ATIVIDADES TEÓRICAS E PRÁTICAS DESENVOLVIDAS NA APLICAÇÃO DE TECNÍCAS PARA O PROCESSAMENTO DE MATERIAS BIOLÓGICOS DESTINADOS À ANALISE POR MICROSCÓPIA ELETRÔNICA

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INSTITUTO OSWALDO CRUZ 
LABORATÓRIO DE BIOLOGIA ESTRUTRAL 
CURSO TÉCNICO EM BIOTECNOLOGIA 
 
 
 
 
 
 
LORRAN FARIA DO NASCIMENTO 
 
 
 
 
 
 
ATIVIDADES TEÓRICAS E PRÁTICAS DESENVOLVIDAS NA APLICAÇÃO DE 
TECNÍCAS PARA O PROCESSAMENTO DE MATERIAS BIOLÓGICOS 
DESTINADOS À ANALISE POR MICROSCÓPIA ELETRÔNICA 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Rio de Janeiro 
2018 
 
 
LORRAN FARIA DO NASCIMENTO 
 
 
 
 
 
 
ATIVIDADES TEÓRICAS E PRÁTICAS DESENVOLVIDAS NA APLICAÇÃO DE 
TECNÍCAS PARA O PROCESSAMENTO DE MATERIAS BIOLÓGICOS 
DESTINADOS À ANALISE POR MICROSCÓPIA ELETRÔNICA 
 
 
 
Relatório técnico apresentado ao Curso Técnico 
 em Biotecnologia do Instituto Oswaldo Cruz 
 
 
 
 Orientadora: Suzana Côrte-Real Faria 
 Coordenadora de área: Suzana Côrte-Real Faria 
 Laboratório: Laboratório de Biologia Estrutural 
 Coordenadores do Curso: Paulo Roberto Soares Stephens 
 Dário Eluan Kalume 
 
 
 
 
 
 
 
 
Rio de Janeiro 
2018 
 
 
RESUMO 
 
 A microscopia eletrônica é uma importante ferramenta para obtenção de 
informações detalhadas de espécimes biológicos e de materiais não biológicos. Os 
microscópios eletrônicos utilizam elétrons para gerar os sinais que são convertidos 
em imagens com grande quantidade de informações. O processamento das amostras 
biológicas para se adequarem as condições adversas que a coluna de um microscópio 
eletrônico oferece, é uma etapa fundamental para que elas estejam aptas a terem 
suas informações ultraestruturais devidamente analisadas com a menor interferência 
possível do equipamento durante a análise. Fatores como a qualidade dos reagentes 
químicos e perícia na realização das técnicas se mostraram altamente relevantes pela 
sua importância em gerar boas condições finais que o material se apresentará ao ser 
visualizado no microscópio. O processamento das amostras biológicas para 
microscopia eletrônica é uma área técnica que necessita de diversos conhecimentos 
acerca das características dos espécimes. Uma detalhada descrição das etapas, 
métodos e técnicas observados e trabalhados durante o acompanhamento dos 
processos laboratoriais os quais os espécimes são submetidos é fundamental para 
uma proveitosa compreensão da complexidade de fatores presentes nas técnicas 
aplicadas para o processamento de amostras biológicas para analise por microscopia 
eletrônica. 
Palavras chaves: amostras biológicas, processamento, microscopia eletrônica de 
varredura (MEV), microscopia eletrônica de transmissão (MET). 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
SUMÁRIO 
 
 
 
 
1 INTRODUÇÃO..........................................................................................................4 
1.1 CONCEITOS..........................................................................................................4 
2 DESENVOLVIMENTO..............................................................................................9 
2.1 OBJETIVO GERAL................................................................................................9 
2.1.1 Objetivos específicos.......................................................................................9 
2.2 METODOLOGIA...................................................................................................10 
2.3 PROCEDIMENTOS EXPERIMENTAIS................................................................10 
2.3.1 Processamento para MEV..............................................................................13 
2.3.2 Processamento para MET..............................................................................19 
2.4 RESULTADOS.....................................................................................................21 
3 CONCLUSÕES.......................................................................................................23 
4 REFERENCIAS.......................................................................................................25 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
4 
 
