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UNIVERSIDADE ESTADUAL DE MARINGÁ Departamento de Farmácia Laboratório de Biologia Farmacêutica PALAFITO Programa de Pós-Gradua ç ã o e mP C F C iênc ias Farmacêuticas Apostila Prática Métodos Cromatográficos Aplicados à Análise e Controle de Qualidade de Drogas Vegetais e Extratos Vegetais e Medicamentos Fitoterápicos Prof. Dr. João Carlos Palazzo de Mello Maringá, 2018 Colaboradores na elaboração do material didático Ana Luiza Sereia André Oliveira Fernandes da Silva Cláudio Roberto Novello Daniela Cristina de Medeiros Danielly Chierrito João Carlos Palazzo de Mello Luana Magri Tunin Mariana Nascimento de Paula Mariane Roberta Ritter Naiara Cássia Gancedo Raquel Garcia Isolani SUMÁRIO Cromatografia em Papel .................................................................................... 4 Cromatografia em Camada Delgada .................................................................. 6 Cromatografia Líquida em Coluna .................................................................... 10 Cromatografia em Coluna Flash ....................................................................... 13 Cromatografia Líquida à Vacuo ........................................................................ 17 Cromatografia em Contracorrente .................................................................... 20 Cromatografia Líquida de Alta Eficiência ......................................................... 24 Eletroforese Capilar .......................................................................................... 30 4 AULA 1 Cromatografia em Papel Introdução A Cromatografia em Papel (CP) é uma técnica utilizada para analisar pequenas quantidades de amostras, principalmente aplicada na separação e identificação de compostos polares, como açúcares, antibióticos hidrossolúveis, aminoácidos, pigmentos e íons metálicos. Nesta técnica, a separação dos componentes de uma mistura é baseada na migração diferencial nas fases estacionária (papel cromatográfico) e móvel (solvente puro ou mistura de solventes). O mecanismo de partição favorece a separação devido ao conteúdo de água intrínseco do papel, ou inibição seletiva do componente hidrofílico da fase líquida pelas fibras de papel. O cromatograma é desenvolvido pela passagem lenta da fase móvel sobre a fase estacionária. O desenvolvimento pode ser ascendente, no caso de solvente carreado para cima através de forças capilares, ou descendente, no caso em que o fluxo do solvente é auxiliado por força da gravidade. Procedimentos 1- Fase estacionária - Recortar papel filtro em quadrados de 5,0 cm x 5,0 cm; - Fazer uma linha suave a lápis a 0,5 cm do limite superior, e a 1,0 cm do limite inferior, onde deve ser marcado os pontos de aplicação das amostras, com 1,0 cm de distância das bordas laterais e entre eles. 2- Saturação da cuba cromatográfica - Colocar papel filtro nas paredes internas da cuba cromatográfica; - Adicionar a fase móvel (álcool) de modo que não ultrapasse 1 cm de altura; - Tampar a cuba e aguardar tempo necessário para que o eluente percorra todo papel filtro. 3- Aplicação da amostra - Utilizar 3 tintas diferentes de canetas esferográficas e aplicá-las na fase estacionária nos pontos determinados acima; 5 - Colocar na cuba cromatográfica; - Aguardar tempo necessário para que ocorra, por capilaridade, a separação dos componentes da mistura, ou seja, as cores das tintas das canetas esferográficas; - Retirar da cuba e secar. 4- Resultados - Anotar os valores do fator de retenção (Rf) de cada mancha observada. Figura 1. Representação do procedimento de Cromatografia em Papel. Referências Braibante, M. Cromatografia. Química Analítica Qualitativa Experimental. Disponível em: <http://w3.ufsm.br/laequi/wp- content/uploads/2012/07/Cromatografia.pdf>. Acesso em: 14 fev. 2018. Collins, C.H., Braga, G.L., Bonato, P.S., 1997. Introdução a métodos cromatográficos, 7ª Ed. Farmacopeia Brasileira, 2010. Agência Nacional de Vigilância Sanitária. Cromatografia em Papel, 5ª Ed., vol. 1. Oliveira, G.A., Silva, F.C, 2017. Cromatografia em papel: reflexão sobre uma atividade experimental para discussão do conceito de polaridade. Química Nova, 39(2):162-169. 6 AULA 2 Cromatografia em Camada Delgada Introdução A cromatografia é um processo físico-químico utilizado para a separação dos componentes de uma mistura, realizada por meio da distribuição dos componentes em duas fases que estão em contato íntimo: fase estacionária (FE) e fase móvel (FM). Durante a passagem da fase móvel sobre a fase estacionária, os componentes da mistura são distribuídos pelas duas fases, sendo as substâncias retidas de forma seletiva pela fase estacionária, resultando em migrações diferenciais. A Cromatografia em Camada Delgada (CCD) consiste na separação dos componentes de uma mistura, por meio da migração diferencial das substâncias sobre uma camada delgada de adsorvente retido sobre uma superfície plana, que constitui a fase estacionária. As vantagens desta técnica são: fácil compreensão e execução, separações rápidas, reprodutibilidade e baixo custo. Pode ser uma técnica analítica (qualitativa) ou preparativa (quantitativa). O processo de separação, normalmente é o de adsorção, podendo ocorrer também partição ou troca iônica, quando são utilizadas fase estacionárias tratadas. Entre os adsorventes disponíveis, ou seja, a fase estacionária, tem-se a sílica (SiO2), alumina (Al2O3), poliamida e celulose. A sílica é um dos adsorventes mais utilizados em cromatografia em camada delgada, sendo empregada na separação de compostos lipofílicos como aldeídos, cetonas, fenóis, ácidos graxos, aminoácidos, alcaloides, terpenoides e esteroides, usando o mecanismo de adsorção. Em alguns casos, pode ser necessário a ativação das placas. A sílica e alumina, podem ser ativadas em estufa a 105-110 ºC por 30-60 min. Outra etapa importante é a escolha da fase móvel, devendo ser considerado a natureza química das substâncias a serem separadas e a polaridade da fase móvel, que pode ser pura ou uma mistura de solventes. As amostras são aplicadas nas cromatoplacas na forma de soluções, com o auxílio de capilares, utilizando solventes bem voláteis, que são facilmente eliminados após a aplicação e com a distância de 1 cm entre cada amostra. As placas são então colocadas em uma cuba, contendo a fase móvel cobrindo todo 7 o fundo da cuba em uma altura inferior a aplicação das amostras (~ 1 cm de FM). Junto às paredes da cuba são colocados pedaços de papel filtro que permitem que a fase móvel suba por ele e sature o interior da cuba (Figura 2). Figura 2. Cromatografia em Camada Delgada (CCD). Após o desenvolvimento das cromatoplacas, as placas são secas e reveladas, para que seja possível visualizar as substâncias incolores presentes na amostra. Os métodos de revelação empregados podem ser físicos, não destrutivos (luz UV nos comprimentos de 254 nm e 366 nm, câmara de iodo, vapores de amônia) ou químicos, destrutivos (H2SO4, vanilina sulfúrica, cloreto férrico (FeCl3)), e, após alguns são aquecidos à 100-120 °C para que a reação cromogênica ocorra. Não se deve esquecer de marcar a distância percorrida pela fase móvel e pela amostra para realizar o cálculo do Rf (fator de retenção). O valor
