Reação em cadeia da polimerase

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Ciências Biológicas
Disciplina: BIOTECNOLOGIA I
Aula 4: Reação em Cadeia da 
Polimerase (PCR)
Profª Me. Nayara Castro
PCR
Reação em Cadeia da Polimerase
AREAÇÃO EM CADEIADAPOLIMERASE
A Reação em Cadeia da Polimerase (PCR)
PCR: POLYMERASE CHAIN REACTION
Amplificação in vitro de sequências 
ESPECÍFICAS de DNA
A Reação em Cadeia da Polimerase (PCR)
Estrutura dos ácidos nucleicos
DNA ou ADN: Ácido DesoxirriboNucleico
Polímeros de desoxinucleotídeos
(dA, dT, dC e dG)
Normalmente em fita dupla (dsDNA)
Fitas complementares (em direções opostas)
Estrutura dos ácidos nucleicos
DNA – Ácido DesoxirriboNucleico 
RNA – Ácido RiboNucleico
Estrutura dos ácidos nucleicos
Polímeros lineares de nucleotídeos
BASE NITROGENADA
GRUPO FOSFATO
PENTOSE
Estrutura dos ácidos nucleicos
Estrutura dos ácidos nucleicos
Desnaturação e Renaturação do DNA
Estrutura dos ácidos nucleicos
Desnaturação e Renaturação do DNA
FORTE
ligações fosfodiéster 
(mesma fita)
FRACA
pontes de H 
(entre as fitas)
Estrutura dos ácidos nucleicos
Desnaturação e Renaturação do DNA
5’ 3’
3’ 5’
Estrutura dos ácidos nucleicos
Desnaturação e Renaturação do DNA
5’ 3’
3’ 5’
Estrutura dos ácidos nucleicos
Desnaturação e Renaturação do DNA
5’ 3’
3’ 5’
Replicação do DNA
A replicação do DNAocorre de forma semiconservativa
Polimerização unidirecional: sent ido 5’€ 3’
Replicação do DNA
PCR
Fundamentos da Técnica
DNA molde
Primer
Enzima e tampão
H2O
Extraído de uma amostra (sangue, pelo, sêmen)
ou de um RNA, convertida para cDNA.
Sequência de DNA que serve como ponto de início
de replicação. Forward eReverse.
Taq + Tampão + MgCL2 + dNTP’s
Água ultra pura e livre de cargas elétricas (H2O
miliQ
Componentes daPCR
Componentes daPCR
AReação em Cadeia da Polimerase
Polimerização in vitro do DNA
- Apenas moléculas de DNA (RNA eproteínas)
- Enzima DNA polimerase
- Amplificação de sequências específicas
Reação em “Cadeia”: reação cíclica
- Produtos de um ciclo são substrato para o ciclo seguinte
Fundamentos da PCR
Fundamentos da PCR
TEMPERATURA
Fundamentos da PCR
Os iniciadores de PCR
❑ A Enzima DNA polimerase não se liga em fita simples
❑ Iniciadores ou oligonucleotídeos (=PRIMERS)
❑ Utilização de pares de inciadores (um complementar para cadafita) 
Iniciador Senso (Forward): se liga na fita3’-5’
❑ Iniciador Antissenso (Reverse): se liga na fita5’-3’
Fundamentos da PCR
tubulina actina miosina
25°C
60°C
95°C
72°C
Fundamentos da PCR
Reação Cíclica
Desnaturação
Várias vezes...
Extensão
Hibr idização
Componentes de uma reação de PCR:
Amostra de DNA
dNTPs (dATP, dTTP, dCTP, dGTP)
Iniciadores (S e AS) 
Enzima DNA Polimerase 
Tampão da enzima
Mg2+ (MgCl2 ou MgSO4)
Fundamentos da PCR
Fundamentos da PCR
Mg2+
TAMPÃO
Desnaturação
(90-96°C)
Hibridização
(45-60°C)
Extensão
(68-72°C)
DNA Polimerase 
(termoestável)
Fundamentos da PCR
As principais etapas:
95°C 60°C 72°C
Enzima DNApolimerase
Fundamentos da PCR
(Taq DNApolymerase)
Pares de iniciadores
+
Thermus aquaticus (1976)
(Yellowstone National Park)
Fundamentos da PCR
TermocicladorReagentes Gel
Reação enzimática: DNApolimerase.
Temperatura + pH
Temperaturas diferentes: enzima e substrato/produto
Produto da reação: Gel (agarose; poliacrilamida).
Fases da PCR: princípio básico
ETAPA 1: Desnaturação
ETAPA 2: Anelamento
ETAPA 3: Alongamento
Fases da PCR: princípio básico
Reação em cadeia da polimerase (PCR)
❑ A mistura é colocada no termociclador.
❑ ETAPA 1: Inicialmente a temperatura é elevada
a 96oC para que haja separação da dupla cadeia
de DNA.
❑ ETAPA 2: Em seguida, a temperatura é reduzida
para 50oC a 60oC permitindo o anelamento dos
primers na fita molde de DNA.
❑ ETAPA 3: Por último, a temperatura é elevada a
72oC para a enzima Taq-polimerase sintetizar a
nova molécula e então um novo ciclo ser
iniciado.
ETAPA 1: Desnaturação
ETAPA 2: Anelamento
ETAPA 3: Alongamento
Fases da PCR: princípio básico
Fases da PCR: ciclos
Termocicladores
Rate of PCR 2n
81 2 4
Número de moléculas de DNA
Fases da PCR: amplificação da sequência alvo
0.0E+00
2.0E+08
4.0E+08
1.8E+09
1.6E+09
1.4E+09
1.2E+09
1.0E+09
8.0E+08
6.0E+08
0 5 10 25 30 3515 20
PCR cycle
D
N
A
 c
o
p
y
n
u
m
b
e
r
Tempo
T °C
95
72
60
Ciclo 1 Ciclo 2 Ciclo n
Fases da PCR: ciclos
109
108
107
106
105
104
103
102
10
Cópias do DNA: 1.073.741.824
Cópias do alvo: 1.073.741.764
C
ó
p
ia
s Platô
1 3 5 10 15 20 25 30
Ciclos
Fases da PCR: amplificação da sequência alvo
N° de Ciclos
Log [DNA]
Platô
Sem amplificaçãoLinear
Baixa eficiência
Exponencial
Alta eficiência
Fases da PCR: amplificação da sequência alvo
• Perda da atividade da enzima;
• Todas as enzimas disponíveis estão ocupadas com a síntese deDNA;
• Acúmulo de produtos amplificados que tendem a parear entre si,em detrimento 
do pareamento com os iniciadores;
• Gasto dos reagentes, especialmente dos inciadores e dos dNTPs;
• Acúmulo de pirofosfato (resultante das ligações fosfodiéster);
• Competição com outros produtos que vinham sendoamplificados;
• INIBIÇÃO PELOS PRODUTOS.
Platô
Sem amplificação
Detecção em gel
Fases da PCR: amplificação da sequência alvo
Eletroforese horizontal
Técnica de eletroforese em gel de agarose
Para avaliar os resultados da PCR
PCR
Aplicações da técnica
Aplicações da técnica de PCR
Identificação de espécies
Iniciadores para cada espécie 
Amplificação de genes específicos 
(Ausência nas outras espécies)
Diagnóstico molecular
Iniciadores específicos 
Presença/ausência do gene 
(positivo ou negativo para o teste)
Medicina forense
Identificação humana 
Marcadores humanos específicos 
(necessidade de controles)
Teste de paternidade
Identificação humana 
Marcadores humanos específicos 
(teste em todos os envolvidos)
Aplicações da técnica de PCR
As diferentes aplicações da técnica de PCR:
❑Amplificação de fragmentos específicos de DNA;
❑ Clonagem;
❑Medicina forense;
❑Diagnóstico molecular;
❑Detecção de mutações;
❑ Identificação de espécies;
❑Análises de expressão gênica;
❑ Filogenia molecular;
Aplicações da técnica de PCR
PCR
Variações da técnica
Variações da Técnica de PCR
• Touchdown PCR e Hot start DNA pol
• Multiplex PCR e Rep-PCR
• RACE
• PCR digital
• Transcrição Reversa seguida de PCR (RT-PCR)
• PCR quantitativa em tempo real (qPCR)
Transcrição Reversa
Variações da PCR: RT-PCR
mRNA
cDNA
Variações da PCR: RT-PCR
❑ Permite a análise de transcritos (mRNA) Análises
fenotípicas de expressão gênica
GTTATCTTCTCACTATTAATTTAGGATGTCTAAACAA
GGACGGACAATCATCTTCTCCATTCATCAGCCTCGTT
ATTCCATCTTCAAGTTGTTTGATAGCCTCACCTTGTT
GGCCTCGGGAAGACTCATGTTCCACGGGCCTGCTCAG
GAGGCCTTGGGGTACTTTGGAGCCATAGGTATGGTTG
CCTTTTTTGTGCTGTAAGATCCTTCATTAATAGTATC
CTAAAGGAGAACAAAGGAGTCACTTGGAGCACTGTTT
GATCTTTGAGTAGATATACATATATCACAGTTTCCAC
TGCTCCGAAACATCTTCGGTTAGTTTGGTGTTA...
Desenho de Primers
Primers –exon 9
FORWARD 5’3’
45309.....TAAAGGCAGGAGTAATAAAGTATGTTA 
CCAAGAAATGTAAGTTTCAGATGTTTAATGACTCATT
REVERSE 3’5’ GAAGCCAATCAAACCACAAT
Gradiente → definição da temperatura deanelamento
48,3 49,4 50,5 51,6 52,7 53,8 54,9 56
Otimizando o PCR