1 INTRODUÇÃO 
 
 No final do século XIX, os cientistas se depararam com as limitações da 
microscopia de luz, pois sua resolução estava condionada pelo comprimento de 
onda das radiações visíveis ao olho humano. 
Uma microscopia alternativa que pudesse oferecer mais informações e com 
maior qualidade foi desenvolvida anos depois utilizando elétrons acelerados, os 
elétrons de alta energia podem associar-se a comprimentos de onda muito mais 
baixos do que aqueles apresentados pelas radiações luminosas que compreendem 
a luz visível. De Broglie, em 1925, mostrou o dualismo onda-partícula e, por 
conseguinte, que o comprimento de onda de um elétron é função de sua energia. “A 
energia pode ser comunicada a uma nova partícula carregada por meio de um 
campo elétrico acelerador. Assim, sob uma voltagem suficientemente grande, por 
exemplo, 10 kV, elétrons de comprimento de onda extremamente curto (λ=0,005Å) 
e, portanto, de poder de resolução potencialmente alto como uma fonte de 
iluminação, podem ser produzidos. ” (DE BROGLIE, 1925) 
 Historicamente, a microscopia eletrônica teve seu início com o trabalho de M. 
Knoll (1935), descrevendo a concepção do microscópio eletrônico. Anos depois, O 
microscópio eletrônico de transmissão (MET) foi introduzido como instrumento de 
pesquisa por volta de 1950 e sua utilização trouxeram contribuições marcantes ao 
conhecimento humano, ao mostrar detalhes jamais antes visualizados na área 
biológica e de ciência de materiais. 
As especificações desses equipamentos convencionais oferecem barreiras 
para a análise de amostras biológicas, uma delas é que estes não podem ter a 
presença de água no interior de sua coluna. 
 Sendo assim, as amostras biológicas para serem analisadas precisam passar 
por diversos procedimentos para adaptá-las as condições do microscópio eletrônico. 
Para microscopia eletrônica de transmissão: 1- o material biológico deve estar incluído 
em material resistente ao aquecimento provocado pela passagem do feixe de elétrons; 
2- o material deve ter espessura ideal de 60 a 90 nm; 3- o material deve ter contraste 
para que ser observado. 
 
 
5 
 
1.1 CONCEITOS 
 
As etapas comuns ao processamento dos dois equipamentos que serão 
abordados, Microscópio Eletrônico de Varredura (MEV) e Microscópio Eletrônico de 
Transmissão (MET), são: fixação, pós-fixação, desidratação. 
A partir da desidratação, as amostras são destinadas ao processamento 
especifico de cada equipamento. Para o MEV as amostras passam pelo ponto critico 
e pela metalização, já para o MET elas são incluídas em uma resina, os blocos 
gerados sofrem debastamento e são cortados em finíssimas secções e as secções 
são contrastadas. 
As soluções tampão utilizadas durante os primeiros procedimentos tem papel 
fundamental na preservação adequada das amostras. Os tampões mais comuns para 
microscopia eletrônica são o PBS e o cacodilado de sódio. O PBS por ser um tampão 
compatível com as condições naturais de manutenção do equilíbrio de pH e 
osmolaridade das células é utilizado para lavagem do material antes de começar o 
procedimento para microscopia eletrônica.O tampão cacodilato de sódio é o que 
oferece melhor preservação das estruturas tissulares das amostras biológicas e o 
melhor veículo para os fixadores que irão preservar as estruturas tissulares das 
amostras. Os tampões podem ser suplementados com elementos que adequem a sua 
osmolaridade (por exemplo, a sacarose), para melhorar a difusão do tampão e não 
causar danos as estruturas celulares (tornando-o isotônico). O ferrocianeto de 
potássio e cloreto de cálcio adicionados no tampão cacodilato de diluição do tetróxido 
de ósmio possuem, respectivamente, as funções de destacar as membranas 
biológicas quando observadas por microscopia eletrônica e favorecer a atuação do 
pós fixador sobre a amostra. É importante que as soluções e reagentes utilizados 
estejam refrigerados a uma temperatura aproximada de 4 °C (temperatura de 
geladeiras comuns) para que se minimize o efeito da temperatura sobre as estruturas 
conservadas. 
 “A fixação é o processo pelo qual se obtém estabilização das estruturas 
celulares e intercelulares. O que se busca é a preservação da morfologia das 
biomacromoléculas, suas relações topológicas, bem como da fase aquosa com os 
respectivos solutos, da forma que os mesmos se encontram in vivo. ” (ALVES, 2004, 
p.17) 
6 
 
“Depois de fixados os espécimes biológicos podem suportar melhor os 
traumáticos eventos impostos pelo M.E., ou seja, o extremo vácuo e o intenso 
aquecimento provocado pelo feixe de elétrons”. (ALVES, 2004, p.18) 
O Glutaraldeído é um excelente fixador e um dos mais empregados, devido a 
sua capacidade de penetração e incorporação irreversível nas estruturas proteicas, o 
que estabiliza as estruturas. Em cada sitio reativo para a fixação, várias moléculas do 
fixador são aderidas, o que oferece ótima preservação da ultraestrutura. 
 A pós-fixação com tetróxido de ósmio funciona como uma segunda fixação, 
sendo um agente com oito grupamentos ativos os quais reagem com lipídeos, 
proteínas, ácidos nucléicos e polissacarídeos, resulta em uma trama tridimensional 
que estabiliza a estrutura da célula. A pós-fixação é necessária porque o glutraldeído 
não é um bom fixador de lipídeos e o tetróxido de ósmio ainda é capaz de contrastar 
a região interna da célula, devido a sua capacidade de espalhamento dos elétrons. 
 “Antes de realizar as etapas de ponto crítico durante o processamento para o 
MEV e de inclusão em resina para o MET é necessário retirar toda a água do sistema 
biológico, o que deve ser feito de maneira gradual. Modificações bruscas podem levar 
ao colabamento das finas projeções citoplasmáticas, afetando a estrutura celular. 
Após a fixação, o material deve ser bem lavado, com tampão caso o fixador seja 
tamponado ou com água caso não o seja, iniciando-se em seguida a desidratação 
com banhos sucessivos de concentrações crescentes de um agente adequado que 
substitua a água e a elimine do espécime. Os agentes desidratantes mais usados são 
o etanol e a acetona.” (GROSS; PIRES; FERNANDES, 2014) 
 ”A secagem final da amostra para observação no MEV será feita sobre 
condições tais que por ela não passe um menisco de transição de fases evitando as 
forças resultantes da tensão superficial. Isto é obtido na câmara de ponto crítico (em 
inglês CPD-Critical Point Dryer, no caso um BalTec CPD 030), geralmente utilizando-
se dióxido de carbono como agente de troca. Sabe-se que para cada fluido, existe 
uma condição de temperatura e pressão característica, em que as fases líquida e 
gasosa do fluido não podem coexistir; esta combinação corresponde ao ponto crítico 
do fluido.” (GROSS; PIRES; FERNANDES, 2014) 
 “O espécimen seco precisa ser montado de modo adequado no suporte porta-
a mostras do MEV, ou, stub, ajustando-se a melhor orientação em relação o feixe de 
elétrons e ao coletor. Vários tipos de adesivos podem ser usados nesta montagem: 
7 
 
