Fluorescência-Análise Química

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ANÁLISE QUÍMICA 
FLUORESCÊNCIA
Rose Mary Zumstein Georgetto Naal
Classificação mais geral das formas
de emissão de luz
Emissão de luz
Com aquecimento?
Sim
Incandescência
Não
Luminescência
Sim
Triboluminescência
Quimiluminescência
Sim
Bioluminescência
Não
Não
Com excitação de luz?
Fosforescência
Não
Envolve forças mecânicas?
Não
Inanimado?
Sim 
Imediata ?
Fluorescência
Sim
Fluorescência
CAMINHOS DA LUZ!
Exemplos de emissão de luz
Lâmpadas incandescentes:
Filamento de tungstênio
que ilumina com a
passagem de corrente
elétrica.
Incandescência
Lâmpadas fluorescentes: Vapor de
mercúrio que atingido por
corrente elétrica emite raios UV
que são invisíveis aos nossos
olhos. Mas ao serem absorvidos
pelo fósforo na parede do vidro,
geram luminosidade.
Luminescência
Fogos de artifício: Contém a pólvora (carvão com perclorato
de potássio + mistura de enxofre + KNO3). A pólvora explode
com o aquecimento fornecendo a energia para a emissão de
luz de diferentes cores.
Sódio: luz amarela
Estrôncio e lítio: luz vermelha
Bário: luz verde
Cobre: luz azul
Cálcio: luz laranja
Incandescência + luminescência
Pulseiras de Neon: Formada por um bastão de vidro
contendo água oxigenada em seu interior que ao ser
quebrado, mistura com um corante que é oxidado
produzindo luz colorida. Esse vidro é revestido por plástico
Quimiluminescência
QUIMILUMINESCÊNCIA: Reação quimiluminescente do luminol
Reação quimiluminescente do luminol em meio alcalino na
presença de ferro e água oxigenada (H2O2) forma o 3-
aminoftalato no estado excitado que libera energia na forma de
luz.
*
Excitado
+ LUZ
FLUORESCÊNCIA DO LUMINOL
Fluoresceína: 1) isotiocianato de fluoresceína é usado para
marcar moléculas e monitorar células, proteínas e anticorpos-
por microscopia de fluorescência.
2) Usada em placas de sinalização em rodovias.
3) Usado como ferramenta na área de oftalmologia como
colírio.
Fluorescência
Olho saudável Olho lesionado
EOSINA – DERIVADO DA FLUORESCEÍNCA
1) Usado como corante em
cosméticos, tintas e papéis.
2) Análises clínicas -
Corante de leucócitos no
sangue.
- O QUE É?
- QUAL SUA IMPORTÂNCIA NA CIÊNCIA ?
- QUAL SUA IMPORTÂNCIA NA ANÁLISE QUÍMICA?
APLICAÇÕES
RECORDANDO A FLUORESCÊNCIA
Vamos recordar como ocorre a absorção 
de luz e excitação das moléculas
Fonte 
de luz
Colimador Prisma
Monocromador 
(seleciona o 
comprimento 
de onda) 
Amostra 
da solução
Detector
En
er
gi
a
e- e-
e-
e-
n 
n s s s
 
Antiligante s
Antiligante 
Não ligante n
Ligante 
Ligante s
LUZ
ABSORÇÃO DE LUZ
AZUL DE BROMOTIMOL: um corante ácido-base
S0
S*
Estado singlete excitado
En
e
rg
ia
Estado singlete fundamental
ABSORÇÃO DE LUZ LEVA A MOLÉCULA PARA UM NÍVEL DE 
ENERGIA MAIS ALTO
ESTADO EXCITADO
calor
hn
Fluorescência (F)
As estruturas 
e as cores 
emitidas
Absorção e 
Emissão de luz em 
comprimentos de 
ondas diferentes
Lembrando....
