Aula 2T - absorção molecular

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14/08/2019 
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Espectrofotometria de absorção 
molecular - UV/visível 
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Introdução à Absorção Molecular 
 Os métodos espectrométricos incluem todos as técnicas baseadas na 
interação entre energia eletromagnética (E) e matéria (M). 
Espectro de onda 
 A interação entre energia radiante e uma substância pode resultar em 
eventos químicos e físicos variados: absorção, emissão, fotodecomposição, 
reflexão, aquecimento, etc. 
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Energia eletromagnética ( f ou E ) do comprimento de onda (), da 
frequência (), da velocidade (c), potência (P) ou da intensidade (I) 
c = ., onde c (velocidade da luz) = 300.000 Km/s; v: frequência. Quanto 
menor o comprimento de onda, maior a frequência e a intensidade da 
radiação ionizante. 
Frequência = número de oscilações que a onda faz a cada segundo. 
E = hc/, onde h = constante de Planck. Energia inversamente 
proporcional ao . 
 
 A radiação eletromagnética 
consiste em energia 
propagada em forma de 
ondas. Apresenta 
comprimento de onda 
característico (λ): distância 
entre os ápices; 
Introdução à Absorção Molecular 
Oscilação de fases 
magnéticas e elétricas = 
deslocamento de fótons 
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Espectro eletromagnético 
Introdução à Absorção Molecular 
xxxx 
Região do espectro 
eletromagnético 
Transições 
Raios Gama Nucleares ( medicina nuclear – tratamento 
câncer) 
Raios X Eletrônicas – quebra de ligação e ionização 
Ultravioleta Eletrônicas 
Visível Eletrônicas 
Infravermelho Vibracionais e Rotacionais 
Microondas Rotacionais 
Ondas de Rádio (RF) Spin 
M + h = M* Absorção de radiação eletromagnética 
Introdução à Absorção Molecular 
˃ E 
˂ E 
A espectrofotometria é um método espectroscópico que se baseia na 
absorção da radiação nos comprimentos de onda (λ) da região do 
ultravioleta (200 a 380 nm) e do visível (380 a 800 nm); 
Espectrofotometria UV/visível 
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/nm Cor absorvida Cor transmitida (OBSERVADA) 
380-420 Violeta Verde-amarelo 
420-440 Violeta-azul Amarelo 
440-470 Azul Laranja 
470-500 Azul-verde Vermelho 
500-520 Verde Púrpura 
520-550 Verde-amarelo Violeta 
550-580 Amarelo Violeta-azul 
580-620 Laranja Azul 
620-680 Vermelho Azul-verde 
680-780 Púrpura Verde 
 Faixa do ultravioleta: soluções incolores – não devem ser turvas. 
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 É a técnica mais utilizada em laboratórios químicos e clínicos em 
todo mundo; 
 Meio simples para se determinar baixas quantidades diminutas de 
substâncias - boa sensibilidade; 
 Ex. volumétrica C= 100 µg/mL), espectrofotométricos C= 1 µg/mL a 
10 µg/mL ; 
 Baixo custo, fácil operação, equipamentos robustos; 
 Facilidade de acoplar com outros métodos analíticos e de separação: 
 HPLC-UV/visível = DETECTOR. 
Espectrofotometria UV/visível 
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Desvantagens 
Baixa seletividade: baseada na quantidade de energia absorvida ou liberada 
em um comprimento de onda específico é difícil distinguir duas substâncias 
que absorvem no mesmo comprimento de onda. Ex. FARMACOS DE MESMA 
CLASSE FARMACOLÓGICA : cefalotina, cefalexina e cefpiroma; 
Alternativas: utilização de padrões isolados e conhecimento da 
absortividade molar das substâncias (cálculo matemático) ou utilização de 
derivadas do espectro analítico; 
