Aula 8 - Genotoxicidade e mutagenicidade

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Biotecnologia
Profª Natália Faria Romão
Bióloga / Mestre em genética e toxicologia
Esp. Microbiologia de alimentos e Avançada
Doutoranda: Biotecnologia - BIONORTE
A mutação é sempre encarada como algo
negativo.
Os pesquisadores fazem de tudo para evita-
la, como se fosse possível eliminá-la
totalmente.
A mutação faz parte da vida:
Sem ela a vida seria inimaginável.
Sem mutação: não há variabilidade genética
Sem variedade não há seleção
Sem seleção não há evolução
Sem evolução não há adaptação.
Da Silva et al, 2003.
Mutagênese
Mas...
Mutação demais pode prejudicar o indivíduo
ou até mesmo extinguir a espécie.
A mutação é
 aleatória
 cega
de ordem molecular e química
um processo desagregador
Da Silva et al, 2003.
Mutagênese
Mutação:
Alterações no código de bases nitrogenadas nos
genes do DNA.
Podem originar novos genes que podem originar
características favoráveis ou desfavoráveis ao
indivíduo.
Mutagênese
– Inserções:
– Deleção:
Mutagênese
Mutação:
5’ GGG AGT GTT AGA TGG TCC 3’
3’ CCC TCA CAA TCT ACC AGG 5’
Gene selvagem:
5’ GGG AGT GTTT AGA TGG TCC 3’
3’ CCC TCA CAAA TCT ACC AGG 5’
Gene selvagem:
5’ GGG AGT GTT AGA TGG TCC 3’
3’ CCC TCA CAA TCT ACC AGG 5’
5’ GGG AGT G T AGA TGG TCC 3’
3’ CCC TCA C A TCT ACC AGG 5’
T
Prejuízo: Altera o quadro de leitura.
NO DECORRER DA VIDA
Aparecimento de mutações – alterações no DNA
Erros naturais que ocorrem durante a replicação
do DNA
Ocorre em todos os seres vivos
Mutagênese
O DNA é bastante protegido, sendo a
única molécula biológica que apresenta
um mecanismo próprio para prevenção e
reparo de falhas em seu metabolismo.
Ainda assim está sujeito a mutações.
As mutações despertam grandes
interesses por estarem diretamente
relacionadas ao desenvolvimento de
diversas doenças degenerativas:
Câncer, envelhecimento e doenças senis.
Mutagênese
Tipo de mutações:
Mutagênese
Espontânea
Ocorre naturalmente 
durante a replicação 
do DNA
Induzida
Fatores externos: como 
possíveis agentes 
mutagênicos – substancias; 
Radiações e Radicais livres 
– proveniente de 
alimentos ou gerados 
pelo metabolismo celular.
 Frequência baixa: uma célula em 105 a 108
Mecanismos:
erros na replicação do DNA
lesões espontâneas: desaminação, depurinação e danos 
oxidativos (radicais superóxido-O
2; 
peróxido de hidrogênio-
H
2
O
2; 
radicais hidroxila-OH)
C→U transição GC →AT
Perda de base púrica A e G
Mutagênese
•PERDA DE BASES: 
Depurinação: 5.000 bases púricas (A e G)/dia/célula
Desaminação: 100 bases C >U/dia/célula
•REPLICAÇÃO: DNA pol: 1 base errada na cadeia filha/10 milhões 
pb
•REVISÃO DE PROVA: corrige 99,9% dos erros de replicação
•TAXA DE MUTAÇÃO (erros de replicação): muito baixa 10-10 por 
pb/divisão
•GENOMA DIPLÓIDE HUMANO: ~ 6x109 pb do DNA → 
menos 1 mutação de pb/divisão
LESÕES ESPONTÂNEAS: ERROS DE REPLICAÇÃO DO DNA
Mutagênese
PREVENÇÃO DE ERROS
• Alguns sistemas enzimáticos neutralizam
compostos potencialmente danosos, antes que
reajam com o DNA
• Ex.: desintoxicação de radicais superóxido
produzidos durante os danos oxidativos.
Mutagênese
a) Enzima superóxido dismutase  catalisa a conversão dos
radicais superóxido  peróxido de hidrogênio
b) Enzima catalase  converte peróxido de hidrogênio em
água
A mutagênese (Genética Toxicológica) avalia
os efeitos genotóxicos em potencial, uma vez
que são considerados pré-requisitos
importantes para o desenvolvimento de
efeitos adversos à saúde, como o câncer.
Mutagênese
A toxicidade genética não é uma medida da
carcinogênese, mas é frequentemente usada
como um indicador para o câncer, uma vez
que os testes de mutagenicidade medem um
evento inicial ou intermediário da
tumorigênese.
Mutagênese
Importância de estudos de mutagênese
• Mutação: se não mata a célula ela pode se
proliferar no corpo em crescimento (mutação
somática) ou ser transmitida para as
próximas gerações (mutação germinal).
• Estima-se que as mutações somáticas e
germinais são responsáveis por:
– 50% das mortes fetais,
– 30% dos problemas de aprendizagem,
– 20% dos defeitos congênitos, e
– 2% da infertilidade masculina
Mutagênese
• “Se bem não fizer, mal não faz?”
• Virtualmente, todas as substâncias químicas
podem causar efeitos adversos à saúde,
dependendo da quantidade absorvida e
metabolismo.
• Portaria do Ministério da Saúde/2000: todos
os fitoterápicos devem ser estudados quanto
ao seu potencial mutagênico.
• Resultados positivos:
Aloe vera (babosa)
Schinus terebintifolius (aroeira)
Ocotea dukei (louro-de-cheiro)
Mutagenicidade: Produtos Naturais
Aloe vera (babosa)
Mutagenicidade: Produtos Naturais
Na dose usual, a solução de Aloe vera não foi mutagênica 
para o sistema de teste. Já na dose dez vezes mais 
concentrada provocou um efeito citotóxico e mutagênico. 
Schinus terebintifolius (aroeira)
Mutagenicidade: Produtos Naturais
Teste de mutagenicidade direta sugeriram que os 
flavonoides aumentam a frequência de mutação em 
cepas deficientes nas enzimas MutM e MutY glicosilases, 
principalmente na duplo mutante, sugerindo que as 
lesões predominantemente oxidativas, são substratos 
destas enzimas no DNA.
Ocotea dukei (louro-de-cheiro)
Mutagenicidade: Produtos Naturais
Induz hipotensão, devido a uma diminuição da
resistência periférica vascular, e bradicardia, devido a
uma ativação indireta dos receptores muscarínicos
cardíacos via estimulação vagal.
• Compostos sintetizados pelos vegetais:
-alcalóides: morfina, papaverina e narcotina: extraídas 
do ópio da papoula
-cafeína e teofilina: chás e café
-folhas e raízes de confrey: hepatocarcinoma
-aji-no-moto: glutamato de monossódico (cana-de-
açúcar)
-própolis: contém quercetina (flavonoide)
Agentes Mutagênicos: Alimentos Naturais
• Frituras de alimentos e torrefação: formam HAP
• Rancificação de óleos (aquecimento sucessivo): formam 
HAP
• Armazenamento de grãos: contaminação por fungos
-aflatoxina: Aspergillus flavus
(amendoim)
-furocumarinas: contidas em cogumelos
• Conservantes: nitratos e nitritos 
Quebra a ligação entre a 
base e o açúcar  sítio 
apurínico
Agentes Mutagênicos: Alimentos Processados
Teste de Mutação Gênica em Células
de Mamífero (Mouse Lymphoma Assay
– MLA)
Testes Genéticos em Mutagênese
Teste de 
Micronúcleos
Mutagênese
Teste de Micronúcleos
Baseia-se na idéia de que quebras nas fitas de DNA ou
fibras rompidas do fuso acromático permitem a um
cromossomo inteiro ou cromossomos formar núcleos
de tamanho menor após uma rodada de divisão
celular.
- Adiciona bastante velocidade e robustez estatística à
análise;
- Validado internacionalmente;
- Aberrações numéricas e cromossômicas;
- Fácil execução e análise
Mutagênese
Teste de Micronúcleos
In vivo
Mutagênese
Teste de Micronúcleos
Mutagênese
Micronuclei
Cellular Binucleada
Citocinese bloqueada pelo uso da Citocalasina B
Cyt-B
Mutagênese
Teste de Micronúcleos
Teste de Micronúcleos
Mutagênese
 Quebra cromossômica (clastogênese)
 Perda cromossômica (aneugênese)
• PCE – Eritrócito Policromático. Célula mais jovem, com maior
quantidade de RNA no citoplasma e apresenta coloração
roxa.
• NCE – Eritrócito Normocromático. Célula mais antiga, que já
perdeu o RNA do citoplasma e apresenta coloração laranja.
Mutagenicidade
Teste de Micronúcleos
• Análise em microscópio de 500 células avaliando a
proporção de PCE e NCE – Pode indicar toxicidade,
quando o número de célulasjovens decai em
relação ao número de células antigas.
• Análise de 1000 PCE por lâmina avaliando a
presença de micronúcleos – Indica a indução de
dano ao DNA.
Mutagenicidade
Teste de Micronúcleos
Quando um produto apresenta um resultado positivo
• Um resultado positivo in vitro não é o final do processo
de análise.
– > 25% das drogas no mercado têm ao menos um
resutado positivo na avaliações de Genética
Toxicológica.
• Nem todos os resultados positivos são relevantes para
humanos, que frequentemente estão expostos a
compostos em baixas concentrações.
• Resultados positivos in vivo são mais problemáticos do
que resultados positivos in vitro.
• A escolha do teste e a qualidade com que é feito o
desenho experimental são muito importantes.
Teste de Micronúcleos
Resultado positivo in vivo
• Resultados de testes de genotoxicidade in vivo,
principalmente teste de citogenética em medula óssea,
desempenha um papel vital na avaliação de risco.
• Aumento em células de medula óssea micronucleadas
tem alto poder regulatório, indicando que o composto
teste é um carcinógeno genotóxico potencial.
Teste de Micronúcleos
Resultado positivo in vivo
• Existem novas evidências de que distúrbio fisiológicos
(alterações na temperatura corporal, aumento na
eritropoese, inibição da síntese protéica) induzidos por
compostos químicos em roedores usados nestes testes
podem ocasionar aumento em células de medula óssea
micronucleadas que não estão relacionadas ao potencial
genotóxico do composto em teste.
Teste de Micronúcleos
Foto: Natália Romão
Foto: Natália Romão
Foto: Natália Romão
Anáfase anormal
Allium cepa
Anáfase normal
Micronúcleos: Uso de Allium cepa
Teste de Micronúcleos
Avalia o índice mitótico, o índice de
proliferação celular, metáfase e/ou anáfases
anormais, MNs e outras alterações celulares.
Alterações Genéticas em Células Meristemáticas de Allium Cepa
Micronúcleos: Uso de Allium cepa
Teste de Micronúcleos
Testes Citogenéticos
a) Monitoramento humano do risco de
mutagênese ocupacional e/ou ambiental.
b) Detectam alterações cromossômicas estruturais
e/ou numéricas, microscopicamente visíveis,
mas de viabilidade desconhecida, que
envolvem no mínimo 10Mb.
c) Apresentam baixo custo, praticidade e são
excelentes marcadores biológicos de
exposição à agentes clastogênicos.
Teste de Micronúcleos
Testes Material Tempo Observações
MN Sangue 
Medula Óssea
Células da Mucosa 
Oral
Células vegetais
CHO, etc
48 - 96 
horas
Avalia a capacidade de
indução de danos
cromossômicos
estruturais e/ou
numéricos
MT
Teste de Micronúcleos
Fragilidade Cromossômica
Quebra Cromossômica
Testes Genéticos em Mutagênese
Teste de Micronúcleos
CN
G
E-
M
N
G
E-
JP
0
10
20
30
40
50
***
***
N
u
m
b
e
r 
o
f 
m
ic
ro
n
u
cl
e
i b
y 
20
00
 c
e
l.
Figura 3. Índice de Micronúcleos encontrados por grupos pesquisados. ANOVA, seguida
por teste Tukey, onde *** p<0,05.
 No organismo humano os
herbicidas compostos por triazina
são absorvidas com maior
facilidade pelo trato gastrintestinal
e após 72 horas:
 65% é excretado pela urina
 15% é acumulado
 Aumenta o fator de risco para a doença
de Parkinson; Processos carcinogênicos e
teratogênicos, Desordens neurológicas.
Caso FOSFOETALONAMINA...
Substância criada pelo
pesquisador doutor Gilberto
Orivaldo Chierice do Instituto
de Química da Universidade
de São Paulo.
Resultado com o teste do 
Micronúcleo
A análise pré-clínica através do teste do micronúcleo para
atestar a segurança no uso da fosfoetanolamina sintética não
apresentou efeitos citotóxicos e genotóxicos em EPC de medula
óssea de camundongos.
Assim podemos concluir que o teste do
micronúcleo tem sido uma ferramenta
Importante para demonstrar o principal
biomarcdor que pode desencadear doenças
Degenerativas.
GENOTOXICIDADE
• O estudo dos efeitos adversos de agentes
físicos e químicos no material genético de
células (DNA ou cromossomos) e a
subsequente expressão de tais mudanças.
• Os testes de genotoxicidade geralmente são
feitos juntamente com o mutagenicidade para
determinar os danos ao material genético.
Genotoxicidade
• Diferente das mutações, as lesões detectadas
pelo ensaio cometa são passíveis de correção.
• Uma vez que danos no DNA são
frequentemente célula e tecido específicos,
esta metodologia, permite a detecção de
danos e seu reparo em uma única célula, e
consequentemente, em determinada sub-
população celular, é de extrema relevância
para a avaliação de compostos genotóxicos.
Genotoxicidade
• Testes de genotoxicidade
– Diversas metodologias
– Importante pesquisa para avaliação da toxicidade 
celular
– Identificar potencial carcinogênico e a 
mutagenicidade
– Proteger o material genético humano
Genotoxicidade
• Desenvolvido por Singh e cols (1988) para detectar
o dano primário ao DNA.
• É bastante sensível, detectando quebras simples e
duplas e sítios alcalilábeis nas moléculas de DNA;
• Microeletroforese de células suspensas em uma
fina camada de agarose disposta sobre uma
lâmina e lisadas por detergentes e alta
concentração de sais.
Genotoxicidade
Ensaio Cometa
• Teste indicativo
• Simples, sensível e rápido
• Danos em células individuais
• Pequeno número de células
• Pode ser realizado em qualquer célula nucleada
• Dano e reparo no DNA
• Muito usado em estudos de genética toxicológica
Genotoxicidade
Ensaio Cometa
• Geralmente feito com células de modelos animais
teste (ratos ou camundongos).
• Estes animais são tratados com a substancia teste e
depois é recolhida o material de análise:
– Sangue, células de tecidos (coração, fígado, rins, cérebro)
Genotoxicidade
Ensaio Cometa
Procedimento
1- Células embebidas em gel de agarose
(lâminas)
2- Lisar sob condições alcalinas (ou neutras)
3- Eletroforese
4- Segmentos DNA livres migram fora do
núcleo → Fora do núcleo
5- Observação microscópica
6- Classificação das células em classes
(0-4)
Genotoxicidade
Ensaio Cometa
• Após a eletroforese as células (nucleóides)
adquirem uma morfologia semelhante a de um
cometa;
• Cabeça representa o arcabouço de DNA intacto e a
cauda, fragmentos provenientes de lesões no DNA.
Genotoxicidade
Ensaio Cometa
Teste cometa com vários 
graus de dano ao DNA:
A - célula sem dano
B - célula com leves danos
C - célula danificada ou 
clássico cometa
D - célula altamente 
danificada
Genotoxicidade
Ensaio Cometa
Pode-se avaliar também a 
antigenotoxicidade de uma 
substancia através do teste ex 
vivo.
Genotoxicidade
Ensaio Cometa
A antigenotoxicidade serve para determinar o 
efeito protetor de uma substancia frente ao agente 
danoso (peróxido de hidrogênio)
• Para isso: as lâminas do controle negativo e
dos grupos expostos a substância teste são
submetidas a um tratamento com peróxido
de hidrogênio (H
2
O
2
) durante 5 minutos.
• Depois procede-se normalmente com a
eletroforese.
Genotoxicidade
Ensaio Cometa
Algumas lâminas de teste Cometa 
desenvolvido NO CAMPUS JI-PARANÁ
Foto Natália Romão
Foto Natália Romão
Foto Natália Romão