Reação em cadeia polimerase (PCR)

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Reação em cadeia polimerase (PCR) 
 
Técnica baseada em fazer cópias de DNA in vitro 
usando elementos básicos comuns ao processo de 
replicação natural do DNA 
-Objetivo: amplificar fragmentos específicos de DNA 
Relembrando... 
 
 
 
 
 
 Replicação do DNA 
Processo semiconservativo  a partir de uma 
molécula de DNA molde forma-se duas moléculas de 
DNA constituídas por uma fita antiga e uma fita nova 
 
Replicação in vitro 
 
Reagentes + temperatura 
Algumas copias do DNA  
milhares de copas de DNA 
 
 
 Extração do DNA 
1- Lise celular 
2- Purificação 
*Diversos protocolos que variam de acordo com amostra 
 Pode influenciar na amplificação do DNA 
-Integridade do DNA 
-Evitar perdas de material genético ao longo do 
procedimento 
-Remoção de moléculas que podem interferir na PCR 
 Preparo do MIX de reação 
-H2O 
-Solução tampão 
-Cloreto de magnésio 
-Primers 
-dNTP 
-Taq polimerase 
 Adição do MIX + DNA 
 
Função dos reagentes 
 Tampão 
-Garante pH e concentrações iônica adequadas 
 Cloreto de magnésio (MgCl2) 
-Doador estável de íons  para atividade da enzima 
Taq polimerase 
 dNTP (Desoxinucleotídeos) 
-Matéria-prima para síntese de novas fitas de DNA 
-dATP, dCTP, dGTP, dTTP 
-Formads por: 1 base azotada (Adenina, Citosina, 
Guanina e Timina), 1 açúcar (desoxirribose) e 3 grupos 
fosfato 
 Primer = iniciador 
-Sequencia curta de nucleotídeos que fornece ponto 
de partida para síntese de DNA 
P-rimer foward (senso) e primer reverse (anti-senso) 
 Taq polimerase (DNA polimerase) 
-Faz novas fitas de DNA usando as existentes como 
molde 
-Vem da bactéria Thermus aquaticus 
 
 
 
 
 
 
 
Etapas da reação no termociclador 
*repete-se entre 25x a 35x 
 
 
 
 
Visualização dos resultados 
-Eletroforese em gel (agarose ou poliacrilamida) 
-Corrente elétrica passa através do gel 
-Separa fragmentos de DNA de acordo com tamanho 
e carga 
 
Tipos de PCR 
RT-PCR (Reverse Transcriptase PCR) 
-Molde é fita de RNA 
RNA da amostra é convertido em cDNA (DNA 
complementar) para seguir a PCR convencional 
Ex: diagnóstico de infecções virias 
 
 
 
 
 
 
Real time PCR 
-Amplifica e quantifica simultaneamente a molécula 
alvo de DNA 
-Detecção do DNA amplificado enquanto reação 
progride em tempo real 
-Utiliza corante fluorescentes e sondas especificas 
para a detecção 
Nested PCR 
-A partir de um produto de PCR 
-Aumentar sensibilidade e especificidade da 
amplificação de DNA 
-Se faz uma 2° PCR a partir do produto de uma 1° PCR 
(dois primers) 
Multiplex PCR 
-Análise simultânea de diversos alvos 
 
-Utilização de mais de um par de primer em uma 
reação 
Aplicações PCR 
 Identificação de espécies 
 Analises filogenéticas 
 Diagnóstico molecular 
 Investigação forense 
 Teste de paternidade 
 Clonagem e analise de expressão gênica 
 Detecção de mutações 
 Epidemiologia molecular