Aula Citômetria de fluxo

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Prof. Dr. Paulo Cirino de Carvalho Filho
O que é Citometria de Fluxo?
Cito Metria Fluxo
Célula Medida Movimento
• Separar
• Contar 
• Examinar
• Classificar
Partículas 
microscópicas 
suspensas em meio 
líquido em fluxo
Exemplos:
CromossomosCélulas Bactérias Microesferas (Beads)
Quais são as vantagens?
• Permite analisar várias características de uma célula de forma rápida e 
por vários parâmetros (multiparamétrica)
• FSC – (Forward Scatter) – Tamanho relativo da célula
• SSC – (Side Scatter) – Granulosidade ou complexidade celular
• FL – Intensidade de Fluorescência (vários canais: FL1, FL2, FL3, FL4...)
Quais parâmetros podem ser avaliados?
Parâmetros: Detecção da dispersão Lateral do 
Laser
SSC (Complexidade Interna) Detecção
 d
a d
isp
ersão
 Fro
n
tal d
o
 
Lase
r
FSC
 (Tam
an
h
o
)
Incidência 
da fonte 
Luminosa
Parâmetros: FSC e SCC
Parâmetro: Intensidade de Fluorescência
Fluorocromos: Corantes que aceitam a energia liminosa (Ex: Laser) a um dado comprimento de onda 
e reemite a luz a um comprimento de onda mais longo.
http://www.keokimed.com/
Princípios da absorbância e emissão da luz
Princípios da absorbância e emissão da luz
• Quando a luz é absorvida por um fluorocromo, seus
elétrons tornam-se excitados ao passar de um estado
de repouso (1) a um nível máximo de energia
chamado de “Estado excitado singleto” (2)
• Fluorocromo sofre mudança conformacional interna
liberando uma parte da energia absorvida como calor
• Os elétrons, posteriormente, caem para um nível
energético mais baixo, mais estável, chamado de
“Estado relaxado singleto” (3).
• Os elétrons voltam para seu estado fundamental e
liberando a energia restante (Emissão) e fluorescência
(4).
Princípios da Absorbancia e emissão da luz
Fluorocromo excitado emite luz num comprimento de onda maior que o absorvido
Espectro de exitação/emissão do FITC (Isotiocianato de Fluoresceína)
Princípios da absorbância e emissão da luz
https://www.bdbiosciences.com/sg/research/multicolor/spectrum_viewer/index.jsp
Fluorocromos para Citometria de Fluxo
Compensação de Fluorescência
Total da 
fluorescência 
total em FL-1
5% da 
fluorescência 
total do 
Fluorocromo B
Total da 
fluorescência 
total em FL-2
17% da 
fluorescência 
total do 
Fluorocromo A
Para o Fluorocromo A Para o Fluorocromo B
Instrumentos
Análise (Cell Analyzers)
BD LSRFortessa™
4 lasers e 18 cores
BD FACSCALIBUR
4 cores
SEPARAÇÃO (Cell Sorter)
FACS (Fluorescence Activated Cell Sorter)
BD FACSSEQ
Isolamento avançado e 
caracterização de células 
individuais para estudos 
genômicos
BD FACSAria™ III
18 cores
Instrumentos
A citometria de fluxo pode ser usada para separar as células de acordo com o subtipo 
ou expressão do epítopo.
Citômetro de Fluxo
CONJUNTO DE SISTEMAS
Fluídos Óptico Eletrônico
Introduz e alinha as partículas 
para análise
Gera e coleta os sinais de luz Converte os sinais ópticos em sinais 
eletrônicos para a análise em computador
Subsistema Fluído
Subsistema Óptico: Componentes de Exitação
Subsistema Óptico: Componentes Coletores
Subsistema Eletrônico
Formação do pulso elétrico
• Altura: Máxima corrente de
saída
• Área: O integral do pulso
• Largura: O intervalo de tempo
em que o pulso ocorre
• Intensidade de sinal: Pode ser
medida pela altura ou área
Armazenamento de dados e análise
Armazenamento de dados e análise
1 2
3 4
1.Histograma
2.Dot plot
3.Density plot
4.Contour plot
Nesta animação, vamos apresentá-lopara a técnica experimental de citometria de fluxo.Citometria de fluxo é usada para contar e analisar o tamanho, formae propriedades de células individuaisdentro de uma população heterogênea de células.Os dados da citometria de fluxo são extremamente quantitativose podem ser analisados em profundidade por programas específicos paracitometria de fluxoDepois que uma suspensão de células individuaisfoi preparada para análise por citometria de fluxo de células,tecidos ou organismos, a amostra preparadaé colocado no citômetro de fluxo.Então, como um citómetro de fluxo pode analisar o tamanho, a forma,e as propriedades de células individuais?Um citômetro de fluxo contêm vários componentes-chave:incluindo a amostra, que fluídicamover a amostra num citómetro de fluxo,lasers,sistemas ópticos que recolhem a luz,detectores para detectar a luz, e um sistema de computador para enviaros dados em um formulário que podem ser analisados ​​pelo pesquisador.Uma vez que uma amostra foi colocada no citómetro de fluxo,a máquina irá aspirar a amostra,misturar a amostra em solução salinano citômetro de fluxo, e levar a suspensão de célulasatravés de um canal estreito, levandoas células de modo a formar uma única fila antes das células passarematravés do laser no "ponto de interrogação".Cada célula na amostra, em seguida, move-se através do feixe de laser,permitindo que cada célula no interior da amostraseja analisada individualmente.