cola de prata coloidal, fita adesiva dupla face, esmalte de unha contendo carbono 
coloidal, etc.” (DE SOUZA; et al, 2015, p.57) 
 A última etapa do processamento para o MEV é a cobertura metálica. 
 “Visa prover ou aumentar a condutividade da superfície da amostra, bem como 
aumentar a emissão de elétrons desta, através de uma fina camada metálica (até 20-
30 nm de espessura).” (DE SOUZA; et al, 2015, p.57) 
 “O processo mais eficaz de deposição é através de um sistema de evaporação 
conhecido como “sputtering”. Neste, o metal é removido do alvo (eletrodo negativo ou 
catodo do sistema), por bombardeamento com íons pesados de argônio; os átomos 
de ouro são ejetados e se depositam na forma de um filme contínuo sobre todas as 
reentrâncias e proeminências da superfície da amostra.” (DE SOUZA; et al, 2015, 
p.58) 
 Os Microscópios Eletrônicos de Varredura convencionais, em sua maioria, 
operam com a interação amostra-feixe de elétrons ocorrendo em alto vácuo. O 
equipamento pode utilizar de diversos sensores acoplados para captar os sinais 
gerados por essa interação eletrônica e transformá-los em informação (imagem ou 
gráfico, por exemplo). 
 “Na microscopia eletrônica de varredura os sinais de maior interesse para a 
formação da imagem são os elétrons secundários e os retroespalhados. A medida que 
o feixe de elétrons primários vai varrendo a amostra estes sinais vão sofrendo 
modificações de acordo com as variações da superfície. Os elétrons secundários 
fornecem imagem de topografia da superfície da amostra e são os responsáveis pela 
obtenção das imagens de alta resolução, já os retroespalhados fornecem imagem 
característica de variação de composição.” (MALISKA, p.4) 
 “Após a desidratação, o espécime a ser analisado em MET deve ser incluído 
em um material que permita a posterior obtenção de cortes ultrafinos. Este material 
deve apresentar boa estabilidade quando submetido ao feixe eletrônico e permitir uma 
contrastação adequada. Várias substâncias são utilizadas como agentes de inclusão, 
sendo as resinas as mais conhecidas.” (GROSS; PIRES; FERNANDES, 2014) 
 “As resinas epóxi sob os nomes comerciais de EPON 812, EPIKOTE, EMBED 
ou POLYBED são equivalentes, e largamente usadas atualmente. A resina básica é 
misturada com DDSA (anidrido dodecenil succínio) e MNA (anidrido metil nádico) 
segundo as formulas de Luft (1961) acrescentando-se 1,5% em volume, de um 
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catalisador, DMP-30 (2, 4, 6 – tridimetilaminametilfenol).” (DE SOUZA; et al, 2015, 
p.39) 
 As amostras infiltradas em resina devem ser distribuídas em moldes e levadas 
a uma estufa, a resina solidificada torna os blocos rígidos e destacáveis do suporte. 
 Os blocos obtidos são destinados ao processo de ultramicrotomia para serem 
cortados em fatias semifinas (300 a 380 nm) ou ultrafinas (60 a 90 nm). 
 Utiliza-se uma lamina afiada de diamante ou de vidro para realizar as secções 
que podem ser facilmente identificadas ao boiar no espelho de água formado no 
suporte da navalha, de acordo com a coloração que o corte apresenta; cinza (60 a 80 
nm), dourado (90 a 150 nm), roxo (150 a 190 nm), azul (190 a 240 nm) e verde (acima 
de 240 nm). 
 
Figura 1 – tabela de espessura dos cortes que boiam sobre um espelho de água de 
acordo com suas cores. Fonte: Lorran Faria. 
 
