AULA 8 - CULTIVO DE MICRO-ORGANISMOS

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08/06/2020
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CULTIVO DE 
MICRORGANISMOS
Eliane Melo Brolazo
FATEC CAMPINAS
BIOQUÍMICA E FERMENTAÇÕES
Uma vez garantidos pelo ambiente os nutrientes e as 
condições adequadas para assimilá-los, as bactérias vão 
absorvê-los e transformá-los para que cumpram suas 
funções básicas, quais sejam, o suprimento de energia e 
de matéria prima. 
Como matéria-prima, os nutrientes vão ser transformados 
em estruturas celulares ou em moléculas acessórias à sua 
síntese e funcionamento.
Metabolismo bacteriano
Na natureza, os microrganismos crescem em 
comunidades mistas, em um sistema aberto, com 
constantes fluxos de nutrientes e variações ambientais 
(temperatura, umidade, pH, tensão de oxigênio).
O estudo destas comunidades microbianas compostas 
por inúmeras espécies, em um sistema aberto, como 
ocorre no ambiente natural é um desafio ainda não 
vencido pela Ciência. 
O principal recurso desenvolvido para estudo dos microrganismos foi o 
isolamento e cultivo em condições artificiais.
Cultivo de Microrganismos
O cultivo de microrganismos em condições laboratoriais 
é um pré-requisito para seu estudo adequado.
Para se cultivar microrganismos deve-se obedecer a 
requisitos básicos obrigatórios, incubá-los em meios 
com nutrientes adequados (meios de cultura) e 
condições ambientais igualmente propícias a cada 
espécie/grupo de microrganismo.
Cultivo de Microrganismos
Definições:
Inóculo é uma amostra de material contendo 
geralmente uma pequena quantidade de microrganismos; 
Os microrganismos contidos no inóculo multiplicam-se, 
aumentando em número e massa.
Culturas: microrganismos crescem em meios de laboratórios.
Repique: transferência de um inóculo de um meio de cultivo para 
um segundo meio (pode ser de mesma composição ou de 
composição diferente)
Cultivo de Microrganismos
Crescendo no mesmo tipo de meio, as diferentes espécies 
bacterianas podem parecer completamente diferentes, 
assim o conhecimento do aspecto ou das características 
culturais de um grupo é útil na identificação da espécie.
Antes da avaliação de qualquer característica cultural, é 
necessária a obtenção de cultura pura.
Cultivo de Microrganismos
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Cultura mista: população ambiental, com várias espécies 
crescendo juntas (ex: pele, intestino, solo)
Cultura pura: condição artificial, obtida em laboratório, 
onde apenas uma espécie esta se multiplicando no meio 
de cultura. Obtida após uma sequência de procedimentos 
laboratoriais.
Cultivo de Microrganismos
Para a identificação de uma espécie para fins 
diagnósticos, para pesquisa científica ou para obtenção de 
linhagens selecionadas para fermentação ou outra 
utilização, a primeira condição necessária é a obtenção de 
cultura pura.
Cultivo de Microrganismos
Identificação Bacteriana
1o) Isolamento (obtenção da cultura pura) semeando por 
esgotamento em meio sólido (ágar especifico para o 
tipo de amostra
3o) Coloração de Gram (diferenciação dos dois principais 
grupos bacterianos). Ou outra coloração específica, de 
acordo com tipo de amostra original. 
Identificação Bacteriana
4o) Seleção dos meios mais adequados a identificação do 
microrganismo isolado.
5o) Identificação através de testes bioquímicos.
Obs: a identificação tb pode ser feita por métodos 
moleculares (PCR utilizando-se primers específicos)
Os meios de cultura são preparações que possuem em
sua formulação, os nutrientes necessários (dissolvidos
em água) para que os microrganismos possam se
multiplicar permitindo, entre outras funções, seu
isolamento e identificação da espécie.
Classificação dos meios de cultura:
a) Quanto à consistência
b) Quanto à composição química
c) Quanto à função/utilização
Meios de Cultivo
Classificação quanto à consistência:
Sólidos: nutrientes dissolvidos em água e agente gelificante (ágar-
carboidrato obtido de algas marinhas não é digerido por 
bactérias). Com 1,5% de ágar distribuído em placas de Petri ou 
tubos. 
Imobiliza às células e permite o crescimento em massas isoladas, 
denominadas colônias. 
Utilização: obtenção de cultura pura, contagem em placa.
Características que permitem 
analisar a pureza da cultura 
(colônias idênticas) e auxiliam 
na identificação da espécie. 
Conhecidos como “Ágar...”
Meios de Cultivo
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Classificação quanto à consistência:
- Líquidos: mistura de nutrientes dissolvidas em água
Utilização: enriquecimento de culturas, multiplicação
Normalmente distribuídos em tubos
Evidência de crescimento por turbidez do meio
Conhecidos como Caldos
Meios de Cultivo
Classificação quanto à consistência:
- Semi-sólidos: menor % de ágar (0,5%)
Utilização: motilidade (presença de flagelos,
redução O2)
Meios de Cultivo
Quanto à composição:
- Meios de composição química definida ou sintéticos
(p/ tipos específicos de microrganismos – também
para identificação)
Ex: 1g de glicose
0,5g de NaCl
1g de cisteína
0,5 de hidrolisado de caseína
Meios de Cultivo
- Meios complexos
(geralmente + ricos em nutrientes, que permitem crescimento de
vários tipos de MO)
ex: 1 g de extrato de levedura
2 g de extrato de carne
1 g de glicose
0,5 g de NaCl
Meios de Cultivo
- Meios enriquecidos:
Base mistura de nutrientes aos quais, após
esterilização, se adiciona algum componente
como sangue de carneiro, plasma, etc...
Utilizados para cultivo de microrganismos fastidiosos, com
grande exigência de nutrientes (fatores de crescimento)
Ex. Agar sangue (5% hemácias de carneiro ou cavalo), além
de enriquecido, também permite diferenciação de tipos
hemolíticos.
Meios de Cultivo Meios de Cultivo
Hemólise alfa: parcial, 
halo coloração 
esverdeada
Hemólise beta: total, 
halo transparente
Hemólise gama: ausência 
de halo ao redor das 
colônias
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Quanto à função/utilização:
- Meios de enriquecimento:
Utilizados quando o microrganismo de interesse pode
estar injuriado e precisa de ter seu crescimento
facilitado em condições de laboratório.
Geralmente meios líquidos, ricos em nutrientes, sem
inibidores de crescimento.
Ex. Caldo BHI
Meios de Cultivo
Quanto à função/utilização:
-Meios seletivos: com substância química que iniba determinado
grupo de microrganismos e portanto selecione o crescimento
de um grupo em detrimento dos outros.
Ex: agar Sabouraud dextrose, pH ácido inibe crescimento
bacteriano e facilita crescimento de leveduras que são
tolerantes ao pH mais baixo.
Ágar MacConkey, contém cristal violeta e sais biliares,
que inibem crescimento de bactérias Gram
positivas (tb é diferencial)
Meios de Cultivo
Quanto à função/utilização:
- Meios diferenciais: que favorecem o aparecimento de
um tipo de crescimento ou modificação que permita ao
observador distinguir os tipos de microrganismos.
Ex. Ágar Cled, usado na contagem colônias em amostras de
urina permite a diferenciação colônias fermentadoras da
lactose devido a mudança de coloração do meio de verde
para amarelo.
Meios de Cultivo
- Muitos meios diferenciais, além de permitirem o
crescimento de colônias com diferentes características,
também são seletivos, inibindo alguns grupos de
bactérias e favorecendo outros.
Ex. Agar Manitol, é hipertônico (7,5% NaCl) e contem
Manitol, carboidrato fermentescível.
Meios de Cultivo
- Meios para contagem: padronizados para contagem de
microrganismos em leite, água, alimentos.
PCA (Plate Count Agar): permite crescimento de bactérias
mesófilas facultativas em geral, desde que incubado em
temperatura adequada.
PDA (Spread Plate)
Contagem bolores e
leveduras
Meios de Cultivo
Contagem em Placa: crescimento de diversas espécies
bacterianas.
Meios de Cultivo
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http://upload.wikimedia.org/wikipedia/commons/6/6a/Lactose_non_lactose_fermenters_on_CLED_agar.jpg
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Meios para identificação: composições específicas para
determinar as características metabólicas da cultura
pura e permitir a identificação da espécie.
Ex. ágar citrato de Simmons, ágar uréia, TSI
Meios de Cultivo
Meio de estocagemou manutenção:
composição que permita crescimento lento e a
manutenção das características metabólicas da espécie
(geralmente sem glicose) – repiques sucessivos
Para congelamento da cultura, utiliza-se alguma substância crioprotetora
como glicerol, para evitar rompimento celular e perda de viabilidade.
Congelamento para preservação
deve ser em Ultrafrezer (-70ºC )
ou em Nitrogênio líquido
Meios de Cultivo
Meios de Cultivo
1- Classificar os seguintes meios de cultura quanto:
a) Consistência, 
b) composição 
c) função/uso 
e marcar qual componente evidencia esta classificação
2- Observar (marcar) na composição presença de: sistema 
tampão, microelementos, fonte carboidrato, proteínas, 
concentração NaCl
Agar BHI -Descrição 
O Agar Infusão Cérebro e Coração (BHI) é um meio para cultivo de uma 
grande variedade de microrganismos, incluindo organismos fastidiosos, 
leveduras e fungos. 
 