À medida que cada célula passa através do feixe de laser,o feixe de laser vai dispersar em várias direcções.O citômetro detecta a luz dispersade um modo para a frente, chamado "forward Scatter",e a luz dispersa de um modo lateral, chamada"Side Scatter".A quantidade de luz dispersa para a frente para cada célulaé detectada por um detector do outro lado da célulado laser.dispersão para a frente (FSC) é proporcional ao tamanho da célula.O detector converte a luz dispersaem um impulso de tensão, a qual é directamenteproporcional à quantidade de luz dispersa na frente.O computador converte esses dados em um histogramacom a quantidade de luz dispersa em frente, no eixo dos Xe o número de células no eixo y.A quantidade de lado luz dispersaé detectado por um detector localizado perpendicularno caminho do feixe de laser.dispersão lateral (SCT) é proporcional à formae complexidade interna de uma célula.Assim como com luz dispersa,o citômetro de fluxo converte a luz dispersa lateralmenteem impulso de tensão, a qualé diretamente proporcional à quantidade de luz dispersa lateralmete.Ao analisar os dados de disperção frontal e lateral juntos,o pesquisador pode compreender o tamanho de uma célula, sua forma,e complexidade.Além disso, a análise dos dados de dispersão frontal e lateralpodem permitir que o pesquisador dividapopulações heterogêneas de célulasque possuem tamanho variável, forma e complexidadeemm populações homogêneas.Esta capacidade de analisar várias populaçõesdentro de uma amostra mostraoa imenso poderda técnica de citometria de fluxo.Para além da análise de tamanho da célula, formae complexidade, um citômetro de fluxo também pode detectar a luz emitidaa partir de moléculas fluorescentes excitadas,tais como anticorpos marcados fluorescentementeou fluorocromos.Para o resto desta animação, nósvamos nos concentrar na detecção do sinal de fluorescênciapelo citômetro de fluxo.Para mais informações sobre fluorescência,consulte a animação de fluorescência.As moléculas fluorescentes, ou fluoróforos,são excitadas no comprimento de onda correto da luz laserquando a célula passa através do feixe de laser.Depois da excitação, a luz emitida pelo fluoróforoé dirigida ao longo de um caminho por filtros de emissãopermitindo a detecção de vários fluoróforos diferentesemitindo luz na célula.Um citômetro de fluxo pode detectar a presença de um fluoróforoe também quantificar a quantidade relativade um fluoróforo dentro de uma célula.Um citômetro de fluxo também pode ser utilizadopara detectar a luz emitida a partir de vários fluoróforosna mesma amostra.Embora seja comum para citômetros de fluxodetectar 2, 3, ou 4 cores, ao mesmo tempo,alguns citômetros de fluxo podem até mesmo detectar18 cores diferentes ao mesmo tempo.Os dados podem então serem apresentados ao pesquisador na formade um histograma ou gráficode pontos (dot plot).Tais dados reforçam os poderes da análise por citometria de fluxopermitindo ao pesquisador analisar populações individuaisde células dentro de uma mistura heterogênea na amostra.
Análise
Ac Monoclonal 
Conjugado com PE
Ac Monoclonal 
Conjugado com FITCCélulas
1º 
Marcação 
das células
Análise
FITC
Aplicações
Imunofenotipagem
Diferenciação de populações celulares
• “Cluster of Differentiation” (CD)
Moléculas utilizadas como marcadores.
Aplicações
Imunofenotipagem
Exemplo:
Linfócito T reg:
CD4+ CD25+ FoxP3+
FITC PE PercP
Linfócito Th17:
CD4+ RoRyt+ IL-17+
FITC PE PercP
Aplicações
Viabilidade Celular
Apoptose Necrose
Aplicações
Viabilidade Celular
Aplicações
Análise do ciclo celular
Intensidade 
de 
Fluorescência 
DNA
• Tampão hipotônico HFS (Hypotonic Fluorescent Solution)
• Iodeto de propídio + solução permeabilizante de membrana
Aplicações
Proliferação celular CFSE Carboxyfluorescein
succinimidyl
diacetate ester
• Corante fluorescente lipofílico 
citoplasmático
Aplicações
CBA (Cytometric Bead Array)
• Detecção da produção de citocinas
CBA 25μL = 6 Citocinas
ELISA 25μL = 1 Citocina
Microesferas
+
Fluorocromos
Diferentes 
intensidades de 
excitação
Aplicações
Clínicas 
• Contagens de linfócitos T auxiliares - Infecção pelo HIV
• Para Avaliar o DNA de células tumorais e a atividade proliferativa – Câncer de mama e
outras doenças malignas
• Transplante de órgãos
• Isolar cromossomos humanos para a construção de bibliotecas genéticas
• Separar cromossomos X e Y - Criação de animais e fertilização in vitro
• Microbiologia