 Os cortes semifinos são recolhidos com um recolhedor de cortes que pode 
tanto ser uma alça bacteriológica quanto um pequeno pedaço de madeira com um 
cílio colado em uma de suas extremidades. Os cortes são corados com azul de 
toluidina ou azul de metileno e ao serem analisados em um microscópio de luz 
permitem selecionar uma pequena área de interesse em uma vasta região do material 
emblocado para serem realizados cortes ultrafinos. 
9 
 
O bloco é debastado novamente de modo a restringir a sua face a apenas o tamanho 
que abranjaa região de maior interesse. Os cortes ultrafinos são recolhidos por 
aderência com grades feitas de cobre, níquel ou ouro de diâmetro padrão de 3 mm e 
sofrem contrastação com acetato de uranila e citrato de chumbo. 
 
Figura 2 - Alguns tipos de grades com granulações diferentes. Fonte: Suzana Cortê-
Real. 
 
 “Amostras biológicas, caracteristicamente, possuem pouco contraste devido 
aos elementos, predominantes em sua composição serem de número atômico baixo. 
Para intensificar o contraste dos cortes ultrafinos, os cortes são incubados em 
soluções de sais de metais pesados que reagem com os componentes celulares. ” 
(DE SOUZA; et al, 2015, p.47) 
 O acetato de uranila reage com vários componentes celulares, especialmente 
ácidos nucleicos devido a tendência do acetato de uranila de precipitar na presença 
de fosfato, já o citrato de chumbo apresenta um comportamento de precipitar próximo 
a superfícies com pH acido. 
 Após as grades serem lavadas e secarem a temperatura ambiente, elas são 
cuidadosamente posicionadas no suporte do MET, e analisadas no equipamento. 
 “O fundamento do MET consiste na geração de um feixe de elétrons, o qual é 
transmitido através de uma amostra suficientemente fina (transparente ao feixe). Os 
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feixes resultantes da interação com a amostra combinados através da lente objetiva 
vão trazer informação interna do material analisado como morfologia, estrutura 
cristalina, defeitos etc.” (MENDONZA OLIVEROS, 2012, p.50) 
 
 
2 DESENVOLVIMENTO 
 
 
2.1 OBJETIVO GERAL 
Descrever, discorrer e realizar os procedimentos de processamento de 
amostras biológicas para microscopia eletrônica, desde os processos iniciais de 
fixação do material até a análise no microscópio eletrônico 
 
 
2.1.1 Objetivo específico 
 Demonstrar o domínio prático e teórico adquirido das técnicas de 
processamento de material biológico para a microscopia eletrônica. 
 
 
2.2 METODOLOGIA 
 Acompanhamento de técnicos de laboratório que possuem conhecimento e 
experiência na área durante a realização das etapas de processamento da amostra. 
Comparação entre protocolos estabelecidos como referência pelo 
laboratório/plataforma ou adaptados pela experiência do técnico, e utilizando 
variações que busquem melhor adequar uma amostra com suas particularidades. 
Realização de tais etapas por mim (autor do trabalho) até que se fosse adquirido 
domínio das técnicas. 
 
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2.3 PROCEDIMENTOS EXPERIMENTAIS 
Inicialmente lava-se 2 vezes com PBS e uma pipeta pasteur descartável o 
material para MEV e MET, garantindo que o tampão permeie todo o material retirando 
os resíduos. O processo é realizado Independente do material estar aderido a uma 
superfície ou não, caso esteja em lamínulas com as dimensões correspondentes aos 
stubs (10x10mm ou 10x12mm) ou colocado em placas ou garrafas, com células 
aderidas, estes serão facilmente lavados para retirar os resíduos que ainda estejam 
no material. 
O Material aderido em lamínulas pode permanecer nelas durante o 
processamento químico (processamento para MEV), ou seja, não é necessário a 
utilização de métodos para tornar a amostra suspensa em solução (processamento 
para MET). 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Figura 3 - Pipetas pasteur descartáveis de plástico apoiada em suporte de 
isopor. Fonte: Lorran Faria. 
 
Após a lavagem inicial, o material é transferido para tubos de centrifugação e 
sedimenta após ser submetido a centrifugação à 4500 rpm por 10 minutos para que 
o material concentrado seja exposto a um reagente (MET) ou é mantido em placa de 
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petri para ser coberto pela solução fixadora (MET). Com uma pipeta pasteur cobre-
se o material com 2,5% de glutaraldeído diluído em 0,1M de tampão cacodilato de 
sódio (pH 7,2) à 4°C (armazenado em geladeira), a fixação do material deve ser 
realizada imediatamente antes ou depois da morte dos espécimes. O material 
concentrado em tubos deve ser resuspendido junto da solução fixadora por meio de 
um agitador do tipo vortex. O material é mantido na geladeira por uma hora. 
O material que está no tubo é concentrado e o sobrenadante desprezado. Após, 
realiza-se 3 lavagens com 6 mL do tampão cocadilato + 3,5% de sacarose no sistema 
resuspender, concentrar, desprezar sobrenadante e iniciar nova lavagem. Ao final 
adiciona-se quantidade de pós fixador tetróxido de ósmio a 1% em 0,1 M de tampão 
cacodilato de sódio + 0,8% Ferrocianeto + 5 mM CaCl2 à 4°C o suficiente para cobrir 
a amostra, 400 μL são suficientes para material concentrado em tubos de centrifuga. 
Embala-se os tubos ou a placa de petri com papel alumínio O material embalado é 
mantido na geladeira por uma hora. 
 