Uso de Padrão*: Compara-se quantidade de luz absorvida pela amostra em 
relação ao padrão (mesma concentração). 
SQR Cefpiroma 
Cefalotina 
Amostra Cefpiroma 
Cefalexina 
* Exceção: utilização da absortividade 
molar ou absortividade específica 
Espectrofotometria UV/visível 
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Absorção de radiação eletromagnética – Transições Eletrônicas 
Absorção molecular depende da estrutura 
eletrônica molecular. 
-Orbitais moleculares: sigma (), pi () e não 
ligante (n). 
- Para cada orbital ligante existe um orbital 
antiligante. 
E 
Ligante  
Ligante  
Não ligante n 
Antiligante * 
Antiligante * 
Transições 
eletrônicas 
 Transições eletrônicas em moléculas com ligações 
simples  requerem  energia (UV distante -   185 nm). 
 Transições eletrônicas em moléculas com grupos 
insaturados  requerem  energia (UV próximo e 
visível - = 200 a 700 nm). 
Espécies contendo elétrons 
sigma,  ou n 
 Transições envolvendo orbitais não ligantes (n): 
• São possíveis na faixa de UV próximo ou visível 
• Elétrons não ligantes para orbitais antiligantes 
• n  * (faixa de 150 a 250 nm) e n  * (faixa de 200 a 700 nm) 
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Principais grupos cromóforos 
Cromóforos: átomos ou grupos moleculares contendo ligações  e  
de átomos responsáveis pela absorção de luz; 
 Interações entre elétrons  e n são responsáveis por um grande 
número de bandas de absorção ultravioleta características 
Grupos auxócromos: grupos saturados que quando ligados a um 
grupo cromóforo altera tanto o comprimento de onda como a 
intensidade de absorção. Exemplos: OH, NH2 e Cl. 
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 Espectro (varredura): 
determinado pela estrutura 
química da molécula, mas 
influenciado por alterações do pH, 
polaridade do solvente e 
geometria e simetria da moléculas; 
 Solventes usuais: orgânicos, 
água, meios aquosos ácidos ou 
básicos, tampões; 
 AMOSTRA SOLÚVEL no meio; 
 Efeitos nos espectros: 
batocrômico: desloca a absorção 
para um λ maior; hipscrômico: 
desloca a absorção para um λ 
menor; hipercrômico: aumenta 
intensidade de absorção; 
hipocrômico: diminui intensidade 
de absorção. 
Efeito do solvente na absorção 
batocrômico 
hipscrômico 
Porque o pH pode alterar o 
espectro de absorção de um 
analito? 
Leis da Fotometria 
 Quando um raio de energia atravessa determinada solução, a energia incidente 
será sempre de maior intensidade que a energia emergente (transmitida). 
 A atenuação da energia é atribuída a reflexões nas interfaces: 
 - ar, parede da cubeta e a solução; 
 - dispersão por partículas presentes na solução; 
 - absorção de energia pelo analito. 
1ª Lei da fotometria 
 Estabelece que quando uma energia radiante atravessa uma solução a 
quantidade de energia transmitida diminui exponencialmente com o aumento 
 da espessura atravessada; 
 Correlaciona energia e distância. 
Lei de Lambert 
I1/I0 = T 
Log I0/I1 = a . b 
a* = constante característica da solução; 
b = espessura em cm da camada atravessada 
pela luz. 
A = a. b Log I0/I1 = A 
* ε =absortividade molar 
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Lei de Beer 
2ª Lei da fotometria 
 Correlaciona energia e concentração; 
 Estabelece que quando a energia incidente atravessa uma solução a 
 quantidade de energia transmitida diminui exponencialmente com o 
aumento da concentração da solução 
Log I0/I1 = A 
Log I0/I1 = a . c 
a = constante característica da solução; 
c = concentração da solução atravessada 
pela luz. 
A = a. c 
Lei de Lambert-Beer 
3ª Lei da fotometria 
 