Preparação: 
Suspender 52 g de pó em 1 litro de água destilada ou deionizada. 
Aquecer até dissolver completamente. Esterilizar em autoclave a 121°C 
por 15 minutos. Resfriar entre 45-50°C. Dispensar em placas de Petri. 
Especificações Técnicas: 
Composição g/L 
Infusão Cérebro e Coração 17,5 
Peptona 10,0 
Glicose 2,0 
Cloreto de Sódio 5,0 
Fosfato Disódico 2,5 
Agar 15,0 
pH Final = 7,4 ± 0,2 a 25°C 
 
Controle de Qualidade: 
Microrganismos ATCC Crescimento 
Streptococcus pneumoniae 6303 Bom 
Streptococcus pyogenes 19615 Bom 
Staphylococcus aureus 25923 Bom 
Neisseria meningitidis 13090 Razoável 
 
Armazenamento: 
O pó é muito higroscópico: Armazenar entre 10-30°C, em um ambiente 
seco, em sua embalagem original bem fechada. Utilizar antes da data de 
validade informada no rótulo ou até que os sinais de deterioração ou de 
contaminação sejam evidentes. Armazenar em placas entre 2-8°C. 
 
Agar MacConkey – Descrição 
O Agar MacConkey é utilizado para o isolamento e identificação 
da Enterobacteriaceae encontrada em fezes, urina, águas residuais e alimentos. O meio 
também é utilizado para diferenciar coliformes de cepas enterobactérias patogênicas não 
fermentadoras de lactose. 
 
Preparação: 
Suspender 51,5g de pó em 1 litro de água destilada ou deionizada. Aquecer o meio com 
agitação até dissolver completamente. Dispensar em tubos, garrafas, frascos, etc., 
conforme necessidade. Esterilizar em autoclave a 121°C por 15 minutos. 
 
Composição g/L 
Digestão Pancreática de Gelatina 17,0 
Peptona 3,0 
Lactose 10,0 
Sais Biliares nº 3 1,5 
Cloreto de Sódio 5,0 
Vermelho Neutro 0,03 
Cristal Violeta 0,001 
Agar 15,0 
pH Final= 7,1 + 0,2 à 25°C 
 
Aparência do Meio: 
Preparado: Meio vermelho-rosado, levemente opalescente sem precipitado significativo. 
 
Controle de Qualidade: 
Microrganismos ATCC Crescimento Características 
Enterococcus faecalis 19433 inibido – 
Escherichia coli 25922 Bom Colônias rosas / precipitados 
Proteus mirabilis 25933 Bom Colônias incolores 
 
 
Armazenamento: 
O pó é muito higroscópico. Armazenar entre 10-30°C, em um ambiente seco, em sua 
embalagem original bem fechada. Utilizar antes da data de validade informada no rótulo 
AGAR SANGUE DE CARNEIRO 
DESCRIÇÃO 
 O meio de cultura Agar Sangue ( Tripcase Soja + 5% de sangue de 
carneiro) é um meio de isolamento que permite o desenvolvimento de 
todas as espécies mais correntes nas coletas clínicas. 
PRINCÍPIO Contém uma mistura de peptonas particularmente adaptada à 
cultura dos microrganismos. A presença de sangue de carneiro permite a 
manifestação da hemólise que é um critério base da orientação da 
identificação bacteriana 
 
COMPOSIÇÃO: 
Peptona de caseína (bovina)................................................ 15g 
Peptona de soja............................................................................. 5g 
Cloreto de sódio ........................................................................ 5g 
Agar .............................................................................................. 15g 
Sangue (carneiro)...................................................................... 50 ml 
Água destilada............................................................................. 1L 
pH 7,3 
 