Fluorescência rodamina, 
quinino e fluoresceína
S0
S*
Estado Singlete excitado
Fluorescência (F)
hn
En
e
rg
ia
Estado singlete fundamental
T* Estado 
Triplete
Fosforescência (P)
Recordando a fotoluminescência de forma RESUMIDA
Absorção (hn): 10 -15 a 10 -14 s
Fluorescência : 10 -9 a 10 -7 s
Fosforescência : 10 -4 a 100 s
Fluorescência é a que tem maior
relevância analítica
Singlete e triplete:
Indica a multiplicidade de cada um dos estados excitados
Singlete (S)
Fluorescência
Singlete: M= 2 (-½ + ½) + 1 = 1
Multiplicidade (M) = 2S + 1 , 
onde S é a soma do spin de cada um dos elétrons
Triplete (T)
Fosforescência
Triplete: M= 2 (½ + ½) + 1 = 3
Energia vibracional: comprimento de onda na região do infravermelho
Energia rotacional: comprimento de onda na região do microondas
Níveis energia 
rotacional
Níveis energia 
vibracional
EN
ER
G
IA
ALEXANDER JABLONSKI
S2
T1
S1
S0
Luz Luz F
P
CI
CIS
Calor
(CI) Calor
(CI)
T1
DIAGRAMA DE JABLONSKI: Estados energéticos de uma molécula e suas transições
CI= Conversão interna
CIS= Cruzamento Intersistema
S0
S2
*
S1
*
EN
ER
G
IA
F= Fluorescência
P= Fosforescência
A= Absorbância (Exc) E = hc/
A molécula pode voltar para o estado
fundamental por meio de uma combinação de
vários processos de desativação:
Processos radiativos:
• Fluorescência
• Fosforescência
Processos não-radiativos:
• Relaxação vibracional
• Conversão interna
• Cruzamento intersistema
Aplicações biológicas e importância em análises (sangue,
Fármaco, alimentos)
Transição Processo
Constante de 
velocidade
Tempo (s)
S0 -> S1 ou S2 ou Sn
Absorção
(Excitação)
Instantânea 10-15
Sn -> S1 Conversão Interna kci 10
-14 - 10-10
S1 -> S1
Relaxação
Vibracional
krv 10
-12 - 10-10
S1 -> S0 Fluorescência kf 10
-9 - 10-7
S1 -> T1
Cruzamento 
Intersistema
kcis 10
-10 - 10-8
T1 -> S0 Fosforescência kp 10
-4 - 100
Escala de tempo dos processos envolvidos na Fluorescência e 
Fosforescência
O Tempo de Vida (τ) do estado excitado é definido o como o tempo médio que uma molécula
permanece no estado excitado antes de retornar ao estado fundamental.
Processos de desativação do estado excitado
Relaxação vibracional: energia vibracional em excesso é perdida imediatamente pelas colisões entre a
molécula excitada e o solvente.
Conversão interna: é processo de desativação pelo qual a molécula excitada passa para “outro” estado
eletrônico de menor energia sem emissão de radiação. A conversão interna parece ser mais eficiente
quando os dois níveis eletrônicos envolvidos estão próximos o suficiente para que haja uma superposição
de níveis de energia vibracionais,
Cruzamento intersistema: é um processo no qual o spin de um elétron excitado é invertido resultando
uma mudança na multiplicidade da molécula. Da mesma forma que na conversão interna, a
probabilidade desse tipo de transição é aumentada se os níveis vibracionais dos dois estados se
interpenetram.
Na transição singlete/triplete (S1 -> T1) indicada no Diagrama de Jablonski o estado vibracional inferior do
singlete se superpõe a um dos níveis vibracionais superiores do triplete, aumentando a probabilidade de
uma mudança no estado do spin. O cruzamento interssistema é mais comum em moléculas que contêm
átomos pesados, como iodo ou bromo (efeito do átomo pesado). A presença de espécies
paramagnéticas, tal como o oxigênio molecular, na solução também facilita o cruzamento interssistema e
um consequente decréscimo da fluorescência.
Conversão externa, ou supressão (ou extinção por colisão): ocorre a interação e transferência de energia
entre a molécula excitada e o solvente ou outros solutos no meio. A ocorrência de conversão externa
pode ser indicada quando há marcante efeito de solvente na intensidade de fluorescência. As condições
que tendem a reduzir o número de colisões entre partículas (baixa temperatura e alta viscosidade)
geralmente aumentam a fluorescência.
Mas os detalhes dos processos de conversão externa também não são bem-compreendidos!
