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Processamento inicial para cultura de bactérias aeróbicas e anaeróbicas Profª. MS. Djuli Hermes ANÁLISES CLÍNICAS II Coleta transporte Recebimento das amostras Cultura Que tipos de materiais pode ser realizado cultura no Laboratório de Microbiologia? Material Clínico Mais comuns: Urina, Fezes, Escarro, Lavado brônquico, Líquor, Esperma, Fragmentos de tecidos, Biópsias, Líquidos orgânicos, Secreções em geral Todo material clínico pode ser cultivado. Transporte Cada material tem um meio de transporte adequado Meio Stuart: isolamento de bactérias aeróbicas e anaeróbicas facultativas Meio Stuart com carvão: Bactérias aeróbicas e anaeróbicas facultativas, principalmente para gonococos, pneumococos e hemófilos Cary-Blair: Isolamento de enteropatógeno a partir de amostras de fezes Recebimento de amostras Verificar: 1) Identificação da amostra (nome, sítio anatômico, data e hora da coleta) 2)Volume adequado (urina) 3)Meio de transporte adequado 4) Se a amostra é compatível para realizar o exame solicitado Meios de cultura São misturas de nutrientes necessários ao crescimento microbiano que deve conter a fonte de energia e de todos os elementos imprescindíveis à vida das células. Classificação dos meios Quanto à Consistência: Líquido: Nutrientes em solução aquosa e inexistência de ágar; Semi-Sólido: Presença de nutrientes e Ágar em [ ] menor que 15g/1000ml; Sólido: Presença de nutrientes e Ágar em [ ] maior que15g/1000ml. Quanto à Função: Enriquecido Seletivos Diferenciador Manutenção Classificação dos meios Preparo dos meios Preparar segundo as recomendações do fabricante Meios sólidos – erlenmeier - placas Meios sólidos e semisólidos – em tubos Meios líquidos - tubos Esterilização Autoclavagem – 121 C por 30 min Preparo do meio Após autoclavação, distribuir os meios Placa: Horizontal Tubo: Vertical e/ou horizontal (2) 2 1 Armazenamento dos meios Todos devem ser guardados em geladeira Nos frascos para posterior plaqueamento, identificados, lote, quem preparou, data de preparo Nas placas embaladas em grupos de 3, com data do plaqueamento, lote, quem plaqueou, só devendo ser liberadas para uso após o controle de qualidade. Controle de qualidade Uma amostra do lote deve ser inoculada e observada para testar viabilidade dos nutrientes e certeza de resultados. Ex: Estreptococos grupo A em ágar sangue – observar bom crescimento e beta-hemólise. Ph - fabricante Medidas assépticas para inoculação do meio Alças flambadas antes e depois; Deve-se esperar o resfriamento; Os recipientes contendo meios deverão ser abertos somente na zona de esterilidade gerada pelo Bico de Bunsen; A boca do tubo de ensaio deve ser aquecida antes e depois de ser retirada a tampa, A rolha nunca deve ser apoiada na bancada; Principais meios de cultura Meios de crescimento e isolador Agar Sangue (AS) Agar chocolate (CHOC) Agar MacConkey ( MC) Agar CLED Agar Salmonella-Shigela (SS) Caldo Selenito Caldo Tetrationato Caldo Tioglicolato com indicador Principais meios de cultura Meios de crescimento e isolador Agar Thayer-Martin Chocolate Caldo BHI Brain-Heart-Infusion Agar Karmali’S Agar Loeffler Meio de Lowenstein-Jensen Ágar Sangue – AS Não seletivo Diferencial Permite crescimento de BGP, BGN Visualização da hemólise BETA ALGA GAMA Adicionar 5% de sangue de carneiro – 45º C Ágar Chocolate - CHOC Nutritivo Não seletivo Base - agar Muller Hinton Adiciona sangue de carneiro a 80ºC Fatores – coenzima A, suplemento V e X Bactérias nutricionalmente exigentes Neisseria gonorrhoeae, Haemophilus influenza Ágar CLED Crescimento de vários BGN e CGP Deficiência em eletrólitos Inibe véu do Proteus spp Indicador: azul de bromotimol Lactose Ágar MacConkey – MC Seletivo Diferencial -Crescimento de BGN e diferenciação das bactérias em lactose+ e lactose – Inibe GP Agar SS – Salmonella e Shigella Seletivo Diferencial para isolamento de Salmonella spp e Shigella spp Sais biliares, citrato de sódio e verde brilhante – inibem BGP Detecta a produção de H2S pelo citrato férrico e tissulfato de sódio Lactose + e - Caldo Selenito Enriquecimento de amostras de fezes para o isolamento de Salmonella spp e Shigella spp Inibe coliformes e Streptococos Meio Mueller Hinton - MH Realização do teste de sensibilidade aos antimicrobianos Placa grande – 60 mL do meio ( 4mm) Pode ser adicionado sangue Cromogênicos Revolução na microbiologia Identificação presuntiva As UFC assumem cores diferentes Cuidados importantes Cuidados esterilização pH Quantidade de meio na placa Água condensada na superfície Contaminação Ressecamento Meios para Identificação Citrato de Simons Agar Bile Esculina Agar fenilalanina Caldo NaCl 6,5% Agar Lisina Agar Ornitina Agar SIM Caldo Malonato Agar TSI Triplo Açúcar Ferro EMP Hidrolisar esculina – cor preta •Enterococos + •S. pyogenes - Diferencia Enterococos de Streptococos •Enterococos e Staphylococos aureus Outros meios Caldo BHI - Meio rico para crescimento geral. Caldo Tetrationato – enriquecimento de Salmonella Caldo Tioglicolato – anaeróbios Meio Thayer Martin- Meio Loeffler Meio de Lowenstein Jensen Meio Karmalis Caldo M42 Outros meios Para BGN-NF Of-Glicose Cetrimide Caldo BHI – 44ºC Gelatina Nitrato - motilidade OF- maltose, xilose, lactose - Técnicas de semeadura Quantitativa Qualitativa Quantitativa Inóculo Inicial Estrias Por esgotamento Para semi quantificação Isola os microrganismos Importante Semear primeiro os meios de cultura MENOS seletivos, para evitar transferências de substâncias inibidoras Por exemplo: Amostra de escarro, semear primeiro em CHOC, depois em AS e MC
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