Figura 4 – Papel alumínio que foi usado para acondicionar da luz, tubos com 
material em processo de pós fixação. Fonte: Lorran Faria. 
 
 
 
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2.3.1 Processamento para MEV 
Para a amostras destinada ao MEV, concentra-se o material e despreza-se o 
sobrenadante. Após, realiza-se 3 lavagens com 6 mL do tampão cocadilato + 3,5% de 
sacarose no sistema já realizado anteriormente. O material deve atender a condição 
de ter sido cultivado sob lamínulas de vidro com tamanho correspondente aos stubs 
ou foi aderido em pequenas quantidades nessas lamínulas usando um revestimento 
de poli-L-lisina, as lamínulas, posteriormente, são aderidas nos stubs usando cola com 
propriedades condutoras. Essas lâminas são organizadas em um porta amostra de 4 
cavidades cilíndricas, próprio para o equipamento de ponto crítico, o porta amostra 
com as laminas é inserido dentro de um Becker de altura e área da base superiores 
ao porta amostra. 
 
Figura 5 – Esquema para registro e orientação do técnico ao realizar a 
desidratação de muitos códigos (materiais diferentes). Fonte: Lorran Faria. 
 
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Figura 6 – Placa de 24 poços devidamente identificada, com o material aderido 
a lamínulas no interior de 6 dos 24 poços. Porta amostra de 4 cavidades cilíndricas, 
próprio para o equipamento de ponto crítico. 
O material é desidratado gradualmente, adiciona-se ao Becker quantidade de 
etanol 30% até que o porta amostra seja coberto. Aguarda-se pelo menos 10 minutos 
e retira-se o porta amostras do Becker com uma pinça, o colocando cuidadosamente 
sobre folhas de papel toalha. Descarta-se o etanol presente no Becker, retorna-se o 
porta amostras para o Becker e adiciona-se etanol de concentração mais elevada 
(etanol 50%). O processo é repetido até que se chegue no etanol 100%, ao final o 
material devera ter passado pelo etanol 30%, 50%, 70%, 90%, 100% pelo menos uma 
vez, retira-se o porta amostras e descarta-se o etanol 100%, retorna-se ele para o 
Becker e adiciona-se etanol 100% novamente, o Becker é vedado com Parafilm e é 
transportado para o equipamento de ponto crítico. 
Antes de ligar o aparelho que realiza o ponto crítico com CO2, liga-se o 
condensador que esta conectado ao aparelho, liga-se o aparelho e aguarda-se 5 
minutos ate a inicialização dele, abre-se o cilindro de CO2 e a câmara do equipamento 
(desenroscando os parafusos da tampa), adiciona-se um pouco de etanol 100% a 
câmara, com uma pinça retira-se o porta amostras de dentro do Becker e o posiciona 
15 
 
dentro da câmara, adiciona-se etanol 100% até atingir a marcação na parede interna 
da câmara, a tampa da câmara é fechada e pressiona-se o botão COOL, aguarda-se 
até que a temperatura esteja abaixo de 0°C no visor à direita do equipamento, 
pressiona-se FILL, e aguarda-se que a pressão atinja marca entre 700 e 800 na tela 
à esquerda do equipamento, marca-se o cilindro (para fins de controle de volume 
dele), aguarda-se período por volta de40 minutos, quando o aparelho marcar 0 de 
pressão, temperatura próxima a 40°C e botão VENT ligado fecha-se o cilindro de CO2, 
desliga-se o equipamento, condensador e filtro de linha, abre-se a câmara da tampa 
e retira-se o porta amostras com uma pinça, o porta amostras é colocado em um 
Becker, fecha-se a tampa da câmara. 
 
Figura 7 - Equipamento que realiza o ponto crítico, um AUTOSAMDRI-815. 
Fonte: Lorran Faria. 
 
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Figura 8 – Cilindro de CO2 com marcado com a quantidade usos para o 
controle da qualidade e disponibilidade do reagente. Fonte: Lorran Faria. 
 
De posse dos stubs (suportes de materiais do MEV), retira-se com uma pinça 
o porta amostras do Becker, e aos poucos deve-se retirar as lamínulas e os anéis que 
as acomodam e separam no porta amostra calmamente para não danificá-las. Com 
fita adesiva dupla face adere-se as lamínulas nos stubs e cobre-se metade das 
lamínulas da face do material com a fita, a fita é retirada e junto dela parte do material 
daquela região é retirado, a região da fita com material aderido é colocado sobre o 
stub e cortado até apenas a face do stub, os stubs com o material são pressionados 
em um pedaço de isopor até estarem com pelo menos metade de suas alturas no 
isopor, o isopor é colocado em um pote com sílica-gel e transportado para o 
metalizador. 
 