Associando transições eletrônicas espectros de absorção e emissão
, nm
Luz Luz F
P
CI
CIS
Calor
Calor
T1
DIAGRAMA DE JABLONSKI
S0
S2
*
S1
*
EN
ER
G
IA
E = hc/
1
2
Espectro de absorção do quinino
Comprimento de onda máximo de absorção = 350 nm
USADO NA EXCITAÇÃO DESTA 
MOLÉCULA
ESCOLHENDO O EXCITAÇÃO
1) Fazer a varredura de um espectro de absorção
Espectros de excitação e 
emissão do quinino
exc = 320 nm ou 350 nm
em = 460 nm
Independente do exc, a 
emissão ocorrerá no 
mesmo em
320 
350 
Excitação Emissão
In
te
n
si
d
ad
e
 d
e
 E
m
is
sã
o
 R
e
la
ti
va
200 250 300 350 400 450 500 550 600
Comprimento de onda, nm
FLUORESCEÍNA
485 nm
EXC = 460 nm
460 nm
EXC = 485 nm
470 nm
375 nm
280 nm
Comparação do espectros
de emissão da fluoresceína
excitada em: 280, 375 e
470 nm
Deslocamento de Stokes: Distância entre o
comprimento de onda de excitação e
emissão
Grande deslocamento de Stokes:
moléculas com fluorescência
facilmentedetectável
Pequeno deslocamento de Stokes:
moléculas com fluorescência de difícil
detecção
Deslocamento de Stokes= mínimo de 30 nm
Excitação e Emissão
ANTRACENO
QUAIS MOLÉCULAS TÊM A PROPRIEDADE DE 
EMITIR LUZ NA FORMA DE FUORESCÊNCIA?
Fluoresceína Rodamina
Cloroquina
(antimalárico) Laranjado de acridina
• Fluorescência advém principalmente de transições  - *
• Moléculas planares aumentam a conjugação entre o sistema de 
elétrons 
• Moléculas com estruturas rígidas com menor liberdade vibracional-
tem menor cruzamento intersistema e maior fluorescência
Como avaliar a 
capacidade de 
uma molécula 
emitir luz?
Rendimento quântico de fluorescência:
é a razão do número de moléculas que emitem luz pelo número
total de moléculas excitadas.
Rendimento quântico (F) = 
�ú���� �� ���é����� ��� ����������
�ú���� �� ���é����� ���������
0 < F 1 Quanto maior a fluorescência de uma molécula, 
mais próximo de 1 é o valor de F.
Rendimento quântico (F) = 
�� 
�� 
��
�� 
�� 
��
� f�
A = absorbância; F = fluorescência, n = índice de refração
Podemos determinar o rendimento quântico (F)
experimentalmente usando uma molécula padrão 
como referência
COMO É MEDIDA 
A 
FLUORESCÊNCIA?
RECORDANDO: PRIMEIRO-COMO É MEDIDA A 
ABSORÇÃO DE LUZ
ESPECTROFOTÔMETRO
FONTE:
Lâmpada de Xenônio
200-900 nm
Filtro de excitação
Filtro de emissão
Detector
Fluorescência
Amostra na cubeta
Fluorescência
FLUORÍMETRO
LUZ TRANSMITIDA
ESQUEMA DO ESPECTROFLUORÍMETRO CORRIGIDO
Filtro ou 
monocromador 
de excitação
Fotomultiplicadora 
da amostra
Fotomultiplicadora 
da referência
Amplificador 
diferencial
Detector para 
leitura
Filtro ou 
monocroma-
dor de emissão
Atenuador de
feixe
Radiação espalhada de luz
FONTE Amostra
Fenda
CUBETAS
Fatores que afetam a fluorescência
• Estrutura molecular 
Grupos substituintes, conjugação e rigidez 
• Propriedades físicas e químicas
Concentração, pH, tipo de solvente,
viscosidade, temperatura
Padrões para medir rendimento 
quântico de fluorescência
Composto Nome  emissão, nm
Intensidade relativa 
de emissão
Benzeno 270 - 310 10
Fenol 285 – 365 18
Clorobenzeno 275- 345 7
Iodobenzeno --- 0
Benzonitrila 280 - 360 20
Substituição em anéis aromáticos afeta a intensidade de fluorescência e os
comprimentos de onda de excitação e emissão
Amplificam a fluorescência:
hidroxi (-OH), metoxi (-OR), amino (-NR2), 
cianeto (-CN) e sulfônico (-SO3H) 
Favorecem o cruzamento intersistemas, e por 
conseqüência diminuem a fluorescência:
grupos cetônicos (-C=O), 
carboxílicos (-COOH) e halogênios (-X)
GRUPOS SUBSTITUINTES
Piridina Furano Tiofeno Pirrol
