Apostila Metodos Cromatograficos 2018 (1)

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UNIVERSIDADE ESTADUAL DE MARINGÁ 
Departamento de Farmácia 
Laboratório de Biologia Farmacêutica 
PALAFITO 
Programa de Pós-Gradua
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iênc ias Farmacêuticas 
 
 
 
 
Apostila Prática 
Métodos Cromatográficos Aplicados à Análise e Controle de 
Qualidade de Drogas Vegetais e Extratos Vegetais e 
Medicamentos Fitoterápicos 
 
 
 
 
 
 
 
Prof. Dr. João Carlos Palazzo de Mello 
 
 
 
Maringá, 2018 
 
 
Colaboradores na elaboração do material didático 
 
Ana Luiza Sereia 
André Oliveira Fernandes da Silva 
Cláudio Roberto Novello 
Daniela Cristina de Medeiros 
Danielly Chierrito 
João Carlos Palazzo de Mello 
Luana Magri Tunin 
Mariana Nascimento de Paula 
Mariane Roberta Ritter 
Naiara Cássia Gancedo 
Raquel Garcia Isolani 
 
 
 
 
SUMÁRIO 
 
Cromatografia em Papel .................................................................................... 4 
Cromatografia em Camada Delgada .................................................................. 6 
Cromatografia Líquida em Coluna .................................................................... 10 
Cromatografia em Coluna Flash ....................................................................... 13 
Cromatografia Líquida à Vacuo ........................................................................ 17 
Cromatografia em Contracorrente .................................................................... 20 
Cromatografia Líquida de Alta Eficiência ......................................................... 24 
Eletroforese Capilar .......................................................................................... 30 
 
 
 
 
 
4 
 
AULA 1 
Cromatografia em Papel 
 
Introdução 
A Cromatografia em Papel (CP) é uma técnica utilizada para analisar 
pequenas quantidades de amostras, principalmente aplicada na separação e 
identificação de compostos polares, como açúcares, antibióticos hidrossolúveis, 
aminoácidos, pigmentos e íons metálicos. Nesta técnica, a separação dos 
componentes de uma mistura é baseada na migração diferencial nas fases 
estacionária (papel cromatográfico) e móvel (solvente puro ou mistura de 
solventes). O mecanismo de partição favorece a separação devido ao conteúdo 
de água intrínseco do papel, ou inibição seletiva do componente hidrofílico da 
fase líquida pelas fibras de papel. O cromatograma é desenvolvido pela 
passagem lenta da fase móvel sobre a fase estacionária. O desenvolvimento 
pode ser ascendente, no caso de solvente carreado para cima através de forças 
capilares, ou descendente, no caso em que o fluxo do solvente é auxiliado por 
força da gravidade. 
 
Procedimentos 
1- Fase estacionária 
- Recortar papel filtro em quadrados de 5,0 cm x 5,0 cm; 
- Fazer uma linha suave a lápis a 0,5 cm do limite superior, e a 1,0 cm do limite 
inferior, onde deve ser marcado os pontos de aplicação das amostras, com 1,0 
cm de distância das bordas laterais e entre eles. 
 
2- Saturação da cuba cromatográfica 
- Colocar papel filtro nas paredes internas da cuba cromatográfica; 
- Adicionar a fase móvel (álcool) de modo que não ultrapasse 1 cm de altura; 
- Tampar a cuba e aguardar tempo necessário para que o eluente percorra todo 
papel filtro. 
 
3- Aplicação da amostra 
- Utilizar 3 tintas diferentes de canetas esferográficas e aplicá-las na fase 
estacionária nos pontos determinados acima; 
5 
 
- Colocar na cuba cromatográfica; 
- Aguardar tempo necessário para que ocorra, por capilaridade, a separação dos 
componentes da mistura, ou seja, as cores das tintas das canetas esferográficas; 
- Retirar da cuba e secar. 
 
4- Resultados 
- Anotar os valores do fator de retenção (Rf) de cada mancha observada. 
 
 
Figura 1. Representação do procedimento de Cromatografia em Papel. 
 
 
Referências 
Braibante, M. Cromatografia. Química Analítica Qualitativa Experimental. 
Disponível em: <http://w3.ufsm.br/laequi/wp-
content/uploads/2012/07/Cromatografia.pdf>. Acesso em: 14 fev. 2018. 
Collins, C.H., Braga, G.L., Bonato, P.S., 1997. Introdução a métodos 
cromatográficos, 7ª Ed. 
Farmacopeia Brasileira, 2010. Agência Nacional de Vigilância Sanitária. 
Cromatografia em Papel, 5ª Ed., vol. 1. 
Oliveira, G.A., Silva, F.C, 2017. Cromatografia em papel: reflexão sobre uma 
atividade experimental para discussão do conceito de polaridade. Química 
Nova, 39(2):162-169. 
 
6 
 
AULA 2 
Cromatografia em Camada Delgada 
 
Introdução 
A cromatografia é um processo físico-químico utilizado para a separação 
dos componentes de uma mistura, realizada por meio da distribuição dos 
componentes em duas fases que estão em contato íntimo: fase estacionária (FE) 
e fase móvel (FM). Durante a passagem da fase móvel sobre a fase estacionária, 
os componentes da mistura são distribuídos pelas duas fases, sendo as 
substâncias retidas de forma seletiva pela fase estacionária, resultando em 
migrações diferenciais. 
A Cromatografia em Camada Delgada (CCD) consiste na separação dos 
componentes de uma mistura, por meio da migração diferencial das substâncias 
sobre uma camada delgada de adsorvente retido sobre uma superfície plana, 
que constitui a fase estacionária. As vantagens desta técnica são: fácil 
compreensão e execução, separações rápidas, reprodutibilidade e baixo custo. 
Pode ser uma técnica analítica (qualitativa) ou preparativa (quantitativa). O 
processo de separação, normalmente é o de adsorção, podendo ocorrer também 
partição ou troca iônica, quando são utilizadas fase estacionárias tratadas. Entre 
os adsorventes disponíveis, ou seja, a fase estacionária, tem-se a sílica (SiO2), 
alumina (Al2O3), poliamida e celulose. A sílica é um dos adsorventes mais 
utilizados em cromatografia em camada delgada, sendo empregada na 
separação de compostos lipofílicos como aldeídos, cetonas, fenóis, ácidos 
graxos, aminoácidos, alcaloides, terpenoides e esteroides, usando o mecanismo 
de adsorção. 
Em alguns casos, pode ser necessário a ativação das placas. A sílica e 
alumina, podem ser ativadas em estufa a 105-110 ºC por 30-60 min. Outra etapa 
importante é a escolha da fase móvel, devendo ser considerado a natureza 
química das substâncias a serem separadas e a polaridade da fase móvel, que 
pode ser pura ou uma mistura de solventes. 
As amostras são aplicadas nas cromatoplacas na forma de soluções, 
com o auxílio de capilares, utilizando solventes bem voláteis, que são facilmente 
eliminados após a aplicação e com a distância de 1 cm entre cada amostra. As 
placas são então colocadas em uma cuba, contendo a fase móvel cobrindo todo 
7 
 