CONTROLE DE QUALIDADE 
A fertilidade do meio pode ser testada em relação às cepas seguintes (incubação em atmosfera 
enriquecida em CO2): 
Microrganismo Resultado esperado 
 • Streptococcus pyogenes ATCC 19615 β Hemólise 
• Streptococcus pneumoniae ATCC 6305 α Hemólise 
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http://images.google.com.br/imgres?imgurl=http://1.bp.blogspot.com/_HDwUiVSMtu8/SWAh7HGC6zI/AAAAAAAAASg/7hizW9Y7qHg/s320/Citrato.jpg&imgrefurl=http://microbiologiabrasil.blogspot.com/2009_01_01_archive.html&usg=__sm-1goBkn6q9_e40Ds--9BJoNrA=&h=320&w=240&sz=6&hl=pt-BR&start=9&um=1&itbs=1&tbnid=N096ucmgMVC0BM:&tbnh=118&tbnw=89&prev=/images?q%3Dagar%2Bcitrato%26um%3D1%26hl%3Dpt-BR%26sa%3DN%26tbs%3Disch:1
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Agar Nutriente - Descrição 
É um meio com várias finalidades, utilizado para a análise de água e 
produtos lacticínios de acordo com a ISO 12780. 
 
Preparação: 
Suspender 28 g de pó em 1 litro de água destilada ou deionizada. 
Aquecer até ferver dissolvendo completamente. Esterilizar em autoclave 
a 121°C por 15 minutos. Dispensar em placas de Petri. 
 
Composição g/L 
Extrato de Carne 1,0 
Extrato de Levedura 2,0 
Peptona 5,0 
Cloreto de Sódio 5,0 
Agar 15,0 
pH Final= 6,8 + 0,2 a 25°C 
 
Controle de Qualidade: 
Microrganismos ATCC Crescimento 
Enterococcus faecalis 29212 Bom 
Escherichia coli 25922 Bom 
Pseudomonas aeruginosa 27853 Bom 
 
Armazenamento: 
O pó é muito higroscópico: Armazenar entre 10-30°C, em um ambiente 
seco, em sua embalagem original bem fechada. Utilizar antes da data de 
validade informada no rótulo ou até que os sinais dedeterioração ou 
contaminação sejam evidentes. 
 
Agar Sal Manitol - Descrição 
Para isolamento de estafilococos patogênicos a partir de amostras 
clínicas e biológicas e produtos farmacêuticos. 
 
Preparação: 
Suspender 111 g de pó em 1 litro de água destilada ou deionizada. 
Aquecer até ferver e misturar até ficar completamente dissolvido. 
Esterilizar em autoclave a 121°C por 15 minutos. Dispensar nos 
recipientes finais. 
 
Composição g/L 
Extrato de Carne 1,0 
Peptona Especial 10,0 
Cloreto de Sódio 75,0 
Manitol 10,0 
Vermelho de Fenol 0,025 
Agar 15,0 
pH Final= 7,4 + 0,2 
 
Aparência do Meio: 
Desidratado: Pó rosa-avermelhado, levemente opalescente. 
 
Controle de Qualidade: 
Microrganismos ATCC Crescimento Características 
Enterococcus faecalis 19433 Inibido – 
Escherichia coli 25922 Inibido – 
Staphylococcusaureus 25923 Bom Colônias amarelas 
Staphylococcus epidermidis 12228 Bom Colônias vermelhas 
 
 
Armazenamento: 
Armazenar entre 10-30°C longe da luz, até a data de validade no rótulo 
 
Caldo Lauril Triptose -Descrição 
Utilizado para detecção de coliformes em águas e esgotos, de acordo 
com a fórmula do American Public Health Association. 
 
Preparação: 
Suspender 35,6g de pó em 1 litro de água destilada ou deionizada. 
Aquecer até dissolver completamente. Dispensar nos recipientes finais 
com tubos Durham. Esterilizar em autoclave a 121°C por 15 minutos. 
 
Composição g/L 
Triptose 20,0 
Lactose 5,0 
Cloreto de Sódio 5,0 
Lauril Sulfato de Sódio 0,1 
Fosfato Potássio Dibásico 2,75 
Fosfato Potássio Monobásico 2,75 
pH Final= 6,8 + 0,2 a 25°C 
 
Controle de Qualidade: 
Microrganismos ATCC Crescimento Gás 
Escherichia coli 25922 Bom + 
Salmonella typhimurium 14028 Bom – 
Staphylococcus aureus 25923 Inibido – 
Klebsiella pneumoniae 13883 Bom + 
 
Armazenamento: 
O pó é muito higroscópico: Armazenar entre 10-30°C, em um ambiente 
seco, em sua embalagem original bem fechada. Utilizar antes da data de 
validade informada no rótulo ou até que os Sinais de deterioração ou 
contaminação sejam evidentes. Armazenar os tubos preparadas entre 2-
8°C. 
 
