja na cadeia leve ou na pesada, vai ter sempre a combinação de uma região gênica. Na cadeia leve essa recombinação dessa região é conhecida como recombinação VJ (V de variável e J de junção). Nós juntamos o seguimento V com o seguimento J. Já a cadeia pesada, ela é conhecida como recombinação VDJ ( V de variável; D de diversidade e J de junção).
No cromossomo 14 de nós seres humanos, temos as regiões V, a região D e logo em seguida, temos a região J. O nosso linfócito B faz o anticorpo através do RAG, que tem o objetivo de juntar uma região V com uma D e uma D com uma J e tudo que estiver no meio entre eles, ela joga fora.
No cromossomo 2, por exemplo, temos a cadeia lambda, várias regiões V e várias J e o nosso sistema escolhe uma V e uma J (não havendo regra em sua combinação, ela é aleatória. Isso quer dizer que cada segmento gênico possui subdivisões, ou seja, regiões que são escolhidas ao acaso em cada segmento na montagem do gene final que vai codificar as cadeias leves e pesadas).
Quando falamos em cadeia pesada, temos 65 regiões V, 27 D e 6 J, logo as recombinações que podemos realizar pra gerar o anticorpo ocorre da seguinte forma Cada região V tem uma numeração (V1, V2, V3, V4 até V65), assim como cada região D (D1 até D27) e cada região J (J1 até J6).
Como a recombinação é aleatória, pode acontecer de ter, por exemplo, V1, D1 e J1 ou, V1, D1, J2, ou V1, D1, J3, ou V1, D1, J4 e assim por diante até todos os números serem combinados, e isso envolve análise combinatória.
Já na cadeia leve, nós temos na K -> 40 V e 5 J e no λ -> 30 V e 4 J
A região variável do anticorpo então, é codificada por mais de um seguimento gênico, no qual juntamos 3 (no caso da cadeia pesada), ou 2 (no caso da cadeia leve).
Como ocorre a sequência de ligação:
Na cadeia pesada Primeiro há uma combinação DJ, uma região J’ se liga a uma região D. Exemplo: J5 se liga ao D27, para isso ocorrer a RAG junta essas duas regiões e tudo que estiver entre eles vai ser retirado e jogado fora. Isso significa que perdemos todas as outras informações gênicas, ou seja, todo mundo entre D27 e J5 é descartado. Logo após isso, o D27 vai se juntar com o V3, por exemplo, e todo mundo que está entre eles também é jogado fora. Com isso, nós formamos um seguimento V3 D27 J5.
OBS: Para cadeias pesadas, podem ser formadas cerca de 11.000 regiões VH.
	,
Na cadeia leve É mais fácil pois só precisamos juntar os seguimentos V e J. Ao ligar, por exemplo, o V1 com J4, todo o resto é descartado. Logo, é por isso que não conseguimos voltar atrás, visto que se o DNA é jogado fora, não temos como retornar. Para gerarmos, então, outro anticorpo precisamos ou usar o cromossomo homólogo ou gerar uma nova célula B.
OBS: Para as cadeias leves k humanas, 200 regiões Vk diferentes podem ser geradas; Já para as cadeias leves λ, 120 regiões Vλ diferentes podem ser produzidas e por fim, cada uma das 320 cadeias leves diferentes pode se combinar com 11.000 cadeias pesadas, originando 3,5x10^6 diferentes especificidades de anticorpo. 
Importante: Nós geramos 3,5x10^11 anticorpos diferentes porque a RAG junta as regiões VDJ e promove os cortes. Porém, para que ocorra a ligação de um DNA no outro é necessário que haja o pareamento, entretanto, a RAG tem um problema, ela não corta em um nucleotídeo específico, seu corte é aleatório e quando ele corta, ele corta a fita dupla de uma vez e não consegue fazer o pareamento do sistema. 
As 3 regiões VDJ são as mesmas, porém, quando a sequência de nucleotídeos muda pode ocorrer a mudança do aminoácido e como a RAG não faz um corte perfeito e age de forma aleatória, na hora do corte do DNA acaba que a junção não seja nunca a mesma. 