Quinolina Indol
Estruturas aromáticas condensadas
Apresentam alto grau de emissão de luz
Heterocíclicos não-
condensados: não fluorescem
Heterocíclicos condensados: 
fluorescem
Rigidez da estrutura molecular favorece a fluorescência
• Diminui a velocidade de relaxação não-radiativa
Bifenil
F = 0,2
Fluoreno
F  1,0
8-hidroxiquinolina
Não-fluorescente
Zn-8-hidroxiquinolina
Fluorescente
Rendimento quântico e rigidez molecular
Nome Estrutura F Característica
Naftaleno 0,20 , rígido
Antraceno 0,36 , rígido
Pireno 0,70 , flexível
Estlibeno 0,05 n, flexível
Difenilcetona < 0,0001 n, flexível
OUTROS FATORES QUE AFETAM A FLUORESCÊNCIA
Temperatura: o aumento da temperatura leva à um
aumento da energia cinética com consequente aumento
no número de colisões. Isso aumenta a probabilidade de
relaxação colisional, ou seja, de conversão interna,
diminuindo a fluorescência.
Temperatura
Solvente
pH
Temperatura Colisões
Viscosidade: O aumento da viscosidade diminui a probabilidade de relaxação colisional,
ou seja, de conversão interna, aumentando a fluorescência. Diminui, também, colisões
bimoleculares que desativam o estado excitado.
Polaridade: Afeta a energia do extado excitado. As moléculas do solvente se reorientam
em torno da molécula fluorescente logo após ela ser promovida para o estado excitado e
antes do retorno para o estado fundamental.
Solvente: viscosidade, polaridade e caráter prótico podem afetar
significantemente a luminescência
• Moléculas com transições - : são mais polares no estado excitado e tem caráter
mais básico que no fundamental. Assim, o aumento de polaridade ou do caráter prótico,
diminui a energia do estado excitado, desloca para comprimentos de onda maiores,
podedo diminuir a fluorescência.
• Moléculas com transições n- : picos relativos à esta transição são geralmente
deslocados para o azul com o aumento da polaridade do solvente. O deslocamento para
azul vem do aumento da solvatação de par de elétrons não-ligado que diminui a
energia do orbital n. Um deslocamento mais dramático ocorre quando o solvente é água
ou metanol que fazem pontes de hidrogênio com o par de elétrons não-ligado. Quando
a transição eletrônica n-> pi* ocorre, o elétron que fica do par não-ligado não consegue
manter a ligação de hidrogênio. Assim, a energia do estado excitado de n>>pi* não é
afetada por este tipo de solvente.
POLARIDADE
A fluorescência de compostos aromáticos com funções ácido/base
são fortemente dependentes do pH. Ex. Anilina/anilínio.
O pH do solvente determina o estado de ionização de cromóforos
ionizáveis (protonação e desprotonação pelo H+).
Formas de ressonância da anilina básica
Maior estabilidade do primeiro estado excitado
Fluorescente
Íon anilínio
Não - fluorescente
pH
Potência da emissão de fluorescência (F) é proporcional à
potência do feixe de excitação que é absorvido pelo sistema
I0 Ib
Concentração
F = emissão de fluorescência
I0 = potência do feixe incidente
I = potência após ter percorrido um comprimento b do meio
K’ = constante que depende da eficiência quântica da fluorescência
F= K’ (I0 - I) (1)
I= I0(10
–εbC) (2)
F= K’ (I0 - I010 
–εbC)
(3) (4)
F= K’ I0(1 - 10 
–εbC)
Substituindo (2) em (1): 
Lei de beer I/I0 = 10
-εbC
A série de Mc Laurin pode ser usada para resolver o termo
exponencial
F= K’ I0(1 - 10 
–εbC)
ε.b.c = A < 0,05: 2,303 ε.b.c é muito maior que os outros termos
F= K’ I0(2,303.εbC) F= K C
Constante
F= K’ I0 [2.303 εbC – (2.303 εbC)
2 + (2.303 εbC)3 + (2.303 εbC)4 + ...(2.303 εbC)n
2! 3! 4! n!