PDA – Potato Dextose Agar Descrição 
O ágar batata dextrose, também conhecido pela sigla BDA, é um meio de 
cultura muito utilizado na contagem de fungos e leveduras. Rico em 
açúcares simples provenientes da batata e, por isso, pode ser utilizado 
como local de crescimento e cultura para diferentes tipos de 
microrganismos. 
Preparação: 
Suspender 42 g de pó em 1 litro de água destilada ou deionizada. 
Aquecer até ferver dissolvendo completamente. Esterilizar em autoclave 
a 121°C por 15 minutos. Resfriar em temperatura ambiente. Ajustar o pH 
para 3,5 ± 0,1 através da adição de solução de ácido tartárico 
esterilizado 10%. 
 
Especificações Técnicas: 
Composição g/L 
Infusão de Batata 200,0 
Glicose 20,0 
Agar 17,0 
pH Final= 5,6 ± 0,1 a 25°C 
 
Preparado: Meio âmbar claro e levemente opalescente. 
 
Controle de Qualidade: 
Microrganismos ATCC Crescimento 
Aspergillus niger 16404 Bom 
Candida albicans 10231 Bom 
Saccharomyces cerevisiae 9763 Bom 
 
Armazenamento: 
 
Armazenar entre 10-30°C, em um ambiente seco, em sua embalagem 
original bem fechada. Utilizar antes da data de validade informada no 
rótulo ou até que os sinais de deterioração ou contaminação sejam 
evidentes. Armazenar as placas preparadas entre 2-8°C. 
. 
 
Todos os grupos devem estudar todos os meios 
de cultivo apresentados. Na próxima aula vamos 
discutir estas informações, então organizem uma 
mini-apresentação deste material.
Video Unicamp
https://www.youtube.com/watch?v=FY1-7eIijaY
(9 min)
Tipos de meio de cultura
https://www.youtube.com/watch?v=y-Kq161PbY8
(2 min)
Semeadura por esgotamento
https://www.youtube.com/watch?v=fxxQnc8RZfg
(3,25 min)
Semeadura Spread Plate com diluição(para contagem de microrganismos)
https://www.youtube.com/watch?v=FwW_2ii1Zoo
(11 min)
Pour Plate automático
https://www.youtube.com/watch?v=BDYWxs8nzm4
(4 min)
Tubos múltiplos/Número mais provável
https://www.youtube.com/watch?v=uPZ_YFWUzoE
(7 min)
31 32
33 34
35 36
https://www.youtube.com/watch?v=FY1-7eIijaY
https://www.youtube.com/watch?v=y-Kq161PbY8
https://www.youtube.com/watch?v=fxxQnc8RZfg
https://www.youtube.com/watch?v=FwW_2ii1Zoo
https://www.youtube.com/watch?v=BDYWxs8nzm4
https://www.youtube.com/watch?v=uPZ_YFWUzoE
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Equipamentos e Instrumentos microbiologia
• Microscópio ótico
• Autoclave (equipamento esterilização)
• Placa de Petri – vidro e plástico (descartáveis) 
• Tubo de ensaio com tampa de baquelite
(plástico autoclavável), inox ou de algodão 
hidrofóbico
Equipamentos e Instrumentos microbiologia
• Lâminas e lamínulas de vidro
• Saco para descarte de materiais contaminados 
em autoclave
• Fita indicadora química de esterilização
• Ampolas de verificação de autoclavagem -
Equipamento e materiais 
microbiologia
Equipamento e materiais 
microbiologia
Alça e agulha bacteriológica:
Plástico descartável ou metal (níquel cromo/raramente 
platina). Pode ser calibrado para transferir volume 
definido de amostra
Cabo de Kolle
Alça bacteriológica Usos:
Semear por esgotamento, repiques de meio líquido para 
meio sólido, preparação de esfregaço em lâmina.
Agulha bacteriológica Usos:
Coleta de colônia isolada, 
Semear em profundidade
(tubos com meios sólidos e/ou
semi sólidos)
Cultivo de Microrganismos Equipamento e materiais 
microbiologia
Alça de Drigalski
Tubos de 
Duran
Pacote placas Petri 
estéreis descartáveis
Tubos tampa rosca
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Alça ou agulha Bacteriológica – a 
platina é muuuuito cara. Material 
mais usado é fio de níquel –cromo ou 
plástico (descartáveis)
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