Importante: Depois de toda a região V, temos uma sequência de heptameros e nonameros, ou seja, 7 e 9 nucleotídeos que se repetem. O RAG então tem que reconhecer a seguinte condição: 79 e 97 e uma alça de 23 e 12 (essa parte é aleatória), com isso, a RAG junta a região 7,23 e 9 com a região 9,12 e 27. E toda vez que tiver essa condição, a RAG sabe que pode fazer o pareamento, porém, ela não consegue fazer isso sozinha. É isso que garante que não ocorra o pareamento de um V com outro V, e sim a garantia de um pareamento de um V com um D, e de um D com um J.
Então, quando a RAG reconhece essa região ela corta e joga fora todo o resto do DNA, essa é a sua função. Quem fará a ligação do V com o D e do D com J vai ser uma enzima conhecida como TDT, cuja função é gerar dois nucleotídeos que pareiam. Ela vai até o nucleotídeo que não pareia e começa a colocar de forma aleatória nucleotídeos que iram se ligar, porém o problema é que, se há o acréscimo de nucleotídeos, há uma mudança da leitura dos aminoácidos, e esse acréscimo só para quando o pareamento consegue ocorrer e quando isso acontece, ele tira o nucleotídeo extra que está presente e o sistema fecha. Ou seja, se gerarmos áreas de pareamento, ele pareia logo de cara, porém, se essa área de pareamento não for gerada, começamos o que conhecemos de nucleotídeo N (é uma molécula de TDT que insere nucleotídeo de forma aleatória até os dois parearem) e o problema disso é que não sabemos a quantidade de nucleotídeos que serão colocados podendo mudar toda a sequência de leitura do aminoácido ou até mesmo gerar um stop códon. Com isso, não falamos mais de 10^6 e sim de 3,5x10^16 anticorpos diferentes, sendo que a maioria dele não serve pra nada ou é auto reativo sobrando apenas, 3,5x10^11. Isso ocorre por causa da junção aleatória, já que uns vão formar stop códon ou anticorpo inviável e auto reativo.
REGIÕES CONSTANTES
- Os genes da região C mudam na sua progênie quando elas maturam e proliferam no curso de uma resposta imune;
- O primeiro anticorpo produzido numa resposta imune é a IgM;
- Após a mudança de isotipo, a mesma região V é expressa em anticorpos IgG,IgA ou IgE;
- Os genes da região CH alcançam cerca de 200.000 bases na extremidade 3’ do segmento gênico JH.
- O gene da região C que codifica as cadeias m está próximo aos segmentos gênicos JH;
- Imediatamente a 3’ do gene m, localiza-se o gene .
- A co-expressão de IgD e IgM é regulada pelo processamento de RNA;
- A transcrição iniciada no promotor VH estende-se através dos éxons Cm e Cd, para, então ser processado por clivagem, poliadenilação e splicing.
- A troca para outros isotipos ocorre somente após as células B terem sido estimuladas pelo antígeno;
- As regiões de troca (S) localizam-se em um íntron entre os segmentos JH e o gene Cm, e em sítios equivalentes abaixo dos genes C dos outros isotipos;
- A supressão da região de troca (S) por qualquer classe de cadeia pesada induz a uma incapacidade de troca para aquela classe;
- As enzimas que participam do processo de troca de classe não estão bem definidas;
- O Sítio de poliadenilação é fundamental nesse processo.
Formas transmembrana e secretada de imunoglobulinas: 
- Derivam da mesma seqüência de cadeia pesada por processamento alternativo de RNA;
- Cada gene C da cadeia pesada possui dois éxons: MC, que codifica a região transmembrana; e SC, que codifica região carboxi-terminal da forma secretada.
LINFÓCITOS T
A cadeia Beta do TCR equivale a cadeia pesada do anticorpo e a cadeia alfa, equivale a cadeia leve do anticorpo e isso está relacionado a duas questões: a sequência em que é recombinado e o tipo de recombinação. Se o beta é similar a cadeia pesada, ele é recombinado antes. Se temos também 2 tipos de recombinações VDJ e VJ, temos Beta e alfa, respectivamente, sendo que a recombinação VJ acontece depois (alfa que é similar a cadeia leve).