o fundo da cuba em uma altura inferior a aplicação das amostras (~ 1 cm de FM). 
Junto às paredes da cuba são colocados pedaços de papel filtro que permitem 
que a fase móvel suba por ele e sature o interior da cuba (Figura 2). 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Figura 2. Cromatografia em Camada Delgada (CCD). 
 
 Após o desenvolvimento das cromatoplacas, as placas são secas e 
reveladas, para que seja possível visualizar as substâncias incolores presentes 
na amostra. Os métodos de revelação empregados podem ser físicos, não 
destrutivos (luz UV nos comprimentos de 254 nm e 366 nm, câmara de iodo, 
vapores de amônia) ou químicos, destrutivos (H2SO4, vanilina sulfúrica, cloreto 
férrico (FeCl3)), e, após alguns são aquecidos à 100-120 °C para que a reação 
cromogênica ocorra. Não se deve esquecer de marcar a distância percorrida pela 
fase móvel e pela amostra para realizar o cálculo do Rf (fator de retenção). O 
valorde Rf (Figura 3) é um parâmetro físico da substância que pode ser utilizado 
para a sua identificação, por exemplo, aplicando na mesma cromatoplaca, além 
da amostra, uma substância padrão. Para isso, algumas condições devem ser 
mantidas como a utilização da mesma fase móvel, fase estacionária, condições 
ambientais, espessura da camada de FE na cromatoplaca e quantidade de 
amostra aplicada. 
Cromatoplaca 
com amostra 
Cromatoplaca 
dentro da cuba 
Solvente 
Papel filtro 
Cromatografia em 
desenvolvimento 
Cromatografia 
concluída 
8 
 
 
Figura 3. Cálculo do Fator de Retenção (Rf). x: distância percorrida pela amostra e 
y: distância percorrida pelo solvente. 
 
Procedimentos 
Material vegetal: Maytenus ilicifolia Mart. ex. Reissek., Celastraceae. 
Objetivo: realizar uma das etapas do controle de qualidade de M. ilicifolia, 
utilizando a técnica de Cromatografia em Camada Delgada (CCD) para a 
identificação da espécie vegetal (Farmacopeia Brasileira, 2010). 
Materiais e Método: Utilizar sílica-gel F254, com espessura de 250 μm, como 
suporte, e mistura de acetato de etila, ácido fórmico e água (90:5:5; v/v), como 
fase móvel. Aplicar, separadamente, à placa, em forma de banda, 10 µL da 
Solução (1) e 3 µL da Solução (2), recentemente preparadas, como descrito a 
seguir: 
 Solução (1): pesar exatamente cerca de 5 g da droga moída, acrescentar 
50 mL de água e aquecer sob refluxo durante 15 min. Após resfriamento 
à temperatura ambiente, filtrar a solução obtida em algodão, sob pressão 
reduzida, transferir para balão volumétrico de 50 mL e completar o volume 
com água destilada. 
 Solução (2): pesar cerca de 1 mg de epicatequina SQR (substância 
química de referência) e dissolver em 1 mL de metanol. 
 
Desenvolver o cromatograma. Remover a placa e deixar secar em 
capela de exaustão. Examinar sob luz ultravioleta (254 nm). O cromatograma 
obtido com a Solução (1) apresenta uma mancha de coloração bordô, na mesma 
altura que a obtida no cromatograma da Solução (2) (Rf de aproximadamente 
9 
 
0,82). Em seguida, nebulizar a placa com vanilina sulfúrica SR (solução 
reagente) e deixar em estufa a 110 ºC, durante 10 min. Após a visualização 
deverão ser observadas na Solução (1) duas manchas de coloração bordô com 
Rf de aproximadamente 0,82 para epicatequina e 0,72 para banda bordô que 
aparece logo abaixo (Figura 4). 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Figura 4. Cromatografia em camada delgada das soluções 1 e 2 de Maytenus ilicifolia. 
Placa ativada (A); placa não ativada (B); ambas reveladas com vanilina sulfúrica. 
Amostra (vermelho), padrão (azul). 
 
Referências: 
Farmacopeia Brasileira, 2010. Agência Nacional de Vigilância Sanitária. 5ª Ed., 
vol. 2. Brasília. Disponível em: 
<http://www.anvisa.gov.br/hotsite/cd_farmacopeia/index.htm>. Acesso em: 
fev. 2018. 
Collins, C.H., Braga, G.L., Bonato, P.S., 2006. Fundamentos de cromatografia. 
Campinas: Editora da UNICAMP, p. 452. 
 