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Figura 9 - Ferramentas e materiais necessários para operação dos 
equipamentos que realizam o ponto critico e a metalização. Fonte: Lorran Faria. 
 
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Figura 10 – Sílica gel autoclavada. Fonte: Lorran Faria. 
 
Abre-se a câmara do equipamento retirando-se a tampa, retira-se pela parte 
externa a proteção de vidro da câmara, a depositando sobre papel toalha na mesa, 
com uma pinça posicionar os stubs sobre a placa metálica do aparelho, o equipamento 
é remontado, liga-se o aparelho (botão POWER), o tempo do metalizador é ajustado 
para dois minutos, pressiona-se os botões PAUSE e SET ao mesmo tempo, aguarda-
se que pressão no interior da câmara atinja valor inferior a 0,1 mbar, pressiona-se 
START, deve-se manter a corrente em 30mA (em caso de oscilação ajustar utilizando 
o botão localizado no lado esquerdo na parte de trás do aparelho), ao termino dos dois 
minutos pressiona-se POWER, a válvula localizada em cima da tampa é puxada 
preenchendo câmara com ar, abre-se a câmara, com uma pinça retira-se os stubs 
que são devolvidos ao isopor, antes de fechar o aparelho limpa-se a parte interna do 
vidro com papel toalha e o aparelho é fechado. 
 
Figura 11 - Equipamento que realiza a metalização com partículas de ouro, 
um CRESSINGTON SPUTTER COATER 108. Fonte: Lorran Faria. 
 
 
 
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2.3.2 Processamento para o MET 
O material para ser analisado no MET deve atender a condição de ter sido 
transferido para um tubo de centrifuga, após a lavagem do material pós fixado, o 
material é desidratado gradualmente, adiciona-se acetona 30% até completar 6 mL 
no tubo contendo o material, centrifuga-se os tubos à 4500 rpm por 10 minutos, 
descarta-se o sobrenadante e adiciona-se acetona 50%, a desidratação segue no 
sistema resuspender, concentrar, desprezar sobrenadante e adicionar acetona mais 
concentrada. O processo é repetido até que se chegue na acetona 100%, ao final o 
material deverá ter passado pela acetona 30%, 50%, 70%, 90%, 100% pelo menos 
uma vez, a desidratação com acetona 100% é repetida mais duas vezes, descarta-se 
a acetona, com uma pipeta de plástico aplica-se resina diluída 1:1 em acetona 100%, 
resuspender-se o material, armazena-se o material em geladeira até o dia seguinte 
(overnight), os tubos são centrifugados à 4500 rpm por 10 minutos, retira-se metade 
da resina presente no tubo(sem retirar o material) e transfere-se para microtubo, o 
material presente no tubo com resina é transferido para capsulas BEEM, transfere-se 
resina do microtubo para as capsulas BEEM o suficiente para que a preencha quase 
completamente, as capsulas BEEM são colocadas em microtubos e são centrifugadas 
em centrifuga de microtubos a 6000 rpm por 5 minutos quantas vezes forem 
necessárias ate o material ficar concentrado no centro do fundo da capsula, com uma 
pipeta de plástico de abertura menor retira-se cuidadosamente a resina em volta do 
material que está dentro de capsula (descarta-se a resina), adiciona-se 
cuidadosamente resina pura aos tubos até quase preencher as capsulas, insere-se 
nas paredes internas da capsula uma tira de papel com o código de identificação da 
amostra, as capsulas fechadas são colocadas em suporte e vão para forno de 
polimerização à mais de 60 °C por 72 horas. 
 
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Figura 12 - Capsula BEEM inserida dentro de microtubo para que se pudesse 
encaixar em centrifuga. Fonte: Lorran Faria. 
 
 
Figura 13 - Resina pura à temperatura ambiente armazenada em seringa. Fonte: 
Lorran Faria. 
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De posse das capsulas com a resina já polimerizada (rígida), destaca-se o 
bloco de resina da capsula, os blocos são colocados em sacos de papel, identificados 
e são transportados para a ultramicrotomia. 
Em um ultramicrotomo posiciona-se o bloco no suporte especifico para ele. 
Liga-se a fonte de luz superior. Após, observa-se em maior aumento na ocular do 
ultramicrotomo, analisa-se a distribuição espacial do material no bloco. Com uma 
lamina de metal são realizadas secções rentes ao bloco em suas laterais de modo a 
esculpir um tronco de pirâmide no bloco e uma face de trapézio no topo, com navalha 
de metal nova e livre de dentes é realizado uma seção horizontal no topo da pirâmide 
onde o material, agora, se encontra mais a mostra por causa do debastamento. O 
corte no topo do material deve formar um plano horizontal o mais próximo possível de 
estar a 90° da vertical e deve ficar espelhado (corte preciso e coerente com apenas 
um plano de corte). 
 
 
Figura 14 – Ultramicrotomo; Bloco de resina preso em seu suporte, logo atrás do 
suporte tem-se o braço do ultramicrotomo. Fonte: Lorran Faria. 
 