 A partir da combinação de 2 leis anteriores; 
 Correlaciona energia com o caminho ótico e a concentração. 
A = a. b. c Log I0/I1 = a. b. c ou 
 a = A(1%, 1 cm) ou ε 
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T = I1/I0 
T(%) = (I1/I0) x 100 
Transmitância 
Absorbância 
A = - log T 
A = - log (I1/I0) 
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TRANSMITIDA 
INCIDENTE 
Tipos de equipamentos para medida da radiação UV/visível 
Espectrômetros: geralmente empregam filtro para seleção do λ ; 
 
 - Geralmente cobrem a região do visível (COLORÍMETROS); 
 
 - São simples, robustos e de baixo custo; 
 
 - Podem ser acoplados a cromatógrafos e outros equipamentos (DETECTORES). 
Espectrofotômetros: empregam monocromadores para a seleção do λ; 
 
 - Geralmente cobrem a região do ultravioleta e do visível; 
 
 - Podem realizar a varredura de espectro (exemplo: 200 nm a 800 nm); 
 
 - Equipamentos mais modernos; 
 
 - Também podemser acoplados a cromatógrafos e outros equipamentos. 15 
Tipos de espectrofotômetros UV/visível 
Espectrofotômetro monofeixe – Leitura em absorbância 
- Ajustar 0% de transmitância (fecha-se o obturador entre a fonte de radiação e 
o detector); 
- Ajustar 100% de transmitância com a solução branco (obturador aberto): 
eliminar a interferência do solvente; 
- Passar para absorbância (0% de A) e determinar a leitura da solução padrão e 
da solução amostra. 
Monofeixe 
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obturador 
Fonte 
Radiação 
luminosa 
Um único feixe de luz (uma cubeta por vez) 
A 
B 
Tipos de espectrofotômetros UV/visível 
Duplo feixe 
Espelho rotatório 
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Feixe de luz dividido em 2 (autozero constante) 
A= amostra ou padrão 
B = branco 
branco 
Duplo feixe: corrige flutuações na potência da fonte e na 
resposta do detector; 
Tipos de espectrofotômetros UV/visível 
Multicanal = detecção por arranjo de fotodiodos 
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Monocromador fixo; 
 Detecção simultânea; 
Radiação policromática é incidida na 
amostra; 
 Medida rápida 
 
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Fontes de Radiação 
Contínuas 
Lâmpada de deutério (D2): 160 – 380 nm (UV) 
Lâmpada de tungstênio (W): 350 – 2.200 nm Visível/ IVpróximo 
Características ideais: intensidade da energia 
alta, uniforme e de baixo custo. 
 
Manutenção periódica 
Verificação da Energia. 
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Sistema ótico 
Seletores de comprimentos de onda: podem ser monocromadores ou filtros 
- Função: melhorar a seletividade e a sensibilidade dos equipamentos. 
Seletores de comprimento de onda que restringem a 
radiação incidente para uma banda estreita que é 
absorvida pelo analito. 
1. Filtros de radiação 
 a) Filtros de interferência: transmissão seletiva de uma estreita faixa de λ. 
 
 
 
 
 
 
 
 b) Filtros de absorção: absorção de toda a radiação de uma fonte contínua com 
exceção de uma banda estreita, a qual é escolhida para a leitura da amostra. 
 - Limitados a região do visível: isolam bandas com, no mínimo, 50 nm. Apresentam 
menor custo. Ex. placa de vidro colorido que remove parte da radiação incidente –
absorção. 
Radiação policromática 
Radiação de banda estreita 
Lâmina de vidro 
Camada de dielétrico 
Filme metálico 
2. Monocromadores ou 
policromadores: isolamento de 
bandas mais estreitas que os filtros, 
mais versáteis e mais caros. 
 a) Rede de difração 
 b) Prisma (instrumentos mais 
antigos) 
 
 Fenda de saída: isolar o λ de onda; 
 Largura da banda efetiva: 1 a 20 
nm; 
 Desempenho fotométrico = 
qualidade do monocromador 
Sistema ótico 
Seletores de comprimento de onda que restringem a 
radiação incidente para uma banda estreita que é 
absorvida pelo analito. 
Rede de difração e prisma são móveis 
Material Transparência Aplicabilidade 
 
Quartzo 150 - 3000 nm UV / visível 
 ou sílica fundida 
 
Vidro 375 - 2000 nm Visível 
Plástico 380 - 800 nm Visível 
Compartimento de amostra - Cubetas 
POSSO UTILIZAR O VIDRO NA ESPECTROFOTOMERIA NO UV?? 
22 
Detectores 
1) Fototubo 
 São dispositivos que lêem a energia incidente para produzir elétrons ou calor; 
 OBRIGATORIAMENTE devem gerar sinal proporcional a energia incidente. 
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óxido de 
césio ou 
magnésio 
 Resposta fundamentada no efeito 
fotoelétrico em um sistema 
fotossensível (cátodo); 
 Fotocátodo e ânodo, sob vácuo; 
 A luz extrai, de acordo com a 
intensidade, elétrons que interagem 
com o ânodo – produz corrente. 
Detectores 
2) Fotomultiplicador 
 São dispositivos que lêem a energia incidente para produzir elétrons ou calor; 
 OBRIGATORIAMENTE devem gerar sinal proporcional a energia incidente. 
Ânodo 
dinodos 
Cátodo 
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 Resposta similar ao fototubo; 
 Mais sensível (200 x); 
 Para cada fóton incidente são 
produzidos de 105 a 107 elétrons. 
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Detectores 
3) Estado sólido - fotodiodos 
 Uso de material semicondutor 
(constituído de silício); 
 Em presença de energia incidente faz os 
elétrons livres migrarem gerando corrente 
resultante da intensidade da radiação 
incidente; 
 Realização da leitura. 
 São dispositivos que lêem a energia incidente para produzir elétrons ou calor; 
 OBRIGATORIAMENTE devem gerar sinal proporcional a energia incidente. 
4. Sistema detector – arranjo de diodos – equipamentos multicanal 
Varredura eletrônica 
completa. 
Pontos coletados 
simultaneamente em 
uma série de fotodiodos 
em um cristal de silício. 
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Dispersão da 
radiação 
policromática Rapidez de análise 
Dispostos em um chip 
–  incide sobre estes 
Filme fino contendo 1000 unidades ou mais 
de diodos constituídos pelo material 
semicondutor (constituído de silício) Permitem a obtenção do espectro total de 
uma amostra em menos de um segundo. 
(equipamentos mais modernos). 
Detectores 
 Exatidão de λ: visa garantir um baixo desvio de posicionamento 
do sistema óptico. 
 Métodos de verificação: emissão da linha de deutério, xenônio ou 
mercúrio, método do perclorato de hólmio e filtro de óxido de 
hólmio. 
Calibração do equipamento 
27 Espectro de emissão da lâmpada de mercúrio 
 Luz espúria (Stray Light): quantidade de luz de 
comprimentos de onda (λ) diferentes do selecionado que 
atingem o detector. Causa desvios na Lei de Lambert-Beer, 
reduzindo a linearidade do sistema; 
 Oriunda do espalhamento e reflexões das superfícies em 
espelhos, filtros e janelas. 
 
 
 Exatidão fotométrica: medida de valores de absorbância 
conhecidos (valor esperado e o valor obtido). Teste 
utilizado: dicromato de potássio e filtro de vidro cinzento. 
Calibração do equipamento 
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Determinação qualitativa 
Comparação de espectros 
Espectro de absorção: representação da 
probabilidade de absorção em relação ao 
comprimento de onda (λ) 
Testes qualitativos utilizados em métodos farmacopeicos; 
 Monografia com dados da faixa de λ avaliados, solvente, concentração da 
solução, espessura da cubeta e substância química de referência 
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Aplicações na área farmácia industrial 
Padrão 
subst – 
SQR A 
Subst. 
A?? 
Curva padrão → formada pelos pontos onde o método obedece a lei 
de LAMBERT-BEER 
Plotagem de uma 
solução de concentração 
conhecida versus 
absorbância (A x C). 
y = 0,04804x + 0,00666 
r = 0,99991 
0 
0,2 
0,4 
0,6 
0,8 
1 
1,2 
1,4 
0 5 10 15 20 25 30 
A
b
s
o
rv
â
n
c
ia
 (
m
A
U
) 
Concentração (mg/ml) 
A 
B 
C 
A – Curva muito sensível; 
 
B – Curva 45º - Ideal 
 
C – Curva pouco sensível. 
 Equação da reta y =ax + b (mínimos quadrados) 
Determinação quantitativa na região UV 
30 
Aplicações na área farmácia industrial 
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6 
Determinação quantitativa de furosemida 
Solução amostra: transferiu-se 20,10 mg da amostra de furosemida para balão 
volumétrico de 50 mL com auxílio de 30 mL de hidróxido de sódio (NaOH) 0,1 mol/L. 
Agitou-se por 10 minutos e após concluir este processo, completou-se o volume com o 
mesmo solvente e homogeneizou-se. Diluiu-se 1,0 mL da solução resultante para balão 
volumétrico de 50 mL, completou-se o volume com NaOH 0,1 mol/L e homogeneizou-se. 
Solução padrão: transferiu-se 19,76 mg da SQR de furosemida para balão volumétrico de 
50 mL com auxílio de 30 mL de hidróxido de sódio (NaOH) 0,1 mol/L. Agitou-se por 10 
minutos e após concluir este processo, completou-se o volume com o mesmo solvente e 
homogeneizou-se. Diluiu-se 1,0 mL da solução resultante para balão volumétrico de 50 
mL, completou-se o volume com NaOH 0,1 mol/L e homogeneizou-se. 
Mediu-se as absorbâncias das soluções resultantes em 271 nm, utilizando NaOH0,1 
mol/L para ajuste do zero. Calcular o conteúdo de furosemida na matéria-prima, a partir 
das leituras obtidas. Leitura obtida com a solução amostra: 0,660; leitura da solução 
padrão: 0,645. 
Determinação quantitativa na região UV 
Cálculo pelo método de normalização de leitura (1 única 
concentração) 
31 
Aplicações na área farmácia industrial 
Resultado: 100,50% 
Determinação quantitativa na região UV 
Utilização dos valores de absortividade porcentual 
Aplicações na área farmácia industrial 
Resultado = 101,59% 
Resultado = 96,81% 
33 
ANTES DERIVATIZAÇÃO 
APÓS DERIVATIZAÇÃO 
Determinação quantitativa na região visível 
Derivatização – Método extrativo colorimétrico 
Aplicações na área farmácia industrial 
 Par iônico formado entre o fármaco e o 
reagente de pareamento iônico (azul 
de bromotimol) é extraído com 
clorofórmio ou diclorometano; 
Determinação quantitativa na região UV 
Determinação da cafeína em refrigerantes 
34 
Aplicações na área de alimentos 
 Extração da cafeína da matriz em 
meio alcalino com clorofórmio; 
 Leitura da absorbância em 276 nm; 
 Método da curva padrão com 
cinco concentrações. 
Toxicologia Experimental de Alimentos. Oliveira e Olivera, 2010 
Outras aplicações na área alimentícia: furfural em bebidas fermento-destiladas; 
concentração de corantes artificiais em pós para refresco, balas e gelatinas; nitrito 
em carnes; presença de BHA em óleos. 
A absorbância de uma solução de proteínas a 280 nm é diretamente proporcional ao seu 
conteúdo proteico, desde que essas contenham esses aminoácidos aromáticos na sua composição, 
especialmente triptofano; 
 A vantagem desse método é que ele não é destrutivo para a proteína. Em geral, considera-se que 
uma leitura de 1,0 A280 equivale a uma concentração de 1 mg/mL; 
Comprimento de onda 
A
b
s
o
rt
iv
id
a
d
e
 m
o
la
r,
 e
 
Determinação quantitativa na região ultravioleta 
Aplicações na análises clínicas 
Quantificação de proteínas totais 
Determinação quantitativa na região visível 
Métodos de Derivatização 
Aplicações na análises clínicas 
 Determinação de glicose pelo método da O-toluidina 
 
Formação de um complexo azulado e leitura entre 600 nm a 650 nm; 
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Determinação quantitativa na região visível 
Métodos de Derivatização 
Aplicações na análises clínicas 
 Determinação de proteínas totais pelo método de biureto 
Formação de um complexo como o corante e leitura entre 600 e 650 nm; 
 Determinação de albumina sérica pelo método do verde de bromocresol 
Formação de um complexo e leitura em 545 nm; 
OUTROS: determinação de ureia, ácido úrico, amônia, amilase, fosfatase 
ácida, aminotransferases.... 
Referências 
VINDADÉ, M.E.C.; VINADÉ, E.R.C. Métodos espectroscópicos de análise quantitativa. 
Santa Maria-RS: Editora da Universidade, 2005. 
 
HARRIS, D. Análise Química Quantitativa. 6. ed. Rio de Janeiro: LTC Editora, 2001. 
 
SKOOG, D.A. Princípios de Análise Instrumental. 5. ed., Porto Alegre: Editora Bookman, 
2002. 
 
BACCAN, N., ANDRADE, J. C., GODINHO, O., BARONE, J. S. Química Analítica 
Quantitativa Elementar. 3. ed. São Paulo: Editora Edgard Blücher Ltda, 2001. 
 
HOLLER, J. F., SKOOG, D. A., CROUCH, S. R. Princípios em Análise Instrumental. 6. ed. 
Editora Bookman, Porto Alegre, 2009. 
 
OLIVEIRA, M.V.P. Aplicações de estudos bioquímicos quantitativos em ciências biológicas 
e da saúde. Disponível em: 
http://www.fara.edu.br/sipe/index.php/renefara/article/viewFile/54/44 
 
VÍDEO ESPECTROFOTOMETRIA NO UV: https://www.youtube.com/watch?v=R4ZT3g2-
Ryg