A B 
10 
 
AULA 3 
Cromatografia Líquida em Coluna 
 
Introdução 
A cromatografia líquida é dividida em dois grupos, cromatografia líquida 
clássica e a cromatografia líquida de alta pressão. A cromatografia líquida 
clássica, que é realizada sob pressão atmosférica, com a vazão da fase móvel 
sendo a força da gravidade. 
A coluna consiste em um tubo de vidro vertical, com a extremidade 
superior aberta e a inferior afilada, terminando em uma torneira, permitindo o 
controle da vazão da fase móvel (Figura 5). 
A coluna será preenchida com um sólido (fase estacionária), que será 
suportado por um chumaço de algodão, lá de vidro ou placa de vidro sinterizada 
na parte inferior. O preenchimento da coluna deve ser feito da maneira mais 
uniforme possível para garantir maior eficiência da separação. O ar retido entre 
as partículas da fase estacionária, forma canais prejudicando a separação das 
substâncias. A fase estacionária deve ser misturada com a fase móvel e 
adicionada no topo da coluna, deixando que assente gradualmente. 
A fase móvel é responsável por promover o desenvolvimento dos 
componentes presentes na amostra. A seleção desse eluente é feita levando em 
consideração o poder eluente dos solventes, ou seja, de acordo com a habilidade 
de dessorver da fase estacionária as substâncias nele fixadas. 
11 
 
 
Figura 5. Coluna Cromatográfica - Fase estacionária Sephadex LH-20. 
 
Procedimentos 
a. Preparação da coluna: 
Em uma bureta de 20 mL, com a torneira fechada, colocar um pequeno 
chumaço de algodão embebido na fase móvel com um bastão de vidro, até o 
acomodar na conexão do corpo da bureta com a torneira (o algodão não deve 
ficar muito comprimido para não prejudicar a vazão). Adicionar 1/3 da fase móvel 
na bureta. Em seguida adicionar a suspensão da fase estacionária na fase 
móvel. Abrir a torneira e deixar o líquido escoar e a fase estacionária se 
sedimentar. 
Após toda a fase estacionária estar dentro da coluna, passar 2 ou 3 vezes 
o volume da fase móvel para acertar o enchimento. 
 
b. Preparação da fase móvel: 
Gradiente 1: Metanol: TFA: água – 19,8: 0,2: 80,0 (v/v) 
Gradiente 2: Metanol: TFA: água – 69,8: 0,7: 29,5 (v/v) 
 
c. Preparação da amostra: 
Preparar o extrato bruto de Juçara (Euterpe edulis Mart.) em água. 
 
12 
 
d. Procedimento: 
Com a torneira da coluna fechada, adicionar a amostra cuidadosamente a 
amostra no topo da coluna, para que não formem buracos na fase estacionária. 
Adicionar com cuidado alguns mL da fase móvel e abrir a torneira para começar 
a eluição. Adicionar mais fase móvel, recolhendo frações a cada 5 mL. 
 
Referências 
Collins, C.H., Braga, G.L., Bonato, P.S., 2006. Fundamentos da Cromatografia. 
Campinas, SP: Editora Unicamp. 
 
13 
 
AULA 4 
Cromatografia em Coluna Flash 
 
Introdução 
A cromatografia é um método físico-químico de separação fundamentado 
na migração diferencial dos componentes de uma mistura, que ocorre devido a 
diferentes interações, entre duas fases imiscíveis, a fase móvel e a fase 
estacionária. A grande variedade de combinações entre fases móveis e 
estacionárias a torna uma técnica extremamente versátil e de grande aplicação. 
Esta técnica é muito utilizada para isolamento de produtos naturais e purificação 
de produtos de reações químicas de síntese (COLLINS, et al., 1997; DEGANI, 
et al. 1998). 
Dentre as mais diversas formas de cromatografia, temos o sistema flash, 
um tipo particular de cromatografia em coluna. Na cromatografia em coluna, 
usamos um suporte sólido (fase estacionária), acondicionado em tubos 
cilíndricos geralmente de vidro, de diâmetros variados, os quais possuem uma 
torneira em sua extremidade inferior. O adsorvente, comumente sílica gel 60, 
possui partículas na faixa de 60-230 mesh, de modo a possibilitar um fluxo 
razoável do solvente através da coluna. O uso de sílica de partícula menor (230-
400 mesh) para essas colunas, requer a utilização de um sistema de 
bombeamento para o empacotamento e eluição, sendo este sistema conhecido 
como cromatografia flash. Este sistema utiliza baixas pressões de ar ou 
nitrogênio gasoso pressurizados no topo da coluna para impelir a fase móvel 
através da fase estacionária com um fluxo adequado, uma vez que a pressão 
atmosférica geralmente não é suficiente. O controle do fluxo da coluna é obtido 
controlando-se a pressão do gás. São utilizadas colunas de pequeno porte para 
obter separações mais rápidas que nas colunas ordinárias e com menor difusão 
dos componentes da mistura. É uma técnica que pode oferecer resolução, 
reprodutibilidade, e garantir a purificação rápida de misturasa níveis aceitáveis, 
desde que o fator de retenção (Rf), determinado por CCD, seja igual ou superior 
a 0,15 (SILVA et al. 2015; RANI et al., 2014; STEVENS JUNIOR; HILL, 2009; 
DEGANI, et al. 1998). 
O objetivo desta aula é utilizar a cromatografia flash para separar os 
pigmentos de pimentões vermelhos. O pimentão (Capsicum annuum L.) é uma 
14 
 
planta da família Solanaceae, cuja cor depende da capacidade de sintetizar 
carotenoides e de reter pigmentos de clorofilas. Os pimentões verdes e amarelos 
devem sua coloração principalmente à presença de carotenos e de carotenoides 
oxigenados, tais como as criptoxantinas. Nos pimentões vermelhos, há também 
carotenoides polioxigenados, tais como as capsantinas e capsorubina. São 
encontrados na natureza vários derivados da capsantina, sobretudo derivados 
epoxidados, e os carotenoides hidroxilados ocorrem na natureza sob a forma de 
ésteres (RIBEIRO e NUNES, 2008). 
 
Procedimentos 
1- Obtenção dos extratos 
Picar 30 g de pimentões vermelhos em pedaços pequenos. Adicionar 10 
mL de acetona e 50 mL de hexano. Triturar com auxílio de gral de porcelana com 
pistilo, e deixar em repouso por 1 h. Após, filtrar a mistura em funil comum, com 
papel de filtro pregueado. Em seguida separar a fase aquosa dos filtrado em funil 
de separação. Adicionar sulfato de sódio anidro na fração hexânica. Filtrar e 
concentrar até o volume final de aproximadamente 1 mL. 
 