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Figura 15 – Observação do bloco no ultramicrotomo. Fonte: Lorran Faria. 
 
 
Figura 16 - Navalhas de metal. Fonte: Lorran Faria. 
 
O suporte com o bloco é preso no braço do ultramicrotomo, deve-se garantir 
que o suporte esteja alinhado verticalmente na visão de frente para o operador, 
posiciona-se o suporte da navalha, cuidadosamente retira-se a cuba de sua caixa pela 
parte traseira inferior dela e a posiciona no suporte. Aproxima-se o suporte com a cuba 
do bloco até estarem próximos o suficiente para serem visualizados em um mesmo 
campo na ocular de aumento médio. Observando na ocular, aproxima-se o suporte do 
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bloco o suficiente para que se possa observar tanto a cuba quanto o bloco no mesmo 
campo. Desliga-se a fonte de luz superior e liga-se a fonte de luz inferior. Foca-se a 
ocular no gume da navalha. Posiciona-se o meio da face do bloco de frente para o 
gume da navalha. É visualizado na face do bloco um feixe de luz irregular. Utiliza-se 
o cursor de aproximação leve do aparelho (APPROCH) e a variação da posição 
vertical do bloco no espaço em relação a navalha estática para mensurar o que 
distorcido o feixe de luz que atravessa o espaço entre o gume da navalha e o bloco 
esta, com base nas distorções visualizadas, realiza-se correções na angulação em 
relação ao próprio eixo da cuba da navalha no plano horizontal (variação máxima 
permitida de 2° a partir do 0°) e do bloco no plano vertical e horizontal em torno do 
seu eixo até que se visualize um pequeno, homogêneo, retilíneo feixe de luz que 
ilumina a face do bloco de forma igual ao ter o bloco variando sua posição na vertical. 
O fim da face do blocoé posicionado a cima do gume da navalha, indica-se para o 
aparelho onde começa o corte (START), posiciona-se o começo da face abaixo do 
gume da navalha e indica-se o fim do corte (END). 
Liga-se a luz da fonte superior e diminui-se o aumento da ocular para o menor, 
o foco da ocular é colocado no gume da navalha. Com uma pipeta pasteur de plástico 
adiciona-se agua destilada na cuba até que se forme nela um espelho de água que 
cubra o gume da navalha. O aparelho é configurado com espessura de cortes de 210 
nm e velocidade de corte de 2 mm/s. Pressiona-se o botão CUT e o braço do 
ultramicrotomo começa a se aproximar realizando as janelas de corte de inicio e fim 
que foram colocadas no aparelho. O bloco gradualmente se aproxima do gume da 
navalha até que eles entram em contato, a navalha começa a nivelar a face da 
piramidade retirando partes da face ate que ela fique completamente reta e sem 
imperfeições em sua superfície. Após nivelar a face, a navalha começa a realizar os 
cortes que boiam na água e podem ser identificados quanto a sua grossura de acordo 
com a cor que apresentam ao flutuarem no espelho da água. 
 Pressiona-se CUT para parar a movimentação do braço, aumenta-se a 
espessura do corte, volta-se a realizar o corte, repetindo esse processo até que se 
atinja a espessura ideal de 300 a 380 nm para os cortes semifinos. Após atingir 
espessura desejada, recolher os cortes da espessura de interesse com recolhedor de 
cortes e depositar sobre gota de água destilada em lâmina de microscopia, seca-se a 
gota em placa aquecedora até que os cortes se depositem na lâmina, os cortes são 
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imersos com gotas de azul de toluidina a 1%, cobre-se a lamina com placa de petri 
revestida com papel alumínio, e aguarda-se 5 minutos, o corante é seco em placa 
aquecedora até que se forme um anel em esverdeado em volta da gota do corante, 
no momento que se forma a lamina é lavada em fluxo continuo de um fio de água de 
uma pia. Seca-se a lâmina e observa-se os cortes em microscópio de luz. 
 
 
Figura 17 - Cortes boiando no espelho de água formado no suporte da navalha e 
sendo recolhidos com um recolhedor de cortes. 
 
Nos cortes semifinos são localizadas as áreas de maior interesse em cada um 
para que sejam realizados cortes ultrafinos. Os blocos retornam ao ultramicrotomo, 
onde tem suas faces delimitadas novamente deixando sobrar apenas a região de 
interesse, realiza-se novo alinhamento da navalha com o bloco e novos cortes são 
feitos, porém, agora, na espessura de 60 a 90 nm. 
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Os cortes ultrafinos são recolhidos com grades de cobre ao ser encostar a 
superfície da grade com os cortes que flutuam na água. As grades são posicionadas 
em placa de petri revestida de papel filtro com os cortes virados para cima, após 
secarem a temperatura ambiente as grades são posicionadas sobre gotas de acetato 
uranila em uma placa de petri revestida por parafilm na parte de baixo e papel aluminio 
na parte de cima, os cortes ficam abrigados da luz ambiente na placa de petri por 15 
minutos, lava-se as grades em um Becker com água destilada com 30 imersões 
rápidas, as grades lavadas são colocadas em placa de petri revestida de papel filtro. 
As grades são colocadas sobre gotas de citrato de chumbo em uma placa de petri 
revestida por parafilm na parte de baixo e papel alumínio na parte de cima, os cortes 
ficam abrigados da luz ambiente na placa de petri por 3 minutos e repete-se a 
lavagem, as grades retornam a placa de petri revestida de papel filtro e após secarem 
em temperatura ambiente, as grades estão prontas para serem inseridas no MET e 
as amostras visualizadas. 
 
 
2.4 RESULTADOS 
 
 
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Figura 18 - Material biológico em tubos após fixação, pós fixação e desidratação, 
antes de ser incluída em resina pura. Fonte: Lorran Faria. 
 
 
Figura 19 - Blocos de resina com o material biológico em seu interior (manchas 
escuras) em sacos de papel devidamente identificados com o código de registro no 
laboratório e informações adicionais para catalogação pessoal. Fonte: Lorran Faria. 
 
 
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Figura 20 – Grades contendo cortes secos após contrastação com metais pesados. 
Fonte: Lorran Faria. 
 
 
Figura 21 - Stub metalizado com ouro formando uma cobertura sobre uma fita 
adesiva com o material. Fonte: Lorran Faria. 
 
 
3 CONCLUSÕES 
As informações e experiencia adquirida no decorrer do acompanhamento 
realizado com os especialistas técnicos em suas respectivas áreas foram 
enriquecedoras, pois demonstraram que existe muito mais conhecimento a ser 
aplicado na pratica durante o processamento além dos procedimentos padrão 
estabelecidos nos protocolos. 
São pontos muito pertinentes de serem realçados: a necessidade de um 
dialogo do fixador e pós fixador com as soluções tampão utilizadas para diluição e 
lavagem pois alguns não são compatíveis com determinados agentes fixadores ou 
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simplesmente não oferecem resultados excelentes na qualidade do material 
analisado; fatores como o nível de rigidez, o grau de preservação das amostras e a 
disponibilidade de sítios de ligação podem ser alterados de acordo com necessidade 
do usuário durante a fixação, pode-se utilizar diferentes combinações entre 
glutaraldeído e paraformoldeído para alcançar o equilíbrio desejado entre os fatores; 
sempre que se planeje o contato do material com uma nova solução deve-se 
concentrar o material e descartar o sobrenadante previamente para que o material 
possa ser resuspendido na próxima solução, isso garante uma interação mais 
homogênea do material como um todo com as soluções e agentes a que ele é exposto; 
no processamento para MEV, caso o material não seja uma cultura de células 
aderidas a lamínulas circulares de vidro deve-se após a pós fixação e lavagem do 
material, aderi-lo a essas lamínulas, para isso utiliza-se lamínulas revestidas com poli-
L-lisina (comumente usada para revestir o material de cultura de tecidos como um 
fator de fixação que melhora a aderência celular); alguns reagentes utilizados durante 
o processamento demandam cuidados especiais de manipulação para garantir a sua 
qualidade, o tetróxido de ósmio e o acetato de uranila precisam ser acondicionados 
livres de luz durante sua manipulação, pois eles precipitam na presença de 
luminosidade, já o citrato de chumbo precipita na presença de CO2, um método que 
busca evitar essa interferência é a utilização de perolas de NaOH ao redor da gota do 
reagente durante o seu contato com a amostra; as grades para microscopia eletrônica 
podem precisar de aditivos para se adequarem às diferentes metodologias adaptadas, 
é comum a utilização de grades revestidas com filmes suporte de Formvar no 
processamento de vírus e para realização de cortes seriados em grades do tipo fenda. 
Todas essas particularidades exemplificam o quão dinâmico e complexo é 
garantir a qualidade do processamento de diferentes materiais biológicos para serem 
analisados em um microscópio eletrônico. 
 
 
REFERÊNCIAS 
 
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ALVES, E. APOSTILA DO CURSO INTRODUTÓRIO DE MICROSCOPIA 
ELETRÔNICA DE TRANSMISSÃO. Minas Gerais: LME. DFP. UFLA, 2004. 
 
DE SOUZA, W. et al. Técnicas de Microscopia Eletrônica Aplicadas às Ciências 
Biológicas. 3. ed. Rio de Janeiro: Sociedade Brasileira de Microscopia. 2015. 
 
GROSS, E.; PIRES, M.; FERNANDES, V. Curso Teórico Pratico de Técnicas Em 
Microscopia Eletrônica. 
 http://www.uesc.br/centros/cme/arquivos/apostila_curso_cme.pdf 
 
MALISKA, A. M.; MICROSCOPIA ELETRÔNICA DE VARREDURA E 
MICROANÁLISE. Santa Catarina: LCMAI. LABMAT. EMC. UFSC. 
 
MENDONZA OLIVEROS, MARTÍN EMILIO. Produção e caracterização 
analítico/estrutural/propriedadesde nanocompósitos Cu-MWCNT. Rio de Janeiro: 
PUC-rio. 2012.