(4)
• A fluorescência é diretamente proporcional à concentração da espécie
fluorescente, desde que em baixas concentrações (Absorbância < 0,05)
100 200 300 400
100
200
300
400
 Fluorescência
 Linear Fit of Fluorescência
F
lu
o
re
sc
ên
ci
a 
/ 
u
.a
Concentração de Sulfato de Quinino /nM
Equation y = a + b*x
Adj. R-Square 0.99712
Value Standard Erro
Fluorescência Intercept 75.2682 5.19893
Fluorescência Slope 0.78634 0.02114
Curva Analítica - Sulfato de Quinino
Desvios da linearidade em altas concentrações:
DilúidoConcentrado
ALGUMAS APLICAÇÕES
Imunoensaios
Excitação Emissão Y Anticorpo imobilizado
Antígeno
ELISA –
Enzyme-linked
immunosorbent
assay
DETECÇÃO
ANÁLISE DE AMOSTRAS DESCONHECIDAS
Fluorescência
Amostra desconhecida
“X”
Fluorescência
50 nM 400 nM300 nM100 nM 200 nM
•Potencial Antialérgico
Leitor de fluorescência
Anti-DNP-IgE
Adição de 
bioativo
Antígeno
(DNP-BSA)
β-hex
Estimulo 
com antígeno
Adição de 
substrato
Sensibilização 
com anticorpo
Mastócitos
FcεRI
EXEMPLO: Processos de sinalização celular
Estudo do mecanismos de ação de fármacos
 Liberação de espécies reativas de oxigênio (EROS)
 Aumento da concentração de Ca2+ intracelular
 Liberação de mediadores químicos
Células estimuladas 
por antígeno
ALERGIA
CONTROLE (Tampão) CÉLULAS ESTIMULADAS
LIBERAÇÃO DE ESPÉCIES REATIVAS DE OXIGÊNIO
2’,7’-diclorodihidrofluorescin diacetate
2’,7’-diclorodihidrofluorescin 
Oxidação
0,1 ug/ mL de antígenoTampão
Fluorescência verde
MASTÓCITOS
AUMENTO DA CONCENTRAÇÃO DE Ca2+ INTRACELULAR
Não-fluorescente
Mastócitos sensibilizados com IgE e 
estimulados com antígeno
Fluorescente
Quela o Ca2+
Fluo-4
Ca2+
Ca2+
RESUMO: Aplicações da 
Fluorescência
• Análises quantitativas de fármacos– controle de qualidade
• Ensaios bioquímicos em laboratorios de análises clínicas
• Localização subcelular - mecanismos
• Sítios de ligação de proteínas – sinalização celular
• Interações moleculares com membranas
• Atividade enzimática
• Distâncias intra/intermoleculares
Vantagens da Fluorescência
1) Sensibilidade: Frequentemente de uma a três ordens de
grandeza mais sensível do que aquela apresentada pela
absorbância.
2) Grande alcance linear na variação da concentração que são
significativamente maiores do que aqueles encontrados na
espectroscopia de absorção.
3) Seletividade dos procedimentos de fluorescência é maior do
que aqueles apresentados pelo método de absorção.
4) Número limitado de sistemas químicos produzem a
fluorescência
1. Descreva os fenômenos físicos envolvidos das técnicas analíticas: fluorescência e absorção 
molecular.
2. Existem cubetas de quartzo e de vidro com diversos caminhos ópticos. De qual material deve ser
uma cubeta para uma análise a ser realizada em 300 nm? Justifique.
3. A cubeta para medidas de fluorescência é diferente da cubeta para medidas de absorção molecular
para uma mesma região do espectro eletromagnético. Qual é essa diferença?
4. Justifique o fato de você conseguir observar um evento de fosforescência, mas não um evento de
fluorescência.
5. Por que a espectrofluorimetria apresenta, geralmente, maior sensibilidade que as técnicas
espectrofotométricas baseadas no fenômeno de absorção molecular?
6. Sob quais condições a intensidade de fluorescência é proporcional à concentração?
7. Faça um diagrama de blocos para descrever um espectrofluorímetro. Nomeie seus componentes.
Exercícios