A diferença é que os linfócito T é gerado no timo. A regra se dá a partir de um progenitor que dá origem a vários, sendo que os auto reativos são eliminados e só vai pra circulação os que não forem auto reativos ou os que não forem negligentes, e os que serão ativados serão só aqueles que tiverem contato com o antígeno.
A diferença então, é que os precursores de T são gerados na medula óssea, eles saem da medula e encaminham para o timo, ao entrar, eles começam as recombinações de suas cadeias, faz o teste de seleção clonal e caso seja positivo ele sai do timo em direção a circulação. 
Qualquer linfócito T que se encontra no timo é chamado de timócito, eles proliferam e se diferenciam-se em fases distintas sendo que eles começam lá pelo córtex indo em direção a medula do timo (local onde sofrem seleção clonal).
Essas células T quando chegam no timo, além deles não terem receptor, eles não têm nem CD4 e CD8, ou seja, o linfócito pré-T não chega no timo já sabendo o que ele irá ser, ele aprende a ser CD4 ou CD8 no timo, mais especificamente, durante a seleção clonal. Observamos então duas diferenças: a primeira é que, a maturação do linfócito T ocorre no timo enquanto a maturação do linfócito B ocorre na medula e segunda é que, o objetivo da seleção clonal do linfócito B é eliminar os linfócitos auto reativos e negligentes, enquanto o objetivo da seleção clonal do linfócito T além de eliminar os auto reativos e negligentes é definir se o linfócito T vai ser CD4 ou CD8.
ETAPAS:
Célula tronco virá pré-T e essa célula vai para o timo. Ao chegar, a primeira coisa que ela faz é se proliferar, em seguida tentará recombinar a cadeia Beta (recombinação VDJ). Após isso, haverá o teste na membrana pra ver se está tudo bem com a alfa provisória, se estiver estável, haverá a proliferação dessa cadeia. Depois disso, vai ocorrer a tentativa da recombinação da cadeia alfa que irá ser testado na membrana, se estiver estável fará em seguida, a seleção clonal. 
OBS: No momento em que a célula tem receptor pronto, ela vai pra seleção clonal com esse receptor CD4 e CD8 (é a célula duplo positivo) e ao passar pela seleção clonal, esse linfócito irá decidir se será CD4(quando for ligado a MHCII) ou CD8 (quando for ligado a MHCI). Ao sair do timo, ele já não é mais duplo positivo, ou ele é TCD8 ou TCD4.
Diferenças : 
- Na cadeia leve, nós temos 4 tentativas pra gerar uma cadeia leve funcional, já no TCR não temos. Nele temos: 2 para cadeia beta e 2 para a cadeia alfa apenas;
- A região variável do TCR está em outro cromossomo em outra região, ou seja, nós temos uma região exclusiva VDJ e VJ pra cadeia pesada e leve do anticorpo e temos regiões exclusivas VDJ e VJ para o TCR;
- Temos muito mais regiões J para TCR do que para anticorpo, principalmente, na cadeia alfa.
OBSI: A recombinação ocorre da mesma forma, primeiro recombinamos a cadeia VDJ pra fazer a cadeia beta, pra depois recombinarmos a cadeia VJ pra fazer a cadeia alfa.
OBSII: A RAG também funciona da mesma forma, isso quer dizer então, que o sistema vai ter variabilidade aumentada devido a TDT.
ESTIMATIVAS DA ADVERSIDADE:
A diferença entre anticorpo e TCR:
Anticorpo Cadeia pesada tem 51 regiões variáveis, 30 de diversidade e 5 de junção.
Já a cadeia leve (K e λ juntos) tem 69 variáveis, 5 de junções e se juntarmos tudo, dá em torno de 10^16 anticorpos diferentes.
TCR Na cadeia Beta tem 52 regiões variáveis, 2 de diversidade e 13 de junções. Já na cadeia alfa, tem mais de 70 regiões variáveis e 61 de junções. Isso significa que TAMBÉM serão gerados em torno de 10^16 anticorpos diferentes. Logo, falamos de um conjunto muito grande de linfócitos T e B, no entanto, a maioria deles é eliminado ou por negligência ou por auto reatividade, como visto antes, sobrando apenas 10^11.