A maior rede de estudos do Brasil

Grátis
35 pág.
Apostila Metodos Cromatograficos 2018 (1)

Pré-visualização | Página 1 de 7

UNIVERSIDADE ESTADUAL DE MARINGÁ 
Departamento de Farmácia 
Laboratório de Biologia Farmacêutica 
PALAFITO 
Programa de Pós-Gradua
ç
ã
o
e
mP
C
F
C
iênc ias Farmacêuticas 
 
 
 
 
Apostila Prática 
Métodos Cromatográficos Aplicados à Análise e Controle de 
Qualidade de Drogas Vegetais e Extratos Vegetais e 
Medicamentos Fitoterápicos 
 
 
 
 
 
 
 
Prof. Dr. João Carlos Palazzo de Mello 
 
 
 
Maringá, 2018 
 
 
Colaboradores na elaboração do material didático 
 
Ana Luiza Sereia 
André Oliveira Fernandes da Silva 
Cláudio Roberto Novello 
Daniela Cristina de Medeiros 
Danielly Chierrito 
João Carlos Palazzo de Mello 
Luana Magri Tunin 
Mariana Nascimento de Paula 
Mariane Roberta Ritter 
Naiara Cássia Gancedo 
Raquel Garcia Isolani 
 
 
 
 
SUMÁRIO 
 
Cromatografia em Papel .................................................................................... 4 
Cromatografia em Camada Delgada .................................................................. 6 
Cromatografia Líquida em Coluna .................................................................... 10 
Cromatografia em Coluna Flash ....................................................................... 13 
Cromatografia Líquida à Vacuo ........................................................................ 17 
Cromatografia em Contracorrente .................................................................... 20 
Cromatografia Líquida de Alta Eficiência ......................................................... 24 
Eletroforese Capilar .......................................................................................... 30 
 
 
 
 
 
4 
 
AULA 1 
Cromatografia em Papel 
 
Introdução 
A Cromatografia em Papel (CP) é uma técnica utilizada para analisar 
pequenas quantidades de amostras, principalmente aplicada na separação e 
identificação de compostos polares, como açúcares, antibióticos hidrossolúveis, 
aminoácidos, pigmentos e íons metálicos. Nesta técnica, a separação dos 
componentes de uma mistura é baseada na migração diferencial nas fases 
estacionária (papel cromatográfico) e móvel (solvente puro ou mistura de 
solventes). O mecanismo de partição favorece a separação devido ao conteúdo 
de água intrínseco do papel, ou inibição seletiva do componente hidrofílico da 
fase líquida pelas fibras de papel. O cromatograma é desenvolvido pela 
passagem lenta da fase móvel sobre a fase estacionária. O desenvolvimento 
pode ser ascendente, no caso de solvente carreado para cima através de forças 
capilares, ou descendente, no caso em que o fluxo do solvente é auxiliado por 
força da gravidade. 
 
Procedimentos 
1- Fase estacionária 
- Recortar papel filtro em quadrados de 5,0 cm x 5,0 cm; 
- Fazer uma linha suave a lápis a 0,5 cm do limite superior, e a 1,0 cm do limite 
inferior, onde deve ser marcado os pontos de aplicação das amostras, com 1,0 
cm de distância das bordas laterais e entre eles. 
 
2- Saturação da cuba cromatográfica 
- Colocar papel filtro nas paredes internas da cuba cromatográfica; 
- Adicionar a fase móvel (álcool) de modo que não ultrapasse 1 cm de altura; 
- Tampar a cuba e aguardar tempo necessário para que o eluente percorra todo 
papel filtro. 
 
3- Aplicação da amostra 
- Utilizar 3 tintas diferentes de canetas esferográficas e aplicá-las na fase 
estacionária nos pontos determinados acima; 
5 
 
- Colocar na cuba cromatográfica; 
- Aguardar tempo necessário para que ocorra, por capilaridade, a separação dos 
componentes da mistura, ou seja, as cores das tintas das canetas esferográficas; 
- Retirar da cuba e secar. 
 
4- Resultados 
- Anotar os valores do fator de retenção (Rf) de cada mancha observada. 
 
 
Figura 1. Representação do procedimento de Cromatografia em Papel. 
 
 
Referências 
Braibante, M. Cromatografia. Química Analítica Qualitativa Experimental. 
Disponível em: <http://w3.ufsm.br/laequi/wp-
content/uploads/2012/07/Cromatografia.pdf>. Acesso em: 14 fev. 2018. 
Collins, C.H., Braga, G.L., Bonato, P.S., 1997. Introdução a métodos 
cromatográficos, 7ª Ed. 
Farmacopeia Brasileira, 2010. Agência Nacional de Vigilância Sanitária. 
Cromatografia em Papel, 5ª Ed., vol. 1. 
Oliveira, G.A., Silva, F.C, 2017. Cromatografia em papel: reflexão sobre uma 
atividade experimental para discussão do conceito de polaridade. Química 
Nova, 39(2):162-169. 
 
6 
 
AULA 2 
Cromatografia em Camada Delgada 
 
Introdução 
A cromatografia é um processo físico-químico utilizado para a separação 
dos componentes de uma mistura, realizada por meio da distribuição dos 
componentes em duas fases que estão em contato íntimo: fase estacionária (FE) 
e fase móvel (FM). Durante a passagem da fase móvel sobre a fase estacionária, 
os componentes da mistura são distribuídos pelas duas fases, sendo as 
substâncias retidas de forma seletiva pela fase estacionária, resultando em 
migrações diferenciais. 
A Cromatografia em Camada Delgada (CCD) consiste na separação dos 
componentes de uma mistura, por meio da migração diferencial das substâncias 
sobre uma camada delgada de adsorvente retido sobre uma superfície plana, 
que constitui a fase estacionária. As vantagens desta técnica são: fácil 
compreensão e execução, separações rápidas, reprodutibilidade e baixo custo. 
Pode ser uma técnica analítica (qualitativa) ou preparativa (quantitativa). O 
processo de separação, normalmente é o de adsorção, podendo ocorrer também 
partição ou troca iônica, quando são utilizadas fase estacionárias tratadas. Entre 
os adsorventes disponíveis, ou seja, a fase estacionária, tem-se a sílica (SiO2), 
alumina (Al2O3), poliamida e celulose. A sílica é um dos adsorventes mais 
utilizados em cromatografia em camada delgada, sendo empregada na 
separação de compostos lipofílicos como aldeídos, cetonas, fenóis, ácidos 
graxos, aminoácidos, alcaloides, terpenoides e esteroides, usando o mecanismo 
de adsorção. 
Em alguns casos, pode ser necessário a ativação das placas. A sílica e 
alumina, podem ser ativadas em estufa a 105-110 ºC por 30-60 min. Outra etapa 
importante é a escolha da fase móvel, devendo ser considerado a natureza 
química das substâncias a serem separadas e a polaridade da fase móvel, que 
pode ser pura ou uma mistura de solventes. 
As amostras são aplicadas nas cromatoplacas na forma de soluções, 
com o auxílio de capilares, utilizando solventes bem voláteis, que são facilmente 
eliminados após a aplicação e com a distância de 1 cm entre cada amostra. As 
placas são então colocadas em uma cuba, contendo a fase móvel cobrindo todo 
7 
 
o fundo da cuba em uma altura inferior a aplicação das amostras (~ 1 cm de FM). 
Junto às paredes da cuba são colocados pedaços de papel filtro que permitem 
que a fase móvel suba por ele e sature o interior da cuba (Figura 2). 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Figura 2. Cromatografia em Camada Delgada (CCD). 
 
 Após o desenvolvimento das cromatoplacas, as placas são secas e 
reveladas, para que seja possível visualizar as substâncias incolores presentes 
na amostra. Os métodos de revelação empregados podem ser físicos, não 
destrutivos (luz UV nos comprimentos de 254 nm e 366 nm, câmara de iodo, 
vapores de amônia) ou químicos, destrutivos (H2SO4, vanilina sulfúrica, cloreto 
férrico (FeCl3)), e, após alguns são aquecidos à 100-120 °C para que a reação 
cromogênica ocorra. Não se deve esquecer de marcar a distância percorrida pela 
fase móvel e pela amostra para realizar o cálculo do Rf (fator de retenção). O 
valor