2- Preparação da fase móvel 
Preparar 200 mL de uma mistura de hexano/acetona (70:30) em uma 
proveta com tampa. Agitar a mistura. 
 
3- Empacotamento da coluna 
Prepare uma coluna para cromatografia flash utilizando silica gel 60 (230-
400 mesh) como fase fixa, da seguinte maneira: agite com um bastão em um 
béquer, 15 a 20 g de silicagel no eluente inicial (fase móvel), até obter uma pasta 
fluida, homogênea e sem bolhas de ar incluídas. Encha a terça parte da coluna 
cromatográfica com a fase móvel e derrame, então, a pasta fluida de silicagel, 
de modo que ela sedimente aos poucos e de forma homogênea. Caso haja 
bolhas de ar oclusas na coluna, golpeie-a suavemente, de modo a expulsá-las. 
Controle o nível do solvente abrindo ocasionalmente a torneira da coluna, e/ou 
adicionando pressão de ar ou nitrogênio no topo da coluna. Terminada a 
preparação, o nível de eluente deve estar 1 cm acima do topo da coluna. 
 
15 
 
4- Aplicação da amostra e separação dos componentes 
Distribua a fração hexânica de pimentão homogeneamente sobre o topo 
da coluna, com auxílio de uma pipeta ou conta-gotas. Abra a torneira e, após a 
adsorção pela coluna, proceda a eluição com a fase móvel, vertendo 
cuidadosamente o eluente pelas paredes internas da coluna, tomando cuidado 
para não causar distúrbios ou agitação na coluna. Ao mesmo tempo, abra a 
torneira para escoar o solvente e adicione pressão, ajustando cuidadosamente 
o fluxo. Elua a coluna, coletando as frações em tubos de ensaio, até que toda a 
amostra seja separada (Figura 6). 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Figura 6. Representação do procedimento de Cromatografia Flash. (Adaptado de: 
Chemistry Olympiad. Problemas Experimentais. 12 de Julho de 2011. Ankara, Turkey) 
 
Referências 
Collins, C.H., Braga, G.L., Bonato, P.S., 1997. Introdução a métodos 
cromatográficos. 7ª Ed. 
Degani, A.L.G., Cass, Q.B., Vieira, P.C., 1998. Cromatografia um breve ensaio, 
Química Nova na Escola, n.7. 
16 
 
Rani, E.M., Shilpa, K., Rao, V.U., 2014. Flash chromatography and its 
advancement: an overview. International Journal of Pharmaceutical 
Research & Analysis, 4: 328-334. 
Ribeiro, N.M., Nunes, C.R., 2008. Análise de Pigmentos de Pimentões por 
Cromatografia em Papel. Química Nova na Escola, 29. 
Silva, L.M.A.E, Ribeiro, P.R.V.; Rodrigues, T.H.S.; Brito, E.S. de, Canuto, K. M., 
Zocolo, G.J. Uso da cromatografia flash para a separação dos principais 
componentes do líquido da castanha-de-caju técnico, em escala preparativa. 
Fortaleza: Embrapa Agroindústria Tropical, 2015. Páginas: 6 p. Série: 
(Embrapa Agroindústria Tropical. Comunicado Técnico). 
Stevens Jr.W.C., Hill, D.C., 2009. General methods for flash chromatography 
using disposable columns. Molecular Diversity, 13:247-252. 
 
 
 
17 
 
AULA 5 
Cromatografia Líquida à Vacuo 
 
Introdução 
A cromatografia é um processo físico-químico utilizado para a separação 
dos componentes de uma mistura, realizada por meio da distribuição dos 
componentes em duas fases que estão em contato íntimo: fase estacionária (FE) 
e fase móvel (FM). Durante a passagem da fase móvel sobre a fase estacionária, 
os componentes da mistura são distribuídos pelas duas fases, sendo as 
substâncias retidas de forma seletiva pela fase estacionária, resultando em 
migrações diferenciais. 
O isolamento de substâncias a partir de drogas vegetais pode ser 
realizado empregando-se métodos cromatográficos, sendo a cromatografia em 
coluna a mais utilizada. A Cromatografia Líquida à Vácuo (CLV), uma variante 
da cromatografia em coluna, foi proposta inicialmente por Targett et al. (1979), 
como método alternativo com finalidade de separação de pequenas e grandes 
quantidades de misturas de substâncias. A CLV é uma técnica eficiente e de 
baixo custo, podendo ser empregada com fins analíticos qualitativos ou mesmo 
quantitativos. 
Uma etapa importante na realização de qualquer método cromatográfico 
é a escolha da fase estacionária e da fase móvel, devendo ser considerado a 
natureza química das substâncias a serem separadas e a polaridade da fase 
estacionária e móvel, sendo que a última pode ser pura ou uma mistura de 
solventes. 
Procedimento 
Material vegetal: cascas secas e cominuídas de Croton floribundus Spreng., 
Euphorbiaceae. 
Objetivo: realizar o fracionamento do extrato bruto de acetato de etila das cascas 
de C. floribundus, utilizando a técnica de Cromatografia Líquida à Vácuo (CLV). 
Materiais e Método: Utilizar uma coluna de vidro (d= 1,5 cm; h= 32,5 cm) 
acoplada com compressor de ar (sistema de vácuo). Empacotar a coluna com o 
gel de sílica 60 (FE) (70-230 Mesh ASTM, Merck), preenchendo 2/3 do volume 
da coluna. Aplicar a fórmula v=π.r2.h para descobrir o volume da coluna (DICA: 
18 
 
sabe-se que para uma coluna com volume de 25 mL, utilizam-se 10g de FE). 
Reservar ¼ de FE para preparar a amostra. Para o preparo da amostra, pesar 
0,2 g de extrato bruto e misturar com ¼ de FE, homogeneizando em grau de 
vidro com diclorometano. Esperar a mistura amostra/FE secar totalmente, e 
após, solubilizar com o primeiro solvente da FM e aplicar na coluna já 
empacotada e estabilizada com o primeiro solvente da FM. 
 Fase Móvel: n-hexano; n-hexano: acetona (5:5, v/v); acetona; acetona: 
metanol (5:5, v/v); metanol, metanol: água (5:5, v/v); água. 
 Preparo do extrato bruto: pesar 5 g da droga moída, acrescentar 50 mL 
de acetato de etila (1:10, p/v) e realizar a extração utilizando o aparelho de Ultra-
turrax® (turbólise) durante 15 min, com pausas de 5 min. Após filtrar a solução 
obtida em algodão, sob pressão reduzida, transferir para balão volumétrico de 
50 mL e completar o volume com acetato de etila (extrato bruto, EB). Concentrar 
o EB sob pressão reduzida e liofilizar. Acondicionar em frasco hermeticamente 
fechado em freezer a -20 ºC até o momento de uso. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Figura 7. Cromatografia Líquida à Vácuo - Extrato bruto acetato de etila de Croton 
floribundus. 
 
19 
 
Referências: 
Collins, C.H., Braga, G.L., Bonato, P.S. Fundamentos de cromatografia. 
Campinas: Editorada UNICAMP, 2006. 452p. 
Saito, E., Furlan, C., Lopes, G.C., Mello, J.C.P. A cromatografia líquida a vácuo 
na análise qualitativa e quantitativa de flavonoides em Achyrocline 
satureioides. Revista Fitos, 1(1), 2005. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
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AULA 6 
Cromatografia em Contracorrente 
 
Introdução 
Na cromatografia em contracorrente a separação ocorre por um processo 
conhecido como partição líquido/líquido, pois ambas as fases (móvel e 
estacionária) são líquidas (BERTHOD, 1991). A ausência de suportes sólidos 
pode evitar uma possível adsorção irreversível da amostra e a degradação de 
substâncias ativas, presentes na mesma (MARSTON; HOSTETTMANN, 1994), 
e possibilita a injeção de uma quantidade significativa de amostra, não sendo 
necessária sua pré-purificação. Possui como vantagem pouca perda de amostra, 
assim como um baixo consumo de solventes orgânicos (MANDAVA; ITO, 1998). 
A eficiência dessa técnica está relacionada com a definição ideal do sistema 
eluente a ser utilizado (CONWAY, 1989). 
 
Existem três tipos de cromatógrafo em contracorrente: 
1) Contracorrente em gotas ("DCCC: Droplet Counter-Current 
Chromatography"): gotas da fase móvel passam pela fase estacionária, assim, 
o soluto é particionado entre as duas fases imiscíveis. Colunas de vidro dispostas 
verticalmente e em série, são acopladas uma a outra por tubos de teflon. A fase 
móvel é administrada de forma ascendente ou descendente, dependendo de sua 
densidade se comparando com a fase estacionária. Nesta técnica utiliza-se 
sistema eluente ternário ou quaternário. O uso de sistema binário quase não 
ocorre, pois o uso de um sistema eluente com três ou mais solventes diferentes, 
ajuda a diminuir a diferença de polaridade entres as duas fases, como também, 
possibilita uma maior seletividade do sistema (MARSTON; 
HOSTETTMANN,1994). 
 
2) Contracorrente Locular Rotacional ("RLCC: Rotation locular 
Counter-Current Chromatography"): o equipamento é composto por 16 
colunas, em geral de vidro, cada uma possui 16 compartimentos e ficam 
posicionadas ao redor de um eixo rotacional, no qual seu ângulo de inclinação e 
sua velocidade rotacional podem variar (SNYDER et al., 1984). As análises 
podem ocorrer de forma ascendente ou descendente. Em relação à técnica 
21 
 
acima descrita, a RLCC, possui baixa resolução, porém, existem estudos que 
descrevem o seu uso em separações de substâncias naturais (DOMON et al., 
1982; KUBO, 1991). 
 
3) Contracorrente de Alta Velocidade (CCCAV) ("HSCCC: High-Speed 
Counter-Current Chromatography"): é o método em contracorrente mais 
usado para a separação de produtos naturais. Possui uma bobina de tubo de 
teflon enrolada, em formato espiral, em multicamadas. Ao redor de um eixo 
central apresenta uma coluna, na qual se induz um movimento de natureza 
rotacional e translacional ou planetária, em alta velocidade ou cerca de 800 rpm. 
Esse movimento planetário exerce duas importantes funções para que ocorra 
uma separação eficiente: um mecanismo de rotação do sistema eluente livre de 
interferentes, de modo que a fase móvel flui continuamente através da coluna de 
separação e a segunda que realiza um movimento hidrodinâmico do sistema 
eluente no interior da coluna, quando as duas fases (móvel e estacionária), que 
são dois líquidos imiscíveis, são injetadas em uma das extremidades da coluna, 
a rotação separa por completo as duas fases ao longo da coluna, à medida que 
a fase mais leve ocupa a região chamada cabeça e a fase mais pesada ocupa a 
região chamada cauda (ITO,2005). Comumente encontram-se sistemas 
eluentes compostos por três (ternário) ou quatro (quaternário) solventes 
diferentes, isso para proporcionar uma separação mais eficiente (SANTOS; 
MELLO, 2007). 
Neste método a fase estacionária fica retida dentro do equipamento por 
uma força centrífuga, enquanto que, a fase móvel percorre todo o conjunto a 
uma vazão de cerca de 1,0 mL/min dependendo do sistema, garantido assim, 
um menor tempo de trabalho, em relação às outras técnicas de contracorrente. 
A CCCAV possui algumas vantagens se comparado aos outros métodos de 
contracorrente, tais como, menor tempo na realização da análise e menor 
consumo de solventes (MARSTON; HOSTETTMANN, 1994). 
 
Equipamento utilizado no laboratório Palafito 
O cromatógrafo em contracorrente de alta velocidade (CCCAV) utilizado 
no laboratório Palafito foi manufaturado nas dependências da Universidade 
Estadual de Maringá e é equipado com coluna de politetrafluoroetileno (PTFE) 
22 
 
de 2,5 mm de diâmetro interno, possuindo capacidade total de 325 mL, injetor 
com capacidade de 10 mL de amostra e bomba de solvente de duplo pistão, com 
capacidade de vazão máxima de 10 mL/min (Figura 7). 
O sistema eluente deve ser previamente estabelecido de acordo com as 
características da amostra, como também por semelhança de polaridade das 
substâncias presentes na amostra e a polaridade do sistema eluente. 
 
Procedimentos 
Entre 100 e 300 mg de uma subfração obtida a partir da fração acetato de 
etila, da Trichilia catigua (catuaba), obtidas a partir de coluna clássica, podem 
ser injetadas na coluna do equipamento, respeitando a capacidade total da 
mesma (325 mL). 
Serão coletadas alíquotas em tubos de ensaios sempre com volume 
definido (cerca de 5 mL), as quais serão monitoradas por CCD e reunidas por 
semelhança cromatográfica. A vazão da fase móvel deverá ser determinada para 
cada amostra individualmente, variando entre 0,7 a 1,0 mL/min (RESENDE, 
2007). 
 
 
Figura 8. Equipamento CCCAV. A. Coletor com tubos; B. Sistema CCCAV (Contrapeso 
e coluna); C. Bomba purificadora de amostras. Fonte: Letícia Maria Krzyzaniak, 2015. 
 
Referências 
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chromatography. Journal of Chromatography, 550:677-693. 
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Application. VCH: Weinheim. 
23 
 
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enantiomers of (±)-norephedrine by rotation locular counter-current 
chromatography. Journal of Chromatography, 250:149-151. 
Ito, Y., 2005. Golden rules and pitfalls in selecting optimum conditions for high 
speed counter-current chromatography. Journal of Chromatography A, 
1065:145-168. 
Kubo, I., 1991. Recent applications of counter-current chromatography to the 
isolation of bioactive natural products. Journal of Chromatography A, 
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Mandava, N.B.; Ito, Y., 1998. Countercurrent Chromatography - Theory and 
practice, Marcel Dekker: New York. 
Marston, A.; Hostettmann, K., 1994. Counter-current chromatography as a 
preparative tool - applications and perspectives. Journal of Chromatography 
A, 654:315-341. 
Resende, F.O., 2007. Trichilia catigua: avaliação farmacognóstica, 
fitoquímicaebiológica in vitro, Ciências Farmacêuticas. Universidade 
Estadual de Maringá, Maringá. 
Santos, S.C.; Mello, J.C.P. Taninos, 2007. In: SIMÕES, C.M.O. et al. (Org.). 
Farmacognosia: da Planta ao Medicamento. Porto Alegre, Florianópolis: 
Editora da UFSC e Editora da UFRGS. 
Snyder, J.K.; Nakanishi, K.; Hostettmann, K.; Hostettmann M., 1984. Applications 
of rotation locular counter-current chromatography in natural products 
isolation. Journal of Liquid Chromatography, 7:243. 
 
24 
 
AULA 7 
Cromatografia Líquida de Alta Eficiência 
 
Introdução 
A Cromatografia Líquida de Alta Eficiência (CLAE) é uma técnica 
amplamente empregada para caracterização e análises quantitativasde 
diferentes amostras, sejam elas biológicas, sintéticas ou de material vegetal 
(FERNANDEZ et al., 2009). 
Na fitoquímica o método pode ser utilizado para o isolamento de 
substâncias, assim como, para o controle de pureza de compostos isolados. A 
CLAE também permite a caracterização e a análise quantitativa dos marcadores 
químicos em extratos vegetais, possibilitando a criação de um perfil 
cromatográfico da espécie em estudo, sendo este, um parâmetro comparativo 
para se detectar diferenças e semelhanças entre extratos obtidos nas mesmas 
condições de extração e análise, sendo esta uma das formas de se manter um 
padrão de qualidade dos extratos (HENDRIKS, et al., 2005). 
O método de análise por CLAE tem como princípio a interação 
diferenciada dos componentes da amostra com uma fase estacionária (sólida) 
e uma fase móvel (líquida). Os sinais analíticos das substâncias presentes na 
amostra são identificados com auxílio de detectores apropriados, que aumentam 
consideravelmente a sensibilidade e a seletividade na análise das substâncias 
de interesse, tais como, o detector ultravioleta (UV), detector de arranjo de 
diodos (DAD) e o espectrômetro de massas (EM) (DINELLI, et al., 2009). 
Dentre as principais vantagens do método de análise por CLAE destacam-
se a rapidez e desempenho analítico satisfatórios, automação, análises 
qualitativas e quantitativas e sistema de alta pressão (coluna analítica e fase 
móvel). 
Num sistema ideal de CLAE (Figura 8) a fase móvel (FM) deve ser 
bombeada sob pressão para dentro da coluna (200-300 atm) e para não 
sacrificar a eficiência, a velocidade da FM deve ser constante. As colunas não 
devem ser grandes para evitar excessivas diferenças entre as pressões da FM 
na entrada e na saída da coluna. Como as colunas são pequenas, o material de 
empacotamento (enchimento) destas colunas deve ter grande superfície e 
uniformidade (partículas de 5-50 µm de diâmetro). A amostra a ser injetada na 
25 
 
coluna deve ser pequena (10-500 µL) para permitir boas resoluções, o que torna 
crítico o sistema de detecção. A aplicação da amostra é problemática: é 
praticamente impossível injetar, com seringa, uma amostra num líquido que está 
a uma pressão de 30 atm na cabeça da coluna. Como esta pressão é quase o 
mínimo com que se trabalha em CLAE, é comum o uso de válvulas de injeção, 
contornando assim este problema. 
 É importante explicar operacionalmente o termo eficiência a fim de 
justificar o nome CLAE. A eficiência de um sistema cromatográfico se traduz por 
picos agudos no cromatograma. Todos os sistemas de CLAE possuem esta 
característica, o que lhe assegura, invariavelmente, excelentes Resoluções 
(capacidade de separar componentes). 
Figura 9. Esquema simplificado dos componentes de um cromatógrafo líquido de alta 
eficiência. 
 
26 
 
 
Figura 10. Cromatógrafo líquido de alta eficiência - Laboratório Palafito, bloco K80. 
 
 
Figura 11. Cromatógrafo líquido de alta eficiência (Thermo) - Laboratório Palafito, bloco 
T22. 
27 
 
Sistemas cromatográficos utilizados para a espécie 
Euterpe edulis Mart. (Juçara): 
 
1. Sistema para isolamento da substância Cianidina-3-O-rutinosídeo: 
(Fossen, et al., 2000) 
Sephadex LH-20 
Metanol : TFA : Água  Gradiente 1  19,8 : 0,2 : 80,0 (v/v) 
 Gradiente 2  69,8 : 0,7 : 29,5 (v/v) 
 
- Extrato: Fase Móvel = 1:1 (3,0 g: 3,0 L) 
- Proporção solvente: Fase móvel 1: Fase móvel 2 = 0,25:0,75 (v/v) 
- Proporção tempo: Fase móvel 1: Fase móvel 2 = 0,3:0,7 (v/v) 
 
OBS.: Fase móvel 1 usada até eluição total da substância que está em menor 
quantidade e que forma inicialmente como um anel bem definido na parte 
superior da coluna, esta substância elui por todo volume da coluna 
(correspondendo a aproximadamente 25% do total de fase móvel) em seguida a 
fase móvel 1 é substituída pela 2 para eluição da substância de interesse 
(Cianidina-3-O-rutinosídeo). 
 
- Preparar o extrato bruto em água destilada na proporção 40 mg/mL. 
*O extrato é altamente solúvel em água sendo necessário somente auxílio de 
bastão de vidro para homogeneização. 
 
2. Sistema cromatográfico para CLAE: 
Fase estacionária: Coluna Gemini 5 μm RP-18 (150 mm×4.6 mm) 
Vazão: 0,4 mL/min 
Detecção em 520 nm 
Injeção: 10 µL 
Extrato bruto: 500 mg/mL  metanol 20% 
 
 
28 
 
Tempo 
(min) 
A (água + 0,25% de 
ácido fórmico) 
B (metanol + 0,25% de 
ácido fórmico) 
0 90% 10% 
5 80% 20% 
13 75% 25% 
20 60% 40% 
30 55% 45% 
34 30% 70% 
38 90% 10% 
40 90% 10% 
44 90% 10% 
 
Referências 
Borges, G.S.C., Vieira, F.G.K., Gonzaga, C.C.L.V., Zambiazi, R.C., Filho, J.M., 
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Março, P.H, Poppi, R.J. Procedimentos Analíticos para identificação de 
antocianinas presentes em extratos naturais. Química Nova, 31(5):1218-
1223, 2008. 
Dinelli, G., Carretero, A.S., Di Silvestro, R., Marotti, I., Fu, S., Benedettelli, S., 
Ghiselli, L.; Gutierrez, A.F., 2009. Determination of phenolic compounds in 
modern and old varieties of durum wheat using liquid chromatography 
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1216:7229-7240. 
Fernandez, R. S., et al., 2009. Validação do método de extração e quantificação 
de 7-hidróxi- 4’,6-dimetóxi-isoflavona em culturas de células em suspensão 
e calos de Dipteryx odorata. Eclética Química, 34(1). 
Fossen, T.; Slimestad, R.; Ovstedal, D.O.; Andersen, O.M., 2000. Covalent 
anthocyanin -flavonol complexes from flowers of chive, Allium 
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29 
 
Hendriks, M.M.W.B., et al., 2005. Preprocessing and exploratory analysis of 
chromatographic profiles of plant extracts. Analytica Chimica Acta, 545:53-
64. 
 
 
30 
 
AULA 8 
Eletroforese Capilar 
 
Introdução 
A eletroforese foi primeiramente descrita por Tiselius na década de 30, 
que definiu a técnica como a migração de espécies eletricamente carregadas em 
um condutor líquido, sob a ação de um campo elétrico. Tal técnica foi 
denominada “eletroforese de fronteira móvel” (Tavares, 1996). Atualmente, a 
separação de substâncias em técnicas de eletroforese se dá por diferenças de 
mobilidades eletroforéticas, partição de fase, pH, tamanho molecular, ou a 
combinação de uma ou mais dessas propriedades (Kvasnicka, 2007). 
A Eletroforese Capilar (EC) representa uma fusão das tecnologias 
derivadas da eletroforese tradicional e da cromatografia líquida de alta eficiência 
(CLAE) e permite a separação de moléculas baseada na migração dessas 
espécies por meio de um fluido sobre a influência de um campo elétrico. O fluido, 
conhecido como tampão de corrida, é uma solução que mantém o pH e fornece 
condutividade suficiente para permitir a passagem da corrente necessária para 
a separação. Esta técnica tem se sobressaído nas últimas décadas por sua 
automação, reprodutibilidade e confiabilidade e apresenta vantagens como alta 
eficiência, alta resolução, alta seletividade, curto tempo de análise, baixo 
consumo de reagentes, pequeno volume de amostra, boa recuperação e menor 
custo quando comparada à CLAE (Baker, 1995; Chu et al., 2008; Evans & 
Stalcup, 2003; Heegaard et al., 1998; Hu & Martin, 1999; Lunte et al., 2002; Mello 
& Ito, 2011; Tagliaro et al., 1998; Weinberger, 1993). 
O sistema de EC (Figura 12) consiste em um capilar de sílica fundida, com 
10 a 120 cm de comprimento e 5 a 100 µmde diâmetro interno, preenchido com 
um tampão e colocado entre dois reservatórios com eletrodos imersos no 
tampão. Uma fonte de energia de alta voltagem é utilizada para aplicar um 
campo elétrico através do capilar de até 30 kV e corrente elétrica de 0 a 300 µA. 
Em polaridade normal, a carga na parede interna do capilar, provoca o fluxo 
eletro-osmótico na direção do ânodo (eletrodo positivo, onde a amostra é 
aplicada) para o cátodo (eletrodo negativo, onde a amostra é analisada). A 
detecção pode ser realizada diretamente no capilar (on-line) em tempo real, 
criando-se uma janela óptica pela remoção de uma pequena parte do 
31 
 
revestimento de poliamida do capilar. Os detectores comumente utilizados são 
por ultravioleta (UV), espectrofotometria de massas (EM) e fluorescência 
induzida por laser. A injeção da amostra pode ser realizada por duas formas: 
eletrocinética ou sifonamento (Heegaard et al., 1998; Hu & Martin, 1999; Linhardt 
& Toida, 2002; Lunte et al., 2002; Mello & Ito, 2011; Tagliaro et al., 1998; 
Weinberger, 1993). 
 
 
 
 
 
 
 
 
Figura 12. Representação esquemática do sistema de Eletroforese Capilar (EC). Fonte: 
Mello & Ito, 2011. 
 
No capilar, os analitos migram baseados na combinação entre as forças 
eletroforética e eletro-osmótica. Esta última controla a velocidade e a resolução 
da separação. Em geral, os íons positivos (cátions) migram primeiro, seguidos 
pelos compostos neutros e, finalmente, os íons negativos (ânions) (Guterres, 
2005; Hu & Martin, 1999; Linhardt & Toida, 2002; Lunte et al., 2002; Tagliaro et 
al., 1998; Weinberger, 1993). 
Os modos utilizados de EC são eletroforese capilar em gel (ECG), 
eletroforese capilar de zona (ECZ), cromatografia capilar eletro-osmótica (CCE), 
cromatografia capilar eletrocinética micelar (CCEM), focalização isoelétrica 
capilar (FIC) e isotacoforese capilar (ITFC) (Baker, 1995; Guterres, 2005; Hu & 
Martin, 1999; Mello & Ito, 2011; Tagliaro et al., 1998; Weinberger, 1993). Dentre 
os modos, a ECZ destaca-se como a mais reprodutível (Weinberger, 1993) e 
utilizada, devido ao seu poder de separação, versatilidade e simplicidade de 
operação (Guterres, 2005; Hu & Martin, 1999; Wang, 2000). Os tampões 
normalmente empregados são fosfato, borato, citrato ou fosfato-borato, em altas 
concentrações, por apresentarem melhor capacidade tamponante e reduzirem a 
32 
 
adsorção de analitos à parede do capilar, principalmente em análises de 
amostras biológicas (Tagliaro et al., 1998). 
A EC aplica-se à análise de uma variedade de amostras, incluindo 
hidrocarbonetos aromáticos policíclicos, substâncias hidro ou lipossolúveis, 
metabólitos, aminoácidos, íons inorgânicos, ácidos orgânicos, carboidratos, 
poluentes ambientais, nucleosídeos e nucleotídeos, fármacos, catecolaminas, 
peptídeos, proteínas, biomarcadores, herbicidas, drogas, biopolímeros e 
extratos vegetais (Baker, 1995; Evans & Stalcup, 2003; Heegaard et al., 1998; 
Hu & Martin, 1999; Lunte et al., 2002; Mello & Ito, 2011; Sereia et al., 2017; 
Tagliaro et al., 1998). 
 
Procedimentos 
Soluções eletroforéticas 
 Água ultrapura (Milli-Q Water System); 
 Metanol grau HPLC; 
 Ácido Clorídrico (HCl) 1 mol/L (para condicionamento de capilares novos); 
 Hidróxido de sódio 1 mol/L; 
 Solução tampão borato 80 mmol: Preparar solução de tetraborato de 
sódio (A) e ácido bórico (B) a 80 mmol. Utilizando um pHmetro, adicionar 
2 mL da solução A e 8 mL da solução B, ajustar o pH para 8,8; 
 Solução amostra 1 mg/mL. 
 
Preparo de amostra 
 Pesar 10 mg da amostra, adicionar em balão volumétrico de 10 mL e 
completar o volume com metanol 20%. Posteriormente as amostras devem ser 
submetidas a extração em fase sólida (SPE) utilizando cartucho C18 de 3 mL 
(Agilent SampliQ - Agilent Technologies), previamente condicionado com 
metanol e água ultrapura. Caso o limite de detecção do equipamento seja 
ultrapassado deve-se ajustar a concentração da amostra. 
 A solução amostra, tampões de corrida e soluções de limpeza devem ser 
filtradas em membrana 0,45 µm (Merck Millipore – HAWP 01300). 
 
 
33 
 
Procedimento 
 Preparar 3 vials de 1,8 mL contendo tampão, 2 com água ultrapura, 2 com 
solução de limpeza de NaOH 1 mol/L e 4 vials vazios para secagem e descarte. 
 Primeiramente deve ser realizada a sequência de limpeza do capilar, 
previamente programa no equipamento. Essa sequência deve ser realizada 
sempre entre amostras diferentes. Em caso de capilares novos, deve ser 
realizado o condicionamento prévio com HCl 1 mol/L por 20 min, com posterior 
sequência de lavagem. 
 Ao final dos trabalhos, deve ser realizada a sequência de enxague final, 
com passagem de ar para secagem do capilar. 
 
Condições Eletroforéticas 
 As corridas serão realizadas em Sistema de Eletroforese Capilar 
Beckman P/ACETM MDQ, equipado com detector UV/Vis (Figura 13) com 
Software Karat 8.0. Será utilizado capilar de sílica fundida (Beckman-Coulter), 
com comprimento total de 60,2 cm e efetivo de 50,0 cm, diâmetro interno de 50 
µm. As amostras serão injetadas hidrodinamicamente a 5 psi durante 5 s. O 
comprimento de onda utilizado será de 214 nm, voltagem de 30 kV com tempo 
de corrida de 10 min. 
 
Figura 13. Sistema de Eletroforese Capilar Beckman P/ACETM MDQ. 
 
34 
 
 A aquisição dos dados se dá em tempo real, e os eletroferogramas (Figura 
12) também ficam salvos na pasta de sua escolha, indicada no momento da 
programação das corridas. 
 
Figura 14. Eletroferograma da fração acetato de etila de Trichilia catigua. (Sereia, 2017). 
 
Referências 
Baker, D.R., 1995. Capillary Electrophoresis. John Wiley & Sons, Inc., New York. 
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