Os princípios da clonagem molecular_ DNA recombinante

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30/09/2019 Os princípios da clonagem molecular: DNA recombinante
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A  clonagem molecular  é uma técnica da engenharia genética
conhecida também por  DNA recombinante, clonagem gênica ou
manipulação gênica. Essa tecnologia permite pegar um “pedaço” do
DNA e combiná-lo com outro, produzindo muitas cópias de diferentes
combinações genéticas.
Quando usamos a palavra clonagem é muito comum realizar a
associação com o clone de um organismo inteiro, como o caso da
ovelha Dolly. Nos anos 90, os pesquisadores do  Roslin Institute of
Scotland anunciaram que haviam conseguido clonar com sucesso uma
ovelha. O animal foi o primeiro mamífero clonado a partir de uma célula
adulta e nasceu em 5 de julho de 1996.
Entretanto, clonar significa fazer uma cópia geneticamente exata, seja
de um organismo completo ou até mesmo de um pequeno fragmento
de DNA. É aqui que entra a clonagem molecular usada amplamente na
ciência, medicina, agricultura e indústria.
Desde os anos 60 uma série de descobertas revolucionaram o estudo
da genética e permitiram um grande desenvolvimento da engenharia
genética. Desde então a utilização do DNA recombinante ganhou
espaço e tem crescido absurdamente com inúmeras aplicações e
aprimoramento das técnicas.
A clonagem molecular pode fazer com que genes estranhos sejam
expressos em bactérias e leveduras ou mesmo em outras células
superiores. As indústrias química, farmacêutica e agrária investem
milhões em seu desenvolvimento. Esta tecnologia permite estudar os
genes e os seus produtos, obter organismos transgênicos e realizar
terapia gênica.
Leia mais
Etapas da clonagem molecular
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A clonagem molecular ou DNA recombinante é um método que permite
fazer várias cópias idênticas (clones) de um pedaço específico de DNA.
Para que isso ocorra é necessário realizar alguns passos que
acompanharemos a seguir:
 
1. ISOLAR O GENE DE INTERESSE
Primeiramente é necessário isolar o fragmento de DNA de interesse.
Para que se tenha o DNA recombinante, de duas origens diferentes, é
necessário utilizar as enzimas de restrição. Essas enzimas reconhecem a
sequência alvo específica e cortam seletivamente o fragmento que será
utilizado.
 
2. UNIR O GENE AO VETOR: DNA
RECOMBINANTE
O fragmento de DNA é inserido em um vetor, que é uma molécula de
DNA na qual um gene é inserido para construir a molécula de DNA
recombinante. Geralmente os plasmídeos (moléculas de DNA circulares
existentes naturalmente nas bactérias) são usados como vetores para
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clonar fragmentos de DNA. Eles são projetados para permitir a inserção
de um DNA exógeno, têm origens de replicação e são capazes de se
replicar independentemente do cromossomo bacteriano.
Assim, o fragmento do gene alvo se une ao vetor, através da DNA ligase,
formando o plasmídeo recombinante contendo o gene de interesse. A
DNA ligase é a responsável por selar as lacunas do eixo do DNA,
funcionando como uma “cola”.
 
3.TRANSFORMAÇÃO
A molécula de DNA recombinante produzida é introduzida em um
organismo hospedeiro, podendo então ser replicadas. Esse processo é
conhecido como transformação, no qual as células bacterianas captam
o DNA do ambiente externo.
As  células  hospedeiras  copiam o DNA do vetor juntamente com o
próprio DNA, criando múltiplas cópias do DNA inserido. Alguns
exemplos de células hospedeiras são as bactérias  Escherichia
coli e Bacillus subtilis e a levedura Saccharomyces cerevisiae.
Na prática, esse procedimento gera uma mistura de construções
recombinantes. Algumas células contêm o gene clonado de interesse,
ao passo que outras podem conter outros genes do DNA original.
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4. SELEÇÃO DOS CLONES
RECOMBINANTES
Para selecionar apenas as células de interesse o vetor possui
um  marcador  selecionável  que permite a identificação de moléculas
recombinantes.  Um  marcador de  antibiótico  é frequentemente usado,
assim uma célula hospedeira sem o vetor morre quando exposta a um
determinado antibiótico, enquanto o hospedeiro com o vetor sobrevive
e se multiplica, porque é resistente.
6. MULTIPLICAÇÃO OU EXPRESSÃO
DO GENE
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Após as células com o plasmídeo recombinante serem identificadas,
elas podem crescer em grande escala, replicando o fragmento de DNA.
Nesse momento, damos às bactérias um sinal químico que as instrui a
produzir a proteína alvo.
As bactérias servem como “mini fábricas”, produzindo grandes
quantidades de proteína. Por exemplo, se nosso plasmídeo continha o
gene da insulina humana, as bactérias começariam a transcrição do
gene e a tradução do RNAm para produzir muitas moléculas da proteína
insulina.
A proteína de interesse é então purificada, separada dos demais
conteúdos das células, por exemplo, outras proteínas e
macromoléculas. Isso garante que não haja nenhuma impureza,
restando apenas o produto final, como no caso da insulina.
Aplicação da clonagem de DNA
A clonagem molecular possui inúmeras aplicações e vem ganhando
cada vez mais importância nos últimos anos. Entre as possibilidades
estão o desenvolvimento de proteínas recombinantes mais seguras
para o tratamento de doenças, o aprimoramento da terapia genética, a
produção vacinas, além do uso na agricultura.
Veja abaixo algumas das aplicações da técnica